• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    無動物源成分培養(yǎng)基用于人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的研究

    2016-01-12 10:22:48任春紅,張昕
    關(guān)鍵詞:增殖細胞培養(yǎng)

    無動物源成分培養(yǎng)基用于人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的研究

    任春紅1,張昕2

    (1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心;

    2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心中心實驗室,廣東汕頭515041)

    摘要:目的建立一種無動物源成份無血清的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基XF/SF-MSCM,并探討其支持人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)體外增殖、維持分化潛能的效果。方法組織塊貼壁法分離獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細胞,P1代起分別使用自制的XF/SF-MSCM培養(yǎng)基與含10%胎牛血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基(SC-MSCM)對臍帶間充質(zhì)干細胞進行連續(xù)培養(yǎng)傳代至P6代,觀察比較兩組P6代細胞的形態(tài)及增殖能力,以流式細胞術(shù)檢測連續(xù)傳代后細胞的免疫學(xué)表型,比較其成骨、成脂肪的分化潛能。結(jié)果分離獲得的原代P0臍帶間充質(zhì)干細胞,分別在XF/SF-MSCM與SC-MSCM兩種培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)傳代,細胞增殖能力及形態(tài)無顯著差別。兩組P6代細胞的生長曲線相似,但XF/SF-MSCM組間充質(zhì)干細胞貼壁的緊密程度稍低;流式細胞檢測結(jié)果顯示,XF/SF-MSCM組細胞保持了間充質(zhì)干細胞的免疫學(xué)表型,高表達CD29、CD44、CD90,不表達CD31、CD34、CD45并維持了良好的成骨和脂肪細胞的分化能力。結(jié)論本室制備的無動物源成份無血清培養(yǎng)基XF/SF-MSCM可支持臍帶間充質(zhì)干細胞的體外擴增,維持其免疫學(xué)表型及分化潛能,提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細胞,滿足臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究的需要。

    關(guān)鍵詞:臍帶間質(zhì)干細胞;無血清培養(yǎng)基;細胞培養(yǎng);增殖

    中圖分類號:R3

    基金項目:中國博士后科學(xué)基金面上項目(NO:2013M531872)

    作者簡介:任春紅(1975—),女,山東青州人,汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科主治醫(yī)師。

    [收稿日期2014-11-17;責(zé)任編輯趙菊梅]

    Culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells by

    Xeno/serum-free medium

    RENChun-hong1,ZHANGXin2*

    (1.Endoscopic Center of the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,

    Shantou,515041 China;2.Central Laboratory of the First Affiliated Hospital of Shantou

    University Medical College,Shantou,515041 China)

    Abstract:Objective To establish a xeno/serum-free medium for human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) and evaluate its capacity to support the expansion of hUC-MSCs in vitro.Methods Primary hUC-MSCs were isolated from Wharton's Jelly of umbilical cord of healthy newborn.Cells were respectively maintained and consecutively passaged in our homemade xeno/serum-free medium (XF/SF-MSCM) and conventional serum containing medium (SC-MSCM) as a control from passage1 (P1) to passage 6(P6).Cell morphology and proliferation were observed and compared.The immunological phenotype of P6 hUC-MSCs was analyzed by Flow Cytometry and the differentiation potency was also investigated.Results There is no significant difference in proliferation rate and morphology between hUC-MSCs cultured in X/SF-MSCM and SC-MSCM.The growth curve of P6 cells was similar when they were cultured in two culture systems.The P6 cells cultured in XF/SF-MSCM showed

    MSCs specific surface marker expression phenotype:CD29+,CD44+,CD90+ and CD31-,CD34-,CD45-.Furthermore,P6cells maintained in XF/SF-MSCM could be induced to adipocyte and osteoplastic differentiation.Conclusion Our homemade XF/SF-MSCM for human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) can efficiently support the sequential passage and expansion of hUC-MSCs in vitro and maintain the differentiation potentials. The XF/SF-MSCM medium provides an efficient amplification system to produce sufficient and high quality MSCs for either clinical studies or applications.

    Key words:Umbilical Cord mesenchymal stem cells; Serum-free medium; Cell culture; Proliferation

    人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,極具臨床應(yīng)用價值。但為獲得足夠治療劑量的細胞,目前多采用含胎牛血清的培養(yǎng)基進行體外擴增,會帶來動物源性成分及病原體的污染,增加了MSCs臨床應(yīng)用的風(fēng)險[1]。因此,本室研制了一種無動物源性成分的MSCs專用無血清培養(yǎng)基用于hUC-MSCs的體外培養(yǎng),并與含胎牛血清的培養(yǎng)基進行了平行對照研究,觀察了其對hUC-MSCs的增殖及分化潛能的維持效果,以期提高MSCs臨床應(yīng)用的安全性。

    1材料與方法

    1.1材料

    人臍帶組織取自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科健康足月妊娠的剖宮產(chǎn)兒,組織使用經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone);重組人血清白蛋白(rHSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、還原型谷胱甘肽(G-SH)、亞硒酸鈉及胰島素(Sigma);胎牛血清(FBS,BiochromAG);重組人表皮生長因子(rhEGF)與堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF,R&D);L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)、雙抗、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA及地塞米松(Gibco);茜素紅、油紅(Oil-Red)-O、β-巰基乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶抑制劑、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、β-磷酸甘油及維生素C(Sigma);抗人CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-PE單克隆抗體(四正柏公司),CD31-FITC及CD44-FITC單克隆抗體(eBioscience);倒置顯微鏡(Olympus);AccuriC6流式細胞儀(BD)。

    1.2方法

    1.2.1臍帶的采集與準(zhǔn)備新鮮臍帶無菌采集后存放于含有肝素及抗生素的PBS中,置4℃冰盒內(nèi)帶回,4 h內(nèi)處理。

    1.2.2組織塊貼壁法分離原代hUC-MSCs用含抗生素的PBS反復(fù)清洗臍帶,剝除臍帶外膜及動靜脈,將華爾通膠剪成1~2 mm3組織塊,接種于100 mm培養(yǎng)皿中,間距2~5 mm,加少量含10%胎牛血清的DMEM/F12原代培養(yǎng)基,37℃、5% CO2,飽和濕度培養(yǎng)24~48 h,后添加培養(yǎng)基至沒過組織塊;第7天換新鮮培養(yǎng)基,顯微鏡下觀察細胞生長情況,每3~4 d更換1次培養(yǎng)基,10~14 d后去除組織塊。

    1.2.3hUC-MSCs傳代和培養(yǎng)原代細胞長至約80%融合時,按1:1傳代,在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別為實驗組(無血清培養(yǎng)基XF/SF-MSCM)和對照組(含血清培養(yǎng)基SC-MSCM),按1∶3傳代。XF/SF-MSCM以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,加入10 g/LrHSA、胰蛋白酶抑制劑、NEAA、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞硒酸鈉、10 ng/mLrhEGF、10 ng/mLrhbFGF、L-谷氨酰胺、G-SH、氫化考的松、β-巰基乙醇及雙抗。SC-MSCM為含有10%FBS的DMEM/F12。

    1.2.4細胞增殖狀況的比較hUC-MSCs分別在兩種培養(yǎng)基中連續(xù)傳至第6代,按照0.5×105/孔的密度接種于12孔板中。依次在細胞培養(yǎng)的第1~10天不同時間點進行計數(shù),至細胞生長的平臺期止,繪制生長曲線,每個時間點設(shè)三個復(fù)孔,實驗重復(fù)三次。

    1.2.5流式細胞術(shù)鑒定hUC-MSCs表型分別制備實驗組與對照組的P6代細胞懸液,10%山羊血清封閉15 min,后分別與熒光素標(biāo)記的抗人CD29-FITC、CD90-FITC、CD44-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC和CD45-PE等單克隆抗體室溫避光孵育30 min,以FITC和PE標(biāo)記的小鼠IgG2bκ同型抗體為對照。PBS洗1次后重懸于400μlPBS,流式細胞分析。

    1.2.6hUC-MSCs的成脂誘導(dǎo)分化取實驗組與對照組狀態(tài)良好的P6代hUC-MSCs,分別按2.5×104/孔接種于12孔板中,在XF/SF-MSCM與SC-MSCM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%融合,換為脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基:高糖DMEM加10%FBS、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、60 μmol/L吲哚美辛與5 μg/mL胰島素,每3 d更換培養(yǎng)基,連續(xù)誘導(dǎo)14 d,用2%油紅O染色鑒定分化細胞內(nèi)脂滴的形成。

    1.2.7hUC-MSCs的成骨誘導(dǎo)分化取實驗組與對照組狀態(tài)良好的P6代hUC-MSCs,按1.0×104/孔的密度接種于12孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)至50%~60%融合,換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基:含10%FBS的高糖DMEM中添加0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C和10 mmol/Lβ-磷酸甘油。每3~4 d更換1次培養(yǎng)基,誘導(dǎo)2~3 W,鏡下觀察有無骨質(zhì)沉積結(jié)節(jié),4%的多聚甲醛固定30 min;PBS洗滌后,1 mL茜素紅染液染色3~5 min,鏡下觀察、拍照記錄。

    2結(jié)果

    2.1hUC-MSCs分離、培養(yǎng)和形態(tài)觀察

    組織貼壁法分離培養(yǎng)4 d左右,可觀察到少量梭形細胞從組織塊爬出。第8天,部分原代細胞在組織塊周圍呈單層生長(圖1A,B),后逐漸融合。鏡下可見,兩種培養(yǎng)體系傳代后的細胞呈扁平的長梭形成纖維樣,形態(tài)均一,達80%融合時,細胞排列緊密,呈有極性的旋渦或指紋狀。同對照組相比,實驗組細胞貼壁的緊密程度稍低,但貼壁率及細胞的生長狀態(tài)無明顯差別(圖1C-F)。

    圖1 人臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)

    注:(100×)(A:培養(yǎng)4 d后的組織塊;B:培養(yǎng)8 d后的組織塊;C、D:XF/SF-MSCM中傳代培養(yǎng)第1天與第3天;E、F:SC-MSCM中傳代培養(yǎng)第1天與第3天)

    2.2兩種培養(yǎng)體系中細胞的增殖能力

    選取兩組連續(xù)傳至第6代的hUC-MSCs,觀察生長情況。結(jié)果可見,P6代細胞接種后,生長潛伏期(0~24 h)增殖緩慢,2 d后進入對數(shù)生長期,持續(xù)3~4 d,到第6天左右細胞生長進入平臺期(圖2)。實驗組與對照組細胞的生長曲線相似。

    2.3hUC-MSCs免疫表型的測定

    對在兩種培養(yǎng)基中連續(xù)傳至第6代的hUC-MSCs進行流式細胞檢測,結(jié)果顯示,連續(xù)傳代后,實驗組細胞高表達CD29、CD44、CD90,不表達造血干細胞標(biāo)志CD34、CD45及內(nèi)皮細胞標(biāo)志CD31(圖3),說明在XF/SF-MSCM中連續(xù)傳代后,hUC-MSCs仍維持了特異性免疫表型。

    圖2 第6代臍帶間充質(zhì)干細胞生長曲線

    圖3 XF/SF-MSCM與SC-MSCM培養(yǎng)的第6代

    2.4hUC-MSCs成骨、成脂肪分化能力檢測

    圖4 間充質(zhì)干細胞多向分化潛能的鑒定

    注:(A、C:SC-MSCM培養(yǎng)的第6代hUC-MSCs的成脂、成骨分化;B、D:XF/SF-MSCM培養(yǎng)的第6代hUC-MSCs的成脂、成骨分化)

    使用兩種培養(yǎng)基中連續(xù)傳至第6代的hUC-MSCs,分別向成脂肪和成骨方向誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示,向脂肪誘導(dǎo)分化14 d后,鏡下可見在兩組細胞中均有大量脂滴形成,油紅O染色呈強陽性(圖4A,B);對成骨誘導(dǎo)3周的細胞進行茜素紅染色,鏡下同樣可觀察到在兩組細胞中含大量深紅色骨質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)(圖4C,D),證明臍帶間充質(zhì)干細胞在XF/SF-MSCM培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后,仍保持了良好的向脂肪、骨等細胞的分化潛能。

