2 141例孕婦陰道和直腸B族鏈球菌的定植率、血清型及生物膜形成能力

梁正，聶署萍

中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗科，廣東深圳518033

B族鏈球菌（GBS）是一種條件致病菌，常定植于人體下消化道或泌尿生殖道，孕婦GBS定植率為10%～30%［1］。母體泌尿生殖道和胃腸道GBS定植是新生兒早發(fā)型GBS感染的主要危險因素，大約50%的GBS定植孕婦會在分娩期間將細菌垂直傳播給新生兒。新生兒早發(fā)型GBS感染可引起膿毒血癥、腦膜炎等嚴重疾?。?-3］。對妊娠35～37周孕婦進行GBS篩查并對GBS陽性孕婦分娩前給予抗生素治療是目前新生兒早發(fā)型GBS感染的重要預(yù)防策略［4-5］。此外，由于母體IgG抗體能夠透過胎盤給胎兒提供免疫保護，因此孕婦接種GBS疫苗也是預(yù)防新生兒GBS感染的重要措施，GBS表面的莢膜多糖抗原是目前疫苗研發(fā)的主要靶點之一［6］。根據(jù)莢膜多糖抗原成分將GBS分為10種血清型（Ⅰa、Ⅰb及Ⅱ～Ⅸ型），不同國家和地區(qū)間GBS血清型分布有明顯差異。了解本地區(qū)圍生期孕婦GBS定植率和血清型分布，有利于制定合理有效的預(yù)防措施。生物膜是細菌為了適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種存在形式，生物膜狀態(tài)下的細菌對抗菌藥物的抗性和對宿主免疫系統(tǒng)的逃避能力顯著增強，有利于細菌在宿主體內(nèi)持續(xù)定植和擴散。GBS具有形成生物膜的能力［7］，了解孕婦陰道和直腸定植GBS菌株的生物膜形成情況，可為預(yù)防及治療GBS感染提供新方向。本研究通過采集行GBS產(chǎn)前篩查孕婦的陰道和直腸拭子檢查，分析GBS定植率、血清型及生物膜形成能力，旨在為臨床GBS感染性疾病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2022-063-01），通過實驗室信息系統(tǒng)查詢2021年8月—2022年7月在中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院產(chǎn)科門診行GBS產(chǎn)前篩查的2 141例妊娠35～57周孕婦電子病例，獲取相關(guān)臨床資料及標本資料。

1.2 GBS培養(yǎng)與鑒定 采集陰道下段1/3處及肛門直腸處拭子標本送檢。將采集的直腸及陰道拭子接種于顯色培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，35 ℃孵育24 h。挑取顯色培養(yǎng)基上的紫紅色菌落，用全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2-Compact（法國Biomerieux）進行菌種鑒定。

1.3 GBS血清分型檢測 隨機選取分離的67株GBS，使用細菌基因組抽提試劑盒抽提菌株DNA，采用多重PCR方法檢測其莢膜血清型。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠120 V電泳120 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4 GBS生物膜形成能力觀察 取上述已進行血清分型的67株GBS，采用流加培養(yǎng)模式進行生物膜形成試驗。挑取單個菌落，用THB培養(yǎng)基（pH=7.8）+1%葡萄糖培養(yǎng)基配制成終濃度為1.5×107CFU/mL的菌懸液。將配好的菌懸液以200 μL/孔加入無菌96孔聚苯乙烯板中，密封后置于37 ℃搖床中孵育8 h。用PBS洗去浮游的細菌，加入200 μL新鮮培養(yǎng)基，重新密封后，置搖床中繼續(xù)孵育5 h。棄去上清，用PBS洗3次，室溫干燥30 min。采用結(jié)晶紫染色法評估生物膜形成的量。以陰性孔的平均OD值0.16為截斷值，將GBS菌株分為強生物膜（OD595＞0.84）、中度生物膜（0.32＜OD595≤0.84）、弱生物膜（0.16＜OD595≤0.32）、非生物膜（OD595≤0.16）。每塊96孔板分別設(shè)3個空白對照孔（未加培養(yǎng)基及細菌）和3個陰性對照孔（只加培養(yǎng)基），每株細菌設(shè)3個復(fù)孔，試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗及Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸和陰道GBS定植率比較 2 141例圍生期孕婦中，陰道拭子檢出GBS 232株，定植率為10.84%。直腸拭子檢出301株，定植率為14.06%；陰道、直腸拭子聯(lián)合共檢出GBS 349株，總定植率為16.30%。直腸GBS定植率高于陰道（P＜0.01）。

