亞砷酸鈉對人肝星狀細胞的激活作用及其與鐵死亡的關系

迪麗娜爾·亞爾麥麥提，黃菲，丁關鑫，趙麗君，吳順華

1 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室，烏魯木齊830011；2 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室

肝纖維化是由自身免疫性疾病、代謝性疾病或全身性疾病、病毒、藥物或毒性化學物質損害引起的慢性彌漫性疾?。?］。肝星狀細胞持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。在正常肝臟中，肝星狀細胞處于靜止狀態(tài)；當肝臟受到刺激發(fā)生損傷時，肝星狀細胞被激活，可發(fā)生形態(tài)上的改變，并遷移到損傷部位，同時分泌大量細胞外基質和促炎、促纖維化細胞因子，促進肝纖維化發(fā)生發(fā)展［2］。無機砷為Ⅰ類致癌物，長期攝入無機砷可引起肝纖維化甚至肝癌。研究發(fā)現(xiàn)，在無機砷引起肝纖維化的過程中，活性氧（ROS）水平升高［3］，表明ROS參與了無機砷致肝損傷作用。鐵死亡是鐵依賴性脂質ROS大量堆積引起的新型細胞死亡方式［4］。鐵死亡的本質是谷胱甘肽（GSH）耗竭，谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性下降，不能及時分解脂質ROS，導致脂質ROS大量堆積，從而破壞細胞膜的完整性，導致細胞死亡［5］。研究表明，鐵死亡與肝纖維化、肝癌、肝缺血再灌注損傷等疾病密切相關［6-8］。但鐵死亡是否參與無機砷致肝纖維化的研究鮮有報道。2020年12月—2023年2月，我們通過觀察亞砷酸鈉（NaAsO2）對肝星狀細胞的激活作用，從鐵死亡的角度探討無機砷致肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人肝星狀細胞LX-2（武漢普諾賽生命科技有限公司）。NaAsO2（北京化學試劑三廠），高糖培養(yǎng)基DMEM、PBS、胰酶、胎牛血清（美國Gibco公司），GSH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒、BODIPY 581/591 C11探針（美國Thermo Fisher Scientific公司），總RNA抽提試劑盒（美國Omega Bio-tek公司），PCR逆轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒（日本Takara公司）。倒置顯微鏡（美國LEICA）；CO2培養(yǎng)箱、酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），低溫離心機（美國Sigma公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 取LX-2細胞，加入含12%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換液1次。待細胞融合度達到80%時，加入胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。按1∶3傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組與干預方法 取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板。將細胞隨機分為NaAsO2組和對照組，NaAsO2組分別加入5、10、15 μmol/L NaAsO2，對照組加入DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細胞激活形態(tài)觀察 吸棄各組細胞培養(yǎng)液，收集細胞，PBS清洗；加入1 mL PBS，置于倒置顯微鏡下拍照，觀察細胞形態(tài)。

1.5 細胞GSH檢測 收集各組細胞，加入PBS，超聲破碎細胞并混勻。取0.1 mL細胞懸液置于1.5 mL離心管中，加入100 μL檢測試劑混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清。按試劑盒說明配置空白格、標準管、測定管，從各管吸取0.25 mL反應液于96孔板，輕微震蕩孔板混勻，靜置5 min，于405 nm處酶標儀測定各孔吸光度值。實驗獨立重復3次。GSH含量=［OD（實驗）－OD（空白）］/［OD（標準）－OD（空白）］×C標準×稀釋倍數(shù)/蛋白濃度。

1.6 細胞脂質ROS檢測 收集各組細胞，Hank's平衡鹽溶液清洗。加入500 μL含10 μmol/L BODIPY 581/591 C11分子探針工作液，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗余留的分子探針3次。加入Hoechest 33342探針復染細胞核5 min，吸棄染色液，加入PBS清洗2次。加入500 μL基礎培養(yǎng)基，立即使用共聚焦顯微鏡進行觀察并拍照。藍色熒光表示細胞核；綠色熒光（488 Ex/510 Em）表示細胞脂質氧化性能，即脂質ROS熒光強度；紅色熒光（581 Ex/591 Em）表示細胞抗氧化性能。

1.7 細胞纖維化基因和鐵死亡基因檢測 采用RT-PCR法檢測纖維化基因α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）和鐵死亡基因溶質載體家族7成員11（SLC7A11）、GPX4。收集各組細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物設計由上海生工股份有限公司完成，引物序列見表1。根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明建立反應體系。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 細胞纖維化、鐵死亡及內參基因PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。相關性分析采用Spearman相關法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態(tài)比較 對照組細胞生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)飽和，具有往外延伸的觸角，呈星狀，細胞抱團生長。NaAsO2組加入不同濃度NaAsO2后，細胞數(shù)量顯著下降，同時細胞形態(tài)發(fā)生改變。其中加入5 μmol/L NaAsO2后仍可觀察到往外延伸的觸角，細胞形態(tài)較完整，細胞團間距變大；加入10 μmol/L NaAsO2后細胞觸角開始回縮，細胞數(shù)量顯著減少；加入15 μmol/L NaAsO2后大部分細胞觸角明顯回縮甚至消失，大部分細胞形態(tài)呈圓形且有細胞皺縮和破裂現(xiàn)象，細胞間隙變寬。見OSID碼圖1。

2.2 各組GSH含量比較 對照組、5、10、15 μmol/L NaAsO2組GSH含量分別為20.95 ± 1.60、16.67 ±2.26、14.66 ± 1.43、10.55 ± 1.03。與對照組比較，NaAsO2不同濃度組細胞GSH含量均減少，其中15 μmol/L NaAsO2組GSH含量低于10、5 μmol/L NaAsO2組，10 μmol/L NaAsO2組低于5 μmol/L NaAsO2組（P均＜0.05）。

2.3 各組脂質ROS比較 對照組無明顯綠色熒光，紅色熒光較強；5 μmol/L NaAsO2組可見少量顆粒狀綠色熒光；10 μmol/L NaAsO2組綠色熒光較5 μmol/L組有所增強；15 μmol/L NaAsO2組綠色熒光明顯增強，紅色熒光明顯減弱。見OSID碼圖2。

2.4 各組細胞α-SMA、CollagenⅠ mRNA表達水平比較 與對照組比較，NaAsO2組α-SMA、CollagenⅠmRNA表達水平均升高；其中15 μmol/L NaAsO2組高于10、5 μmol/L NaAsO2組，10 μmol/L NaAsO2組高于5 μmol/L NaAsO2組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組α-SMA、CollagenI mRNA表達水平比較（）

表2 各組α-SMA、CollagenI mRNA表達水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與5 μmol/L NaAsO2組比較，bP＜0.05；與10 μmol/L NaAsO2組比較，cP＜0.05。

α-SMA mRNA CollagenⅠ mRNA 2.13 ± 0.28a 4.52 ± 0.28ab 9.56 ± 0.79abc 1.00 ± 0.04組別NaAsO2組5 μmol/L 10 μmol/L 15 μmol/L對照組2.10 ± 0.20a 3.01 ± 0.14ab 6.48 ± 0.29abc 1.00 ± 0.06

2.5 各組細胞SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平比較 與對照組比較，NaAsO2組SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平均降低；其中，15 μmol/L NaAsO2組SLC7A11 mRNA表達水平低于10、5 μmol/L NaAsO2組，10 μmol/L NaAsO2組SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平低于5 μmol/L NaAsO2組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平比較（）

表3 各組SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與5 μmol/L NaAsO2組比較，bP＜0.05；與10 μmol/L NaAsO2組比較，cP＜0.05。

SLC7A11 mRNA GPX4 mRNA 0.74 ± 0.07a 0.45 ± 0.01ab 0.67 ± 0.04ac 1.00 ± 0.07組別NaAsO2組5 μmol/L 10 μmol/L 15 μmol/L對照組0.52 ± 0.04a 0.27 ± 0.01ab 0.11 ± 0.01abc 1.00 ± 0.04

2.6 細胞鐵死亡基因與肝纖維化基因的相關性α-SMA mRNA與CollagenⅠ mRNA均呈正相關（r分別為0.95，P＜0.01）。α-SMA mRNA與GPX4、SLC7A11 mRNA表達均呈負相關（r分別為-0.72、-0.92，P均＜0.001），CollagenⅠ mRNA與GPX4、SLC7A11 mRNA表達亦呈負相關（r分別為-0.67、-0.90，P均＜0.001）。

3 討論

肝星狀細胞激活是肝臟代謝功能障礙的關鍵因素。在正常肝臟中，肝星狀細胞位于肝細胞的基底外側表面和竇內皮細胞之間的Disse空間中，儲存維生素A并長期處于靜止狀態(tài)。肝星狀細胞通過觸角與內皮細胞直接接觸，與周圍細胞相互作用影響細胞分化、遷移、增殖以及存活等各種細胞功能。當肝臟受到刺激時，導致類維生素A和脂滴的丟失；肝星狀細胞在形態(tài)上從“飽滿”狀變?yōu)楸馄酵庥^，并遷移到肝損傷部位，同時分泌大量ECM和多種促炎和促纖維化細胞因子，促進肝纖維化發(fā)生與發(fā)展［9］。砷是自然界中200多種礦物質的主要成分，巖石及礦物風化和溶解、地熱流體以及火山活動等自然因素以及使用含砷肥料和農(nóng)藥、排放工業(yè)含砷污染水、開采煤炭等人為因素均可引起環(huán)境砷污染，對人類健康產(chǎn)生潛在危害。當砷通過呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)或皮膚進入人體后，可以模仿磷酸鹽、葡萄糖和甘油等礦物質和營養(yǎng)物質的底物，通過營養(yǎng)物質轉運蛋白通道進入細胞內［10］。研究顯示，砷中毒患者肝臟B超檢查可見細密光點，肝回聲增強且不均勻，嚴重者可出現(xiàn)肝硬化、腹水等征象［11］。本研究結果顯示，加入不同濃度NaAsO2后，LX-2細胞數(shù)量顯著減少，同時細胞形態(tài)發(fā)生改變，從星狀逐漸回縮為圓形，細胞間隙逐漸變寬，甚至出現(xiàn)細胞破裂現(xiàn)象，表明Na-AsO2對肝星狀細胞具有毒性作用。

無機砷可導致細胞ROS堆積，打破氧化還原平衡，引起肝臟氧化應激反應。研究表明，細胞線粒體損傷、內質網(wǎng)應激、消耗細胞抗氧化劑均可導致細胞ROS積累，引起肝損傷。GSH是抗氧化應激的關鍵物質，參與ROS清除DNA合成以及信號轉導等多種生物活動，保護細胞膜的作用。當抑制GSH的生物合成或阻斷細胞從外環(huán)境獲取胱氨酸，導致細胞GSH耗竭引起ROS堆積［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，加入不同濃度NaAsO2后，LX-2細胞GSH含量減少，提示NaAsO2致LX-2細胞抗氧化能力下降。

砷致肝損傷過程中ROS水平升高。研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露可引起p53依賴性ROS積累，線粒體膜電位損傷，引起肝細胞凋亡［13］。阻斷細胞內ROS的積累是研究重點與難點。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于無機砷致肺上皮細胞鐵蛋白表達量升高，GPX4表達水平下降并通過線粒體ROS介導內質網(wǎng)膜功能障礙進而誘導鐵死亡引起急性肺損傷［14］。本研究結果顯示，對照組細胞未檢測到顆粒狀脂質ROS熒光，加入不同濃度NaAsO2后，隨著NaAsO2濃度升高，細胞脂質ROS熒光強度逐漸增強。因此NaAsO2引起LX-2細胞GSH減少導致脂質ROS不能及時分解而積累，這可能與細胞膜破壞有關。

SLC7A11作為鐵死亡的重要指標，負責將胱氨酸運輸至細胞內，其被還原為半胱氨酸，用于合成細胞內主要的抗氧化劑GSH。GSH是谷胱甘肽過氧化物酶GPX4的一個必要輔因子，有助于GPX4還原脂質過氧化物為無毒脂質醇，調節(jié)細胞內氧化還原狀態(tài)，發(fā)揮保護細胞膜結構及功能的作用［15］。用含砷中藥雄黃連續(xù)灌胃小鼠28 d造成腎毒性，并伴有鐵蓄積和ROS增加，SLC7A11、GPX4表達水平降低，且雄黃以劑量依賴性的方式引起腎臟組織鐵死亡［16］。本研究結果顯示，與對照組比較，NaAsO2組SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平均降低，其中高濃度組表達水平低于低濃度組，提示NaAsO2可下調LX-2細胞SLC7A11、GPX4 mRNA表達，這可能導致脂質ROS堆積，引起細胞損傷。

當肝臟持續(xù)受到外界刺激時，處于靜態(tài)的肝星狀細胞不斷被激活，促使a-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ等纖維化指標表達，細胞外基質分泌增加，改變肝臟組織結構，引起肝纖維化。吳順華等［17］研究發(fā)現(xiàn)，NaAsO2導致大鼠纖維化指標α-SMA、CollagenⅠ表達量升高，引起大鼠肝星狀細胞激活。李昂等［18］報道，NaAsO2可抑制LX-2細胞增殖，促進α-SMA表達升高。本研究結果顯示，與對照組比較，NaAsO2組α-SMA、CollagenⅠ mRNA表達水平均升高，其中高濃度組表達水平高于低濃度組，提示NaAsO2可上調LX-2細胞纖維化指標，從而引起細胞激活。

為了明確鐵死亡基因與纖維化基因之間的相關性，我們進一步對鐵死亡指標GSLC7A11、GPX4和纖維化指標α-SMA、CollagenⅠ進行相關性分析，結果顯示纖維化指標與鐵死亡指標存在負相關。這提示NaAsO2可能通過調控SLC7A11-GSH-GPX4軸上的鐵死亡相關基因而引起肝星狀細胞纖維化指標表達升高。

綜上所述，NaAsO2可致肝星狀細胞激活，促進其纖維化基因表達；在此過程中，NaAsO2通過下調細胞SLC7A11、GPX4基因表達，引起ROS堆積，促進細胞鐵死亡。因此，靶向鐵死亡可能成為防治砷中毒致肝纖維化的新方向。