益氣養(yǎng)陰活血法對特發(fā)性肺纖維化大鼠血管新生的影響*

陳 煒，張念志，胡夢娟

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的以肺間質(zhì)纖維化改變?yōu)橹鞯穆约不?，臨床發(fā)病率呈增長趨勢。其起病隱匿，病因、病機(jī)尚不明確，目前尚無有效治療方法，病死率高，IPF 確診后平均生存時(shí)間約3～5 年［1］。臨床常見的死亡原因多為IPF 患者生理指標(biāo)的急性惡化、感染、突發(fā)呼吸衰竭、心臟衰竭、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、靜脈血栓栓塞性疾病等［2］。

IPF患者存在廣泛血管新生現(xiàn)象，血管新生是受促血管新生因子和抑制血管新生因子動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控，當(dāng)肺組織受損，該平衡被打破，血管新生［3］。常見的促血管生長因子包括血清低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）；色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）和內(nèi)皮生長抑制素（endostatin，ES）為血管新生抑制因子。當(dāng)促血管生長因子分泌增加，動(dòng)態(tài)平衡失衡，大量血管新生形成，加重肺纖維化；血管新生抑制因子高表達(dá)，則血管新生抑制，從而改善毛細(xì)血管通透性及肺部微循環(huán)，改善缺氧狀態(tài)，抑制IPF 進(jìn)一步發(fā)展［4］。血管新生已成為IPF防治的新靶點(diǎn)。

IPF 屬中醫(yī)“肺痿”范疇。筆者根據(jù)IPF 患者的中醫(yī)證候?qū)W特點(diǎn)，提出“肺失治節(jié)，因虛致瘀”理論。以肺腎氣陰兩虛為本，痰瘀阻滯肺絡(luò)為標(biāo)，故提出益氣養(yǎng)陰活血法。本課題在既往研究的基礎(chǔ)上，探討益氣養(yǎng)陰活血法對IPF 大鼠血管新生相關(guān)因子的影響，明確調(diào)控靶點(diǎn)及其干預(yù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級雄性SD 大鼠128 只，體質(zhì)量（260±20）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（魯）2014-0007。大鼠于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 藥品醋酸潑尼松片劑（浙江仙琚制藥股份有限公司；批號：20180407，規(guī)格：5 mg/片）；參七蟲草方（西洋參15 g，三七10 g，冬蟲夏草3 g）來自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。鹽酸博來霉素（125 mg，invitrogen，批號：1935037）。

1.3 分組、造模及給藥將128 只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、潑尼松組、參七蟲草組，每組32只，每組4 籠大鼠，一籠8 只。采用氣管滴注法造模［5］：10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔內(nèi)注射，將大鼠仰臥固定于鼠板上，剪去頸毛，皮膚消毒。在頸部中間做一長約1 cm切口，分離暴露氣管。用彎眼科鉗稍微抬高氣管，將含有5 mg/mL 的博來霉素（5 mg/kg）注射器針頭經(jīng)兩軟骨環(huán)穿刺進(jìn)氣管快速給藥，將大鼠直立并反復(fù)旋轉(zhuǎn)8～10次。無菌操作縫合表皮?？瞻捉M以同樣方法注射等量生理鹽水造模?？瞻捉M、模型組均灌胃生理鹽水（1 mL/kg·d），潑尼松組灌胃潑尼松混懸液（3.5 mg/kg·d），參七蟲草組灌胃參七蟲草方湯劑（0.38 g/kg·d）。各組大鼠造模后第2天開始給藥，連續(xù)28天。

1.4 取材與標(biāo)本采集分別于造模后第7、14、21、28 天取材。先將大鼠腹腔麻醉，暴露腹腔腹主動(dòng)脈，收集大鼠腹主動(dòng)脈血樣本，靜置2 h，離心半徑10 cm，3000 r/min 離心10 min 收集上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠處死后迅速打開胸腔，分離肺組織，取左肺下葉固定于10%福爾馬林溶液中備用。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 大鼠一般狀態(tài) 觀察大鼠反應(yīng)、呼吸狀態(tài)、毛發(fā)、死亡情況等。

1.5.2 肺組織病理切片及血清HIF-1α、PDGF、PEDF、ES 檢測 病理切片制作：從固定液中取出肺組織，切塊（2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm），再在固定液中固定2 h，后用不同濃度乙醇脫水，脫水后的肺組織分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，透明后浸蠟、包埋、切片，最后展片、貼片。HE 染色：將制備好的切片脫蠟、復(fù)水，然后蘇木精染色，乙醇分化見顏色變淺，漂洗，返藍(lán)，乙醇脫水，伊紅復(fù)染，再次脫水，最后二甲苯透明封片。Masson 染色：將返藍(lán)后的切片（步驟同HE 染色）用麗春紅品紅染色液染色，再亮綠染色、增鮮、脫水、透明封片。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，方差齊采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)空白組大鼠反應(yīng)靈敏，活潑好動(dòng)，呼吸正常，無爪甲紫紺，毛發(fā)光澤。模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，有痰鳴音，口鼻可見大量分泌物，爪甲紫紺，毛發(fā)枯槁，舌質(zhì)紫暗。潑尼松組大鼠及參七蟲草組大鼠反應(yīng)及呼吸狀態(tài)等優(yōu)于模型組，參七蟲草組狀態(tài)更佳。實(shí)驗(yàn)中模型組死亡4只，潑尼松組死亡3只，參七蟲草組死亡2只。

2.2 HE染色結(jié)果造模后第7、14、21、28天空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，模型組大鼠肺泡間隔逐漸增寬，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞逐漸減少，第21 天炎性細(xì)胞較第14天少，第28天幾乎未見炎性細(xì)胞。參七蟲草組、潑尼松組病理改變與模型組相似，但程度較輕，以參七蟲草組程度最輕。見圖1。

圖1 各組各時(shí)間段大鼠肺組織病理學(xué)觀察（HE，×400）

2.3 Masson 染色結(jié)果造模后，空白組大鼠肺泡間隔未見藍(lán)染區(qū)，模型組大鼠肺泡間隔均可見染成藍(lán)色的膠原纖維沉積，顏色逐漸加深，藍(lán)色區(qū)域面積逐漸增大，甚至整個(gè)顯微鏡視野下均為藍(lán)染區(qū)；與模型組相比，潑尼松組、參七蟲草組藍(lán)染區(qū)面積較小，顏色較淺，纖維化程度較輕，參七蟲草組改善最明顯。見圖2。

圖2 各組各時(shí)間段大鼠肺組織病理學(xué)觀察（Masson，×400）

2.4 ELlSA法檢測結(jié)果

2.4.1 大鼠血清HIF-1α表達(dá) 造模后，與空白組比較，模型組、潑尼松組、參七蟲草組HIF-1α含量均增高（P＜0.01）；與模型組比較，相同時(shí)間點(diǎn)潑尼松組與參七蟲草組HIF-1α含量降低（P＜0.01）；潑尼松組與參七蟲草組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清HlF-1α表達(dá)（±s）ng/L

表1 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清HlF-1α表達(dá)（±s）ng/L

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與潑尼松組比較，P＞0.05

組別空白組模型組潑尼松組參七蟲草組第28天18.23±0.64 36.14±0.81*27.81±0.63*△27.05±0.81*△#鼠數(shù)32 28 29 30第7天10.65±0.53 25.41±0.54*23.48±0.75*△22.11±1.28*△#第14天15.57±0.96 30.50±0.34*25.13±1.65*△23.77±0.55*△#第21天17.26±1.85 33.51±0.42*27.19±1.57*△26.16±0.59*△#

2.4.2 大鼠血清PDGF表達(dá) 造模后，不同時(shí)間點(diǎn)與空白組比較，模型組、潑尼松組、參七蟲草組PDGF含量升高（P＜0.01）；與模型組相比，潑尼松組與參七蟲草組PDGF 表達(dá)降低（P＜0.01）；潑尼松組與參七蟲草組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清PDGF表達(dá)（±s）ng/L

表2 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清PDGF表達(dá)（±s）ng/L

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與潑尼松組比較，P＞0.05

組別空白組模型組潑尼松組參七蟲草組第28天13.25±2.69 37.90±5.73*26.06±3.35*△22.98±1.50*△#鼠數(shù)32 28 29 30第7天23.41±2.35 52.32±6.27*37.20±3.75*△34.28±1.72*△#第14天21.86±2.10 40.75±4.27*29.98±3.48*△28.811±1.79*△#第21天15.19±0.13 38.36±5.54*28.03±4.37*△23.98±1.26*△#

2.4.3 大鼠血清PEDF 表達(dá) 造模后，各時(shí)間點(diǎn)，模型組、潑尼松組、參七蟲草組PEDF 含量高于空白組（P＜0.01）；與模型組相比，同時(shí)間點(diǎn)潑尼松組、參七蟲草組PEDF 表達(dá)升高（P＜0.01）；潑尼松組與參七蟲草組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清PEDF表達(dá)（±s）ng/L

表3 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清PEDF表達(dá)（±s）ng/L

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與潑尼松組比較，P＞0.05

組別空白組模型組潑尼松組參七蟲草組第28天25.69±3.17 35.59±2.06*81.72±8.60*△90.77±11.61*△#鼠數(shù)32 28 29 30第7天22.56±3.37 59.06±9.55*94.61±11.31*△105.20±9.62*△#第14天23.75±1.47 57.10±8.81*91.29±11.92*△102.92±9.23*△#第21天24.58±2.01 48.89±4.82*89.15±5.94*△98.00±8.45*△#

2.4.4 大鼠血清ES 表達(dá) 造模后，各時(shí)間點(diǎn)，與空白組比較，模型組、潑尼松組、參七蟲草組ES含量上升（P＜0.01）；與模型組比較，同時(shí)間點(diǎn)潑尼松組、參七蟲草組ES 表達(dá)升高（P＜0.01）；潑尼松組與參七蟲草組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清ES表達(dá)（±s） μg/L

表4 各組大鼠干預(yù)第7、14、21、28天血清ES表達(dá)（±s） μg/L

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與潑尼松組比較，P＞0.05

組別空白組模型組潑尼松組參七蟲草組第28天84.63±5.82 121.07±10.26*151.49±12.63*△161.38±11.78*△#鼠數(shù)32 28 29 30第7天75.94±4.88 136.84±11.81*174.12±10.40*△180.98±11.67*△#第14天81.05±6.99 133.98±11.07*168.14±15.99*△174.19±13.51*△#第21天82.18±6.88 129.23±9.80*160.08±14.83*△169.43±22.44*△#

3 討論

肺泡上皮損傷與修復(fù)是IPF 發(fā)展過程中的重要組織病理改變。血管新生是機(jī)體愈合的重要組成部分，是肺組織廣泛受損后機(jī)體修復(fù)的最初環(huán)節(jié)，而異常血管新生是肺部組織形成肺纖維化的重要驅(qū)動(dòng)力。研究發(fā)現(xiàn)，IPF 中微纖維化區(qū)毛細(xì)血管的密集程度較嚴(yán)重纖維化區(qū)域程度高，成纖維細(xì)胞中無血管組織分布，表明IPF 早期血管新生程度較高，如果在肺部組織受損的早期能阻斷異常血管新生，或許能夠減輕肺纖維化發(fā)展，可為治療IPF提供新理念［5］。

HIF-1α是機(jī)體調(diào)節(jié)氧平衡重要的氧敏感因子，其與正常細(xì)胞代謝、增殖、分化關(guān)系密切，也與炎癥反應(yīng)、血管新生密切相連［6］。肺纖維化過程中主要的病理特點(diǎn)是機(jī)體缺氧，而HIF-1α是調(diào)控機(jī)體氧缺乏應(yīng)激的“開關(guān)”，當(dāng)機(jī)體血氧飽和度降低時(shí)，HIF-1α高分泌，導(dǎo)致下游VEGF高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致血管生成因子表達(dá)增加，新血管形成，促進(jìn)肺纖維化［7］。PDGF 是一種潛在轉(zhuǎn)化生長因子，能使多種間質(zhì)細(xì)胞增殖與趨化，通過促使這些細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生。在機(jī)體修復(fù)過程中，因肺組織上皮細(xì)胞受損，缺血、缺氧，PDGF 高表達(dá)，促使損傷的肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量VEGF，促進(jìn)組織再血管化［8］。

PEDF 是一種血管新生抑制因子，研究發(fā)現(xiàn)在人和動(dòng)物的成纖維化細(xì)胞中可見PEDF 高表達(dá)，同時(shí)伴有VEGF 表達(dá)降低［9］。ES 是廣泛存在于血管外周基底膜的血管生成抑制劑，通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而抑制新生血管形成［10］。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，肺損傷患者肺泡灌洗液中ES表達(dá)水平升高，提示ES參與損傷肺組織的修復(fù)過程［11］。

IPF 多歸于中醫(yī)“肺痿”范疇，肺主治節(jié)，治理調(diào)節(jié)全身氣、血、津液及臟腑生理功能［12-13］。IPF為肺臟慢性虛損疾患，病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，本虛責(zé)之于肺氣虛，肺失治節(jié)則氣不化津且失于輸布，痰濁內(nèi)生，痹阻肺絡(luò)；然肺為氣之主，腎為氣之根，腎主攝納，乃為水臟，久則母病及子，由肺及腎，且肺腎乃金水滋生之臟，病久必然傷及腎陰，耗損腎氣，導(dǎo)致肺腎氣陰兩虛。標(biāo)實(shí)責(zé)之于瘀血內(nèi)阻。肺主氣，朝百脈而主治節(jié)，現(xiàn)肺氣虛，肺失治節(jié)，一則運(yùn)血無力，另則化津不足，陰虛津虧，血脈失養(yǎng)，脈絡(luò)不暢，則滯而留瘀，痹阻肺絡(luò)。虛瘀互結(jié)，日久肺臟虛損，津氣耗傷，失卻濡潤以致肺葉枯萎?？傊?，肺腎氣陰兩虛是本病產(chǎn)生的內(nèi)在基礎(chǔ)，而肺失治節(jié)，因虛致實(shí)，瘀血阻滯肺絡(luò)是其主要病理因素［14］。院內(nèi)制劑參七蟲草膠囊以益氣養(yǎng)陰活血立法，其中西洋參為君，益氣養(yǎng)陰，清熱生津，能夠補(bǔ)益肺腎氣陰兩虛，并祛虛火；冬蟲夏草為臣，補(bǔ)益肺腎，化痰止血，《藥性考》載：“甘味性溫，秘精益氣，專補(bǔ)命門”；佐以化瘀止血之要藥三七，止血不留瘀，化瘀不傷正，諸藥合用，標(biāo)本同治。

前期研究發(fā)現(xiàn)參七蟲草膠囊能調(diào)整IPF 大鼠血清Th1/Th2 細(xì)胞因子失衡；抑制肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和MMP-9 與TIMP-1 表達(dá)，減輕IPF大鼠肺組織炎癥及病理改變；改善免疫蛋白、血液流變部分指標(biāo)、降低TGF-β1與外周血骨橋蛋白表達(dá)，延緩肺功能惡化，改善患者生活質(zhì)量［15-16］。

本研究結(jié)果顯示模型組血清PDGF、PEDF、ES含量早期分泌旺盛，后期逐漸減少，HIF-1α后期升高，可能與IPF 患者后期嚴(yán)重缺氧有關(guān)，表明在IPF 早期，肺泡壁不僅發(fā)生炎癥反應(yīng)，還伴隨膠原纖維沉積、血管新生，早期炎癥反應(yīng)與血管新生表達(dá)旺盛。炎癥是機(jī)體損傷后的應(yīng)激反應(yīng)，血管新生是肺組織纖維化修復(fù)的重要影響因素。與模型組比較，參七蟲草組促血管生長因子分泌減小，血管新生抑制因子升高，HE 染色、Masson 染色示參七蟲草組大鼠炎癥反應(yīng)及纖維化程度低于模型組。

本研究結(jié)果顯示，參七蟲草組促血管生長因子含量降低，抑制因子表達(dá)旺盛，表明參七蟲草方可能通過抑制促血管新生因子分泌、促進(jìn)血管抑制因子表達(dá)而干預(yù)血管新生，從而達(dá)到延緩肺纖維化的目的。