2.2 GBS血清學(xué)分型結(jié)果 67株GBS共檢出5種血清型，其中Ⅰa型9株（來源于直腸5株、陰道4株），Ⅰb型9株（來源于直腸4株、陰道5株），Ⅱ型1株（來源于直腸），Ⅲ型22株（來源于直腸15株、陰道7株），Ⅴ型26株（來源于直腸14株、陰道12株）。直腸和陰道定植的GBS血清型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。部分菌株莢膜血清型多重PCR結(jié)果見圖1。

圖1 部分菌株莢膜血清分型電泳圖

2.3 GBS生物膜形成能力檢測結(jié)果 67株GBS中，形成強生物膜11株，中等強度生物膜26株，弱生物膜30株。

2.4 不同血清型和部位來源GBS生物膜形成能力比較 5種血清型GBS生物膜形成能力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。直腸GBS生物膜形成能力較陰道GBS增強（P＜0.01），見表2。

表1 不同血清型GBS生物膜形成能力比較（株）

表2 不同部位來源GBS生物膜形成能力比較（株）

3 討論

圍生期孕婦GBS定植率、血清型分布與種族、地域以及社會經(jīng)濟狀況相關(guān)，了解本地區(qū)的定植率和血清型分布情況對合理制定GBS感染的預(yù)防措施有重要意義。據(jù)報道，全球孕婦GBS定植率約15%，以加勒比海地區(qū)最高為34%，最低的為美拉尼西亞地區(qū)，僅2%；歐洲、北美洲以及澳大利亞等地區(qū)定植率相似，為18%，南非地區(qū)的定植率為25%，西非地區(qū)為14%，南亞及東南亞地區(qū)為10%［1］。我國不同地區(qū)圍生期孕婦GBS定植率也存在明顯差異，江蘇地區(qū)為8.7%，北京地區(qū)為7.1%，青島地區(qū)為10.6%［8-10］。本研究中2 141例圍生期孕婦GBS定植率為16.3%，明顯高于文獻報道。這種差異可能與研究時間、采樣部位、采樣方法的不同有關(guān)，因此需要進行連續(xù)監(jiān)測。

既往研究顯示，全球孕婦直腸、陰道定植的GBS血清型均以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型為主，占總體血清型的98%；但是不同地區(qū)主要流行的GBS血清型存在差異，如Ⅲ型占全球總體流行血清型的25%，但在中美洲、東南亞等地區(qū)僅占11%［1］。本研究在圍生期孕婦中共檢出Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型5種血清型，直腸和陰道定植的GBS在血清型分布上無統(tǒng)計學(xué)差異，總體以Ⅲ型和Ⅴ型為主，分別占32.8%、38.9%。該結(jié)果與本地區(qū)2018年報道的Ⅲ型占60.7%［11］略有不同，提示GBS流行血清型可隨時間遷移而變化，因此需進行定期監(jiān)測。此外，本地區(qū)的研究結(jié)果與我國其他地區(qū)也有差異，如廈門地區(qū)孕婦定植GBS血清型以Ⅲ型（54.2%）和Ⅰb型（17.7%）為主［12］，青島地區(qū)以Ⅲ型（44.4%）和Ⅰb型（31.5%）為主［10］。了解本地區(qū)流行的流行情況，有助于更好地、有針對性地預(yù)防母嬰GBS感染。

生物膜能夠幫助細菌抵御外環(huán)境的變化，抵抗抗生素的殺傷及逃避宿主免疫，維持細菌在宿主體內(nèi)的持續(xù)定植［13-14］。本研究結(jié)果顯示，不同GBS菌株的生物膜形成能力存在明顯差異，可能是造成GBS在宿主體內(nèi)呈現(xiàn)間歇性、暫時性或持續(xù)性等不同定植狀態(tài)的原因［15］。本研究中孕婦直腸和陰道定植的GBS以中、弱生物膜形成株為主，不同血清型GBS生物膜形成情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而不同部位來源GBS生物膜形成能力存在差異，直腸定植的GBS生物膜形成能力比陰道定植的菌株強，可能是造成GBS在直腸定植率高于陰道的原因。目前國內(nèi)外關(guān)于GBS定植機制的研究少見，下一步我們將重點研究生物膜在宿主GBS定植中的作用。

綜上所述，圍生期孕婦GBS定植率較高，血清型以Ⅲ型和V型為主。定植菌株整體生物膜形成能力較弱，直腸定植的菌株生物膜形成能力強于陰道定植株，可能與直腸定植率高有關(guān)，其具體機制仍有待進一步研究。