    3討論

    1991年,McElreavey等從人臍帶華爾通膠(Wharton′sjelly,WJ)中發(fā)現(xiàn)并首次分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)。同骨髓、臍血來源的MSCs相比,hUC-MSCs倫理學(xué)爭議少、來源豐富、取材方便、增殖能力更強,并具有免疫原性低、調(diào)節(jié)免疫、支持造血、旁分泌、低致瘤性等優(yōu)點,因此顯示了更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。為解決目前MSCs體外擴增普遍使用動物血清帶來的動物源性成分及病原體污染的問題,本室建立了一種無動物源性成分、成分明確的MSCs專用培養(yǎng)基XF/SF-MSCM:以DMEM/F12為基礎(chǔ),添加了細胞生長必需的營養(yǎng)成分,保護細胞免受理化因素損傷的緩沖、抗氧化成分及可支持MSCs集落生成的rhEGF、rhbFGF等因子。

    本研究在原代細胞分離過程中采用了組織塊貼壁法,以避免酶消化對細胞的損傷及臍帶中造血、內(nèi)皮細胞的污染[2-4]。結(jié)果顯示,組織塊貼壁培養(yǎng)1d后即有細胞游出,第10天相鄰組織塊間的細胞開始融合。傳代后細胞形態(tài)均一,其他類型細胞極少,流式細胞檢測顯示純度很高。

    本研究自P1代細胞起即使用XF/SF-MSCM培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代培養(yǎng),而未采取逐步替代血清的方法[5]。與對照組(SC-MSCM)相比,實驗組(XF/SF-MSCM)組細胞的增殖效率、細胞生長曲線及免疫學(xué)表型、成骨及成脂肪分化潛能均無差別。在連續(xù)傳代過程中,兩組細胞接種24h貼壁率無明顯差別(數(shù)據(jù)未顯示),但鏡下觀察及傳代時胰酶消化的難易程度均顯示,實驗組細胞貼壁的緊密程度低于對照組,表明本培養(yǎng)基配方中仍缺乏促細胞貼壁因子,這也是目前無血清培養(yǎng)基普遍存在的問題。間充質(zhì)干細胞的貼壁率直接影響其生存與增殖,尤其在原代細胞分離過程中,常用解決方法是在培養(yǎng)介質(zhì)表面預(yù)鋪層粘連蛋白、纖粘連蛋白、I型膠原等促貼壁物質(zhì)[6-7]。本研究曾嘗試在未預(yù)鋪促貼壁物質(zhì)的條件下使用XF/SF-MSCM分離原代細胞,細胞獲得率遠低于血清培養(yǎng)基組(數(shù)據(jù)未顯示)。但促貼壁劑價格昂貴或為動物來源,并不適于臨床大規(guī)模制備細胞。目前大部分臨床研究仍將含胎牛血清的培養(yǎng)基用于原代細胞的分離,美國的FDA也允許使用動物血清,但對血清質(zhì)量及檢測做了嚴(yán)格規(guī)定。此外,也有實驗室開始使用人血小板裂解物作為血清替代物,效果較好[8]。

    本研究結(jié)果顯示,本室的XF/SF-MSCM培養(yǎng)基能有效支持臍帶間充質(zhì)干細胞的體外擴增,且連續(xù)傳代后細胞仍保持其免疫學(xué)表型及分化潛能,為提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細胞用于臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究奠定實驗了方法學(xué)基礎(chǔ)。

    參考文獻:

    [1]Kuo TK,Hung SP,Chuang CH,et al.Stem cell therapy for liver disease:parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells [J].Gastroenterology,2008,134(7):2111-2121.

    [2]Patric Horn,Simone Bork,Wolfgan Wagner.Standardized Isolation of human Mesenchymal Stromal Cells with Red Blood cell lysis[M].2011.

    [3]Broska M,Geiger H,Gauer E,et al.Epithelial differentiation of human adipose derived stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun 2005,330 (1): 142-150.

    [4]Guilak F,Lott KE,Awad HA,et al.Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells[J].Cell Physiol,2006,206 (1): 229-237.

    [5]張文成,王韞芳,常銘洋,等,臨床研究用間充質(zhì)干細胞的體外制備策略[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2012,(7)5: 327-332.

    [6]Marastoni S,Ligresti G,Lorenzon E,et al.Extracellular matrix:a matter of life and death[J].Connect Tissue Res.2008,49(3):203-206.

    [7]O'Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,et al.The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds [J].Biomaterials,2005,26(4): 433-441.

    [8]Bernardo ME,Avanzini MA,Perotti C,et al.Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches:further insights in the search for a fetal calf serum substitute[J].J Cell Physiol.2007,211(1):121-130.

    猜你喜歡
    增殖細胞培養(yǎng)
    作者更正啟事
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體的工藝研究
    生物化工(2018年6期)2018-04-02 11:05:30
    勿忘我組培快繁技術(shù)的優(yōu)化
    勿忘我組培快繁技術(shù)的優(yōu)化
    ‘金凱特’杏的組織培養(yǎng)與快繁
    普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990的影響及其協(xié)同吉西他濱的抑瘤作用
    細胞自噬與人卵巢癌細胞對順鉑耐藥的關(guān)系
    雷帕霉素對K562細胞增殖和凋亡作用的影響
    科技視界(2016年5期)2016-02-22 19:03:28
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細胞培養(yǎng)上清液中紅細胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    叶爱在线成人免费视频播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品高清国产在线一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久精品人妻al黑| 五月开心婷婷网| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久狼人影院| 乱人伦中国视频| 成人av一区二区三区在线看| 久久国产精品影院| 在线观看免费视频日本深夜| 久久av网站| 国产精品九九99| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩中文字幕视频在线看片| 我要看黄色一级片免费的| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品久久久久久电影网| 99九九在线精品视频| 少妇粗大呻吟视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 两性夫妻黄色片| 亚洲欧洲日产国产| 在线观看66精品国产| 少妇精品久久久久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 宅男免费午夜| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 91成年电影在线观看| 69av精品久久久久久 | 在线 av 中文字幕| 成人特级黄色片久久久久久久 | 免费黄频网站在线观看国产| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品国产a三级三级三级| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品免费一区二区三区在线 | 两性夫妻黄色片| 国产片内射在线| 9热在线视频观看99| 日韩成人在线观看一区二区三区| 一夜夜www| 免费不卡黄色视频| 91九色精品人成在线观看| 男人舔女人的私密视频| 黑丝袜美女国产一区| 精品熟女少妇八av免费久了| 窝窝影院91人妻| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 成人手机av| 在线播放国产精品三级| 亚洲熟女毛片儿| 久热这里只有精品99| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产97色在线日韩免费| 在线观看舔阴道视频| 韩国精品一区二区三区| 免费观看人在逋| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费日韩欧美在线观看| 国产av一区二区精品久久| 天天操日日干夜夜撸| 中文字幕色久视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 欧美午夜高清在线| 久久午夜亚洲精品久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜福利影视在线免费观看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品国产区一区二| 自线自在国产av| 国产不卡一卡二| 亚洲男人天堂网一区| 黄色视频不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 丝袜喷水一区| 18禁美女被吸乳视频| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 午夜免费鲁丝| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品一区二区在线观看99| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 男女无遮挡免费网站观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲avbb在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 成年人午夜在线观看视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 大香蕉久久成人网| 中文字幕色久视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一本综合久久免费| 亚洲精品成人av观看孕妇| 91成人精品电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久中文字幕一级| 日本av免费视频播放| 欧美国产精品一级二级三级| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av国产精品久久久久影院| 久久久久久久国产电影| 国产精品一区二区在线观看99| 国产成人免费观看mmmm| 九色亚洲精品在线播放| 在线天堂中文资源库| 精品熟女少妇八av免费久了| www日本在线高清视频| 精品人妻在线不人妻| 日韩人妻精品一区2区三区| av一本久久久久| 日韩一区二区三区影片| 女性生殖器流出的白浆| 中文字幕色久视频| 国产精品免费视频内射| 国产日韩欧美在线精品| 1024香蕉在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费在线观看完整版高清| 人成视频在线观看免费观看| 人人妻人人澡人人看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 高清在线国产一区| 大片免费播放器 马上看| 亚洲专区国产一区二区| 国产在线一区二区三区精| 亚洲av美国av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| www.熟女人妻精品国产| 自线自在国产av| 极品教师在线免费播放| 伦理电影免费视频| 99国产精品一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲熟妇熟女久久| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩精品网址| 国产欧美亚洲国产| 欧美另类亚洲清纯唯美| 三上悠亚av全集在线观看| 色94色欧美一区二区| 在线av久久热| 动漫黄色视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 国产成人欧美在线观看 | 精品久久久久久电影网| 在线观看一区二区三区激情| 首页视频小说图片口味搜索| 99久久人妻综合| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产深夜福利视频在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久国产欧美日韩av| 2018国产大陆天天弄谢| 男女之事视频高清在线观看| 在线永久观看黄色视频| 国产男靠女视频免费网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美一级毛片孕妇| av网站免费在线观看视频| 在线永久观看黄色视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产97色在线日韩免费| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 91老司机精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 91成年电影在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 热re99久久国产66热| 久久这里只有精品19| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇粗大呻吟视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产淫语在线视频| 少妇 在线观看| 在线观看免费高清a一片| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av电影在线进入| 国产在线观看jvid| 另类精品久久| 亚洲午夜理论影院| 久久久精品94久久精品| 好男人电影高清在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产成人av教育| 亚洲av欧美aⅴ国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 人妻一区二区av| 丝袜喷水一区| 成人av一区二区三区在线看| 欧美成人午夜精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产麻豆69| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 99精品欧美一区二区三区四区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 99久久人妻综合| 男男h啪啪无遮挡| 一级毛片女人18水好多| 久久影院123| 2018国产大陆天天弄谢| 一级毛片精品| 久久久久网色| 999精品在线视频| 99久久人妻综合| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 老汉色∧v一级毛片| 国产成人系列免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 啦啦啦 在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲人成电影观看| 一本色道久久久久久精品综合| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 在线 av 中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美在线黄色| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲黑人精品在线| 精品国产一区二区久久| 亚洲avbb在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 99九九在线精品视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精品在线观看二区| 在线观看免费视频网站a站| www.999成人在线观看| 日韩欧美免费精品| 最黄视频免费看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品第一国产精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 嫩草影视91久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲中文av在线| 久9热在线精品视频| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av片天天在线观看| 午夜激情av网站| 18禁观看日本| 久久狼人影院| 日韩三级视频一区二区三区| cao死你这个sao货| 久久久久国内视频| 桃花免费在线播放| 人人澡人人妻人| 热99国产精品久久久久久7| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产野战对白在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品一品国产午夜福利视频| 免费高清在线观看日韩| 高清毛片免费观看视频网站 | 久久久久精品国产欧美久久久| 午夜激情av网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 成人影院久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 成人三级做爰电影| 757午夜福利合集在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品第一国产精品| 国产成人欧美| 捣出白浆h1v1| 视频区图区小说| 不卡av一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 久久亚洲真实| 国产高清videossex| 麻豆乱淫一区二区| 99精品欧美一区二区三区四区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产激情久久老熟女| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 一进一出抽搐动态| 超碰成人久久| 两个人免费观看高清视频| 免费看十八禁软件| 国产精品电影一区二区三区 | 丁香六月天网| 51午夜福利影视在线观看| 制服人妻中文乱码| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 色94色欧美一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一夜夜www| 午夜成年电影在线免费观看| 一区二区三区激情视频| 国产精品二区激情视频| 一进一出抽搐动态| 五月天丁香电影| 1024香蕉在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 美国免费a级毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久热在线av| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 老司机午夜十八禁免费视频| 99国产精品一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 欧美乱妇无乱码| 美女福利国产在线| 涩涩av久久男人的天堂| 国产有黄有色有爽视频| 午夜久久久在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 捣出白浆h1v1| 最新在线观看一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 极品人妻少妇av视频| 曰老女人黄片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品国产高清国产av | 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美成人免费av一区二区三区 | 午夜免费鲁丝| 免费看a级黄色片| 男女边摸边吃奶| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利欧美成人| 18在线观看网站| 天堂8中文在线网| tube8黄色片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99国产精品99久久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 中文欧美无线码| 亚洲av片天天在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品一二三| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线永久观看黄色视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 天天影视国产精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品久久久久成人av| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩有码中文字幕| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲av美国av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 免费在线观看完整版高清| 亚洲成a人片在线一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美精品一区二区大全| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| cao死你这个sao货| 最近最新中文字幕大全电影3 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜福利乱码中文字幕| 美女主播在线视频| 不卡av一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产区一区二久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 91老司机精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久九九热精品免费| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久中文看片网| 国产单亲对白刺激| 免费在线观看影片大全网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品第一国产精品| 搡老岳熟女国产| 99久久国产精品久久久| 亚洲熟女毛片儿| 69av精品久久久久久 | 国产在线视频一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产午夜精品久久久久久| av天堂久久9| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产一区二区三区视频了| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品二区激情视频| 国产精品免费大片| 亚洲精品乱久久久久久| 动漫黄色视频在线观看| 69av精品久久久久久 | 女人久久www免费人成看片| 多毛熟女@视频| 国产男靠女视频免费网站| 日本av免费视频播放| 欧美日韩精品网址| 免费高清在线观看日韩| 午夜免费鲁丝| kizo精华| 精品久久蜜臀av无| 中文字幕制服av| 18在线观看网站| 超碰成人久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 老司机福利观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产色视频综合| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩视频一区二区在线观看| 人人澡人人妻人| 国产又色又爽无遮挡免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品久久电影中文字幕 | 少妇 在线观看| 51午夜福利影视在线观看| av国产精品久久久久影院| 在线永久观看黄色视频| 首页视频小说图片口味搜索| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久久国内视频| 丰满少妇做爰视频| 日韩三级视频一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 极品少妇高潮喷水抽搐| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美日韩av久久| 久久中文字幕一级| 精品少妇内射三级| 日本黄色日本黄色录像| 久久ye,这里只有精品| avwww免费| 国产成人av教育| 亚洲精品国产区一区二| 18在线观看网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 夫妻午夜视频| 国产真人三级小视频在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久久久视频综合| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本vs欧美在线观看视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲五月婷婷丁香| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品亚洲av国产电影网| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91麻豆av在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 麻豆国产av国片精品| 麻豆乱淫一区二区| 中国美女看黄片| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美在线黄色| 777米奇影视久久| 亚洲美女黄片视频| 欧美日韩视频精品一区| 热re99久久国产66热| kizo精华| 久久久久精品国产欧美久久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人免费观看视频高清| 午夜日韩欧美国产| 国产午夜精品久久久久久| 91精品国产国语对白视频| 在线天堂中文资源库| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久久精品94久久精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 大码成人一级视频| 天天影视国产精品| av网站在线播放免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 桃花免费在线播放| videos熟女内射| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美日韩黄片免| 香蕉国产在线看| 美女视频免费永久观看网站| 久久九九热精品免费| 一区二区三区激情视频| 香蕉国产在线看| 久久久久久久国产电影| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费看a级黄色片| 极品人妻少妇av视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| av福利片在线| 成人av一区二区三区在线看| 国产欧美日韩一区二区精品| 动漫黄色视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 日韩免费av在线播放| 精品国产一区二区久久| 丁香六月天网| 日本wwww免费看| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产xxxxx性猛交| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 男女无遮挡免费网站观看| svipshipincom国产片| 18禁国产床啪视频网站| 国产成人av激情在线播放| 国产在线视频一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成+人综合+亚洲专区| 男女免费视频国产| 九色亚洲精品在线播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 女警被强在线播放| 精品亚洲成国产av| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美午夜高清在线| 怎么达到女性高潮| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲av日韩在线播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产xxxxx性猛交| 亚洲精品国产一区二区精华液| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲av第一区精品v没综合| av免费在线观看网站| 国产精品 国内视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 午夜精品久久久久久毛片777| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人av教育| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品 国内视频| 999久久久精品免费观看国产| 三级毛片av免费| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美大码av| 女人久久www免费人成看片| 高清欧美精品videossex| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品久久久久久电影网| avwww免费| 我的亚洲天堂| 黄色视频,在线免费观看| www日本在线高清视频|