嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲各蟲(chóng)態(tài)的致病力及侵染行為

呂朝軍 趙建超 鐘寶珠 張楚毓 陳拓 李文蓮

關(guān)鍵詞：嗜菌異小桿線蟲(chóng)；致病力；紅棕象甲；形態(tài)學(xué)

紅棕象甲（RhynchophorusferrugineusOliver）是我國(guó)重要的檢疫性害蟲(chóng)，分布于海南、廣東、廣西、重慶、臺(tái)灣、云南、西藏、香港、澳門(mén)、江西、上海、四川、貴州、浙江、福建等地[1-2]，也是世界上椰子（CocosnuciferaL.）、油棕（ElaeisguineensisJacq.）、椰棗（PhoenixdactyliferaL.）等棕櫚科作物的重大害蟲(chóng)。該蟲(chóng)主要通過(guò)鉆蛀植物的莖干和生長(zhǎng)點(diǎn)危害，由于其為害隱蔽，在植株表現(xiàn)癥狀時(shí)多數(shù)已無(wú)法挽救。

目前生產(chǎn)上對(duì)于紅棕象甲的防治方法包括莖干注射[2]、藥劑噴霧[3]、信息素誘捕[4]等。在該蟲(chóng)生物防治方面已取得了一些成就[5-7]，其中昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)（entomopathogenicnematodes，EPNs）作為重要的生防因子之一[7]，可與其他生物形成共生關(guān)系[8]，截至2015年底，已報(bào)道95種斯氏線蟲(chóng)和16種異小桿線蟲(chóng)[9]。BARBARA等[10]研究了斯氏線蟲(chóng)（Steinernemacarpocapsae）對(duì)紅棕象甲的致死效果，及其對(duì)紅棕象甲生長(zhǎng)發(fā)育及幼蟲(chóng)的免疫活性等影響，當(dāng)EPNs通過(guò)肛門(mén)、氣孔和口腔進(jìn)入宿主后，會(huì)在宿主血腔中釋放共生細(xì)菌引起細(xì)胞毒性，并引起敗血癥導(dǎo)致宿主死亡[11]；田間試驗(yàn)結(jié)果表明，EPNs對(duì)紅棕象甲的預(yù)防效果達(dá)98%，治愈率達(dá)80%[12]。同時(shí)嗜菌異小桿線蟲(chóng)（Heterorhabditisbacteriophora）和昆蟲(chóng)病毒以1∶5混合對(duì)紅棕象甲的防治效果較好[13]；嗜菌異小桿線蟲(chóng)與白僵菌（Beauveriabassiana）混用對(duì)于紅棕象甲幼蟲(chóng)具有增效作用，尤其對(duì)低齡幼蟲(chóng)的增效作用更顯著[14]。目前針對(duì)EPNs侵染紅棕象甲的研究多集中在幼蟲(chóng)，而較少報(bào)道對(duì)其他蟲(chóng)態(tài)是否有致病性的研究，因此本文研究了嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06（HeterorhabditