黃連素對(duì)高鹽高糖誘發(fā)秀麗隱桿線蟲形態(tài)及壽命改變的干預(yù)作用

徐婋，盧濤，李珂，徐佳寧，劉小愉，杜鵬云，張成崗

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京102488

食鹽和糖在提供能量、維持生命基本活動(dòng)和健康維護(hù)中起重要作用。WHO推薦，成年人每天攝入食鹽不超過5 g、糖不超過25 g。調(diào)查顯示，中國北方地區(qū)居民平均每日食鹽攝入量為11.2 g，南方地區(qū)居民為10.2 g［1］；我國9?。◤V西壯族自治區(qū)、貴州、湖南、湖北、江蘇、河南、山東、遼寧和黑龍江）平均每日糖攝入量為31.3 g［2］，明顯超過WHO推薦量。糖攝入過量會(huì)引發(fā)胰島素抵抗、慢性血管病、腎功能損害以及心血管疾病［3-4］；食鹽攝入過量則是高血壓、心臟病等心血管疾病、脂肪肝、癡呆、慢性腎臟病和中風(fēng)的危險(xiǎn)因素［5-6］。長期高鹽高糖飲食與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，在攝入糖和鹽的過程中，大腦分泌大量阿片類物質(zhì)以及多巴胺，阿片類物質(zhì)與成癮性有關(guān)，多巴胺使人產(chǎn)生愉悅感；并且糖和鹽會(huì)降低乙酰膽堿的釋放，從而降低飽腹感，容易誘發(fā)暴食。肥胖對(duì)人體的呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)都會(huì)產(chǎn)生不良影響，從而縮短人的壽命；對(duì)兒童及青少年來說，肥胖還會(huì)影響生長發(fā)育和心理狀態(tài)。因此，減少人們對(duì)鹽和糖的攝取從而控制肥胖的發(fā)生率勢(shì)在必行。黃連素又稱小檗堿，是我國傳統(tǒng)中藥黃連的主要有效成分，是一種天然的季銨類異喹啉生物堿，目前在臨床上已被廣泛用于與鹽、糖代謝相關(guān)疾病的治療中，在應(yīng)用磺脲類及二甲雙胍等治療2型糖尿病藥物時(shí)添加黃連素可進(jìn)一步提高治療效果［7-8］。線蟲daf-2基因是人胰島素受體蛋白相關(guān)基因的同源基因，daf-16基因?yàn)槠湎掠位颉?022年8月—2023年4月，我們以秀麗線蟲建立高鹽高糖飲食模型，探討黃連素對(duì)高鹽高糖誘導(dǎo)的秀麗線蟲形態(tài)及壽命改變的干預(yù)作用，檢測(cè)其對(duì)線蟲daf-2、daf-16基因表達(dá)的影響，旨在為臨床使用黃連素緩解和糾正人體因高鹽高糖飲食導(dǎo)致的肥胖和壽命縮短提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 野生型N2秀麗隱桿線蟲、大腸桿菌OP50由中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。黃連素為麥克林公司產(chǎn)品。瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），蛋白胨（美國賽默飛公司），氯化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠），葡萄糖—水合物（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），氫氧化鈉溶液（國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心），M9鹽溶液（10×，pH7.4），恒溫生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），體視顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）。

1.2 線蟲的基本培養(yǎng) 將線蟲放置于涂布有大腸桿菌OP50的培養(yǎng)基上，置于20 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3～4 d切膠轉(zhuǎn)板1次，以保證線蟲有足夠的食物和生活空間，同時(shí)注意保持培養(yǎng)基潔凈。實(shí)驗(yàn)開始前將線蟲進(jìn)行同步化處理，培養(yǎng)至L1期（相當(dāng)于人類3歲）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 高鹽和高糖培養(yǎng)基的配制 高鹽培養(yǎng)基：正常線蟲NGM培養(yǎng)基中氯化鈉濃度為0.3%，根據(jù)我國居民食鹽攝入超標(biāo)倍數(shù)，設(shè)置氯化鈉濃度為0.7%。向50 mL線蟲NGM培養(yǎng)基中添入0.35 g氯化鈉，配制成氯化鈉濃度為0.7%的培養(yǎng)基。高糖培養(yǎng)基：向50 mL線蟲NGM培養(yǎng)基中加入0.5 g葡萄糖水合物，配制成葡萄糖濃度為1%的培養(yǎng)基［9］。高鹽高糖培養(yǎng)基：向50 mL線蟲NGM培養(yǎng)基中添加0.5 g葡萄糖水合物和0.35 g氯化鈉，配制成葡萄糖含量為1%、氯化鈉含量為0.7%的培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)驗(yàn)組黃連素干預(yù)濃度的確定 以M9鹽溶液為溶劑配制0、1、10、20、50 mg/L黃連素溶液。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)60 mm直徑線蟲NGM培養(yǎng)皿，加入0.2 mL對(duì)應(yīng)濃度的黃連素溶液，培養(yǎng)10 d，計(jì)算總存活率。結(jié)果顯示，與0 mg/L黃連素比較，1、10、20 mg/L黃連素干預(yù)下的線蟲總存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，50 mg/L黃連素干預(yù)下的線蟲總存活率降低，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇黃連素濃度10 mg/L和20 mg/L。

1.5 線蟲分組與干預(yù)方法 將線蟲分為正常對(duì)照組、高鹽組、高糖組、高鹽高糖組。正常對(duì)照組加入線蟲NGM培養(yǎng)基；高鹽組、高糖組、高鹽高糖組下設(shè)模型對(duì)照組、10 mg/L黃連素干預(yù)組、20 mg/L黃連素干預(yù)組，先分別加入高鹽培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基、高鹽高糖培養(yǎng)基，然后向黃連素干預(yù)組中加入相應(yīng)濃度的黃連素溶液。使用直徑60 mm的培養(yǎng)皿，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 線蟲生長指標(biāo)觀察 于培養(yǎng)第1、3、6天，每組隨機(jī)選取30條線蟲，在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察。使用MShot Image Analysis System顯微測(cè)量軟件截取線蟲圖片，使用Image J圖像處理軟件測(cè)定線蟲體長和體寬（蟲體中部最寬部分），以像素（pixels）作為單位，1 mm=（436.47 ± 0.15）pixels。

1.7 線蟲壽命統(tǒng)計(jì) 每組隨機(jī)選取30條線蟲，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d將線蟲挑至新的培養(yǎng)基，直至線蟲全部死亡。記錄30條線蟲的壽命，取平均數(shù)。

1.8 線蟲daf-2、daf-16 mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR法。培養(yǎng)第6天，每組隨機(jī)選取30只線蟲，加液氮后研磨。采用TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度后，在37 ℃環(huán)境下，逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成cDNA。在85 ℃環(huán)境下滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：daf-2 mRNA上游引物5'-GTTGATAATGCTGCCGAG-3'，下游引物5'-ATCCCGGTCCGATTTCTT-3'；daf-16 mRNA上游引物5'-ATCGTGTGCTCAGAATCC-3'，下游引物：5'-ATGAATAGCTGCCCTCC-3'。擴(kuò)增結(jié)束后計(jì)算擴(kuò)增效率，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每組重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組線蟲不同時(shí)間點(diǎn)體長比較 培養(yǎng)1、3、6 d時(shí)，高鹽組、高糖組以及高鹽高糖組體長與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；添加10、20 mg/L黃連素后，高鹽組、高糖組以及高鹽高糖組體長與對(duì)應(yīng)的未加藥線蟲相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組線蟲培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)體長比較（n=30，pixels，）

表1 各組線蟲培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)體長比較（n=30，pixels，）

組別體長培養(yǎng)1 d 培養(yǎng)3 d 培養(yǎng)6 d高鹽組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照高糖組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照高鹽高糖組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照正常對(duì)照組101.09 ± 2.25 101.95 ± 0.94 101.25 ± 0.99 371.90 ± 1.92 371.34 ± 0.36 371.90 ± 1.92 464.08 ± 1.87 469.07 ± 0.11 516.88 ± 1.94 100.86 ± 1.38 101.19 ± 0.73 102.50 ± 2.17 370.90 ± 0.49 371.01 ± 0.21 390.23 ± 0.81 465.55 ± 1.93 467.18 ± 0.19 519.92 ± 1.21 101.95 ± 2.43 102.34 ± 1.33 102.57 ± 2.97 101.55 ± 0.34 371.74 ± 0.69 371.56 ± 0.36 404.82 ± 1.95 349.91 ± 3.30 468.64 ± 0.71 468.31 ± 0.56 519.73 ± 0.59 435.03 ± 1.85

2.2 各組線蟲不同時(shí)間點(diǎn)體寬比較 培養(yǎng)3、6 d時(shí)高鹽組、高糖組以及高鹽高糖組體寬均較對(duì)照組增加（P均＜0.05）；添加10、20 mg/L黃連素后，高鹽組、高糖組以及高鹽高糖組體寬均較對(duì)應(yīng)的未加藥線蟲減少（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組線蟲培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)體寬比較（n=30，pixels，）

表2 各組線蟲培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)體寬比較（n=30，pixels，）

注：與正常對(duì)照組比較，*P均＜0.05；與同組模型對(duì)照比較，△P均＜0.05。

組別體寬培養(yǎng)1 d 培養(yǎng)3 d 培養(yǎng)6 d 5.22 ± 0.31 5.29 ± 0.20 5.07 ± 0.05 12.54 ± 0.26△12.42 ± 0.23△14.88 ± 0.10*高鹽組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照高糖組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照高鹽高糖組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照正常對(duì)照組17.16 ± 0.21△17.10 ± 0.12△28.00 ± 0.63*5.61 ± 0.40 5.60 ± 0.41 5.64 ± 0.76 12.34 ± 0.34△12.14 ± 0.10△16.00 ± 0.39*17.03 ± 0.19△16.81 ± 0.34△28.71 ± 0.31*19.25 ± 0.13△18.05 ± 0.04△30.42 ± 0.27*16.30 ± 0.15 5.22 ± 0.31 5.82 ± 0.43 5.00 ± 0.82 5.47 ± 0.66 14.83 ± 0.29△13.06 ± 0.05△16.44 ± 0.43*14.08 ± 0.10

2.3 各組線蟲壽命比較 高鹽、高糖、高鹽高糖組壽命均較對(duì)照組縮短（P均＜0.01）；添加10、20 mg/L黃連素后，高鹽組、高糖組以及高鹽高糖組壽命均較對(duì)應(yīng)的未加藥線蟲延長（P均＜0.01）。見表3。

表3 各組線蟲壽命比較（n=30，d，）

表3 各組線蟲壽命比較（n=30，d，）

注：與正常對(duì)照組比較，*P均＜0.01；與同組模型對(duì)照比較，△P均＜0.01。

壽命14.90 ± 0.41△15.77 ± 0.29△10.10 ± 0.08*15.17 ± 0.19△15.53 ± 0.52△9.03 ± 0.09*15.60 ± 0.14△15.77 ± 0.63△7.87 ± 0.24*13.53 ± 0.26組別高鹽組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照高糖組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照高鹽高糖組10 mg/L黃連素20 mg/L黃連素模型對(duì)照正常對(duì)照組

2.4 各組線蟲daf-2、daf-16 mRNA表達(dá)水平比較根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，添加20 mg/L黃連素后，線蟲體寬減小、壽命延長現(xiàn)象較10 mg/L黃連素更為明顯，故在daf-2、daf-16 mRNA表達(dá)水平比較的實(shí)驗(yàn)中選擇黃連素濃度為20 mg/L。與正常對(duì)照組比較，高鹽組、高糖組以及高鹽高糖組daf-2 mRNA表達(dá)水平降低、daf-16 mRNA表達(dá)水平升高；添加黃連素后，與對(duì)應(yīng)的未加藥線蟲相比，daf-2 mRNA表達(dá)水平降低、daf-16 mRNA表達(dá)水平升高（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組線蟲daf-2、daf-16 mRNA表達(dá)水平比較（n=30，）

表4 各組線蟲daf-2、daf-16 mRNA表達(dá)水平比較（n=30，）

注：與正常對(duì)照組比較，*P均＜0.05；與同組模型對(duì)照比較，△P均＜0.05。

daf-2 mRNA daf-16 mRNA 組別高鹽組20 mg/L黃連素模型對(duì)照高糖組20 mg/L黃連素模型對(duì)照高鹽高糖組20 mg/L黃連素模型對(duì)照正常對(duì)照組3.10 ± 0.31△-0.02 ± 0.27*-6.94 ± 0.57△1.72 ± 0.53*2.53 ± 0.22△-2.53 ± 0.25*-6.54 ± 0.47△2.81 ± 0.63*-7.48 ± 0.98△1.37 ± 0.08*0.19 ± 0.82 2.28 ± 0.86△-2.87 ± 0.24*0.73 ± 1.28

3 討論

兒童以及青少年處在生長發(fā)育的關(guān)鍵階段，此階段也極易發(fā)生糖鹽攝入量過高的情況。高鹽高糖飲食直接或通過增加體內(nèi)脂肪含量間接縮短人類壽命。研究顯示，腰圍每增加10 cm，全因死亡風(fēng)險(xiǎn)增加11%［10］。高鹽、高糖飲食可通過上調(diào)分布在腎臟皮質(zhì)近端小管上皮細(xì)胞管腔側(cè)的鈉—葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SGLTs）、降低小腸胰高血糖素樣肽1表達(dá)以及抑制Min6細(xì)胞胰島素分泌功能等多重機(jī)制促進(jìn)葡萄糖和鈉的重吸收，誘發(fā)血糖、血鈉異常，從而導(dǎo)致以代謝性疾病和心血管疾病為主的諸多疾病，對(duì)人類的身體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［11-13］。除心血管疾病和代謝疾病外，高鹽、高糖飲食還可以通過滲透作用誘發(fā)呼吸道疾病、抑制口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖使其喪失抗病能力、影響人體對(duì)鋅的吸收、促使慢性炎癥性疾病惡化以及影響學(xué)習(xí)和記憶能力［14-15］。

中醫(yī)認(rèn)為，五味與五行相對(duì)應(yīng)，五味中同樣存在著相生相克的關(guān)系。對(duì)于咸和甘，中醫(yī)認(rèn)為“苦生甘”“苦克咸”，即苦味可以幫助人體更好地利用糖類物質(zhì)，同時(shí)可以對(duì)抗所食過咸帶來的不良影響?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗分兄赋觥靶粮拾l(fā)散為陽，酸苦涌泄為陰”，意為酸味、苦味屬陰，甘味屬陽。以此理論為依據(jù)，我國中醫(yī)內(nèi)科學(xué)家仝小林院士提出“苦酸制甜法”用以調(diào)節(jié)血糖，治療和緩解2型糖尿病。黃連最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其主要有效成分為黃連素。黃連素目前在臨床上已被廣泛應(yīng)用于與鹽、糖代謝相關(guān)疾病的治療。張振等［16］以不同劑量黃連素與阿托伐他汀治療高血壓合并動(dòng)脈粥樣硬化，結(jié)果顯示，患者血管內(nèi)皮功能和血脂水平均有明顯改善。黃連素在降脂方面具有廣闊的治療前景，王楊等［17］對(duì)肥胖小鼠給予黃連素治療，發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪組織纖維化明顯減輕，毛螺科菌和嗜乳酸桿菌等益生菌增加，表明黃連素在降脂方面具有一定療效，可能改善人群中因高鹽高糖飲食誘發(fā)的肥胖和壽命縮短。

秀麗隱桿線蟲是一種經(jīng)典的模式生物，以大腸桿菌OP50為食，從受精卵發(fā)育為成蟲需3.5 d，生命周期為20 d，具有遺傳背景清楚、個(gè)體結(jié)構(gòu)簡單、生活史短的特點(diǎn)。秀麗線蟲體內(nèi)有12條信號(hào)通路與人類相同，大部分與營養(yǎng)代謝相關(guān)，這為以秀麗線蟲為模型探討相關(guān)藥物的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究以秀麗線蟲為模型，通過向L1期（孵化后14 h，以人類壽命為100年等比例計(jì)算，相當(dāng)于人類3歲）線蟲提供高鹽高糖環(huán)境，連續(xù)觀察6 d（相當(dāng)于人類30歲），探討高鹽高糖對(duì)秀麗線蟲生長發(fā)育的影響以及黃連素的干預(yù)作用。體長既可以代表秀麗線蟲的生長發(fā)育狀況，也可以反映物質(zhì)的毒性，當(dāng)秀麗線蟲暴露于毒性物質(zhì)中，體長會(huì)明顯減少；秀麗線蟲的脂肪主要儲(chǔ)存于腸道及皮下，當(dāng)秀麗線蟲體內(nèi)脂肪含量發(fā)生變化時(shí)其體寬會(huì)隨之發(fā)生較為顯著的改變［18］。本研究結(jié)果顯示，高鹽、高糖以及高鹽高糖組線蟲的體寬均較對(duì)照組增加，壽命均較對(duì)照組縮短；添加黃連素后，高鹽、高糖以及高鹽高糖組線蟲的體寬有所下降，壽命有所延長；并且與10 mg/L黃連素相比較，20 mg/L黃連素作用下產(chǎn)生的差異更為明顯。這表明黃連素可逆轉(zhuǎn)高鹽高糖飲食所致的秀麗線蟲形態(tài)改變與壽命的縮短。

PI3K/AKT/mTOR通路是響應(yīng)胰島素信號(hào)的經(jīng)典通路。食物進(jìn)入小腸后，經(jīng)過消化產(chǎn)生葡萄糖，經(jīng)小腸上皮細(xì)胞吸收后使血糖增高，從而促進(jìn)胰島素釋放，胰島素進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖進(jìn)行吸收和利用。胰島素與細(xì)胞表面胰島素受體底物1結(jié)合后，激活PI3K/AKT通路，AKT直接促進(jìn)葡萄糖吸收。同時(shí)，通過AKT-TSC1/2-RheB-mTORC1通路激活mTORC1活性，mTORC1進(jìn)一步促進(jìn)葡萄糖的利用從而為機(jī)體正?；顒?dòng)提供能量。研究表明，在高糖、高脂環(huán)境培養(yǎng)的大鼠胰島素瘤細(xì)胞中加入黃連素進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞胰島素和胰島素樣生長因子1表達(dá)顯著下降［19］。分析其機(jī)制為黃連素在高糖、高脂環(huán)境抑制胰島素生成，從而減少機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取以及胰島素抵抗的發(fā)生，緩解因葡萄糖堆積轉(zhuǎn)化為脂肪而導(dǎo)致的肥胖。

線蟲daf-2基因是唯一一個(gè)與人胰島素受體蛋白相關(guān)基因同源的基因［20］。daf-2可促使daf-16磷酸化，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。daf-16是胰島素/IGF-1信號(hào)通路中最重要的靶點(diǎn)，其激活可抑制線蟲衰老，延長線蟲壽命［21］。研究顯示，肥胖可通過多種途徑促進(jìn)衰老，而衰老也可促進(jìn)肥胖的發(fā)生和發(fā)展［22］。因此我們?cè)跈C(jī)制探究中著眼于線蟲胰島素同源通路，對(duì)線蟲體內(nèi)daf-2、daf-16 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，添加黃連素后，高鹽、高糖以及高鹽高糖組秀麗線蟲體內(nèi)daf-2 mRNA表達(dá)水平較未添加黃連素線蟲明顯降低，daf-16 mRNA表達(dá)水平較未添加黃連素線蟲明顯提高。據(jù)此推測(cè)，黃連素干預(yù)高鹽高糖飲食誘發(fā)的秀麗線蟲形態(tài)改變以及壽命縮短的作用機(jī)制可能是黃連素抑制了秀麗線蟲daf-2 mRNA表達(dá)以及提高daf-16 mRNA表達(dá)，從而減少線蟲機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取以及胰島素抵抗的發(fā)生，進(jìn)而緩解由于過多葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂肪而導(dǎo)致的脂肪堆積引起的線蟲形態(tài)改變，表現(xiàn)出抑制線蟲衰老、延長線蟲壽命等作用。

綜上所述，高鹽、高糖以及高鹽高糖環(huán)境可誘發(fā)秀麗線蟲體寬增加、壽命縮短；黃連素可以逆轉(zhuǎn)上述變化，其作用機(jī)制與線蟲胰島素同源通路有關(guān)。后續(xù)我們將繼續(xù)深入研究，為黃連素干預(yù)高鹽、高糖以及高鹽高糖等不良飲食嗜好導(dǎo)致的肥胖以及全因死亡風(fēng)險(xiǎn)增加現(xiàn)象提供更多證據(jù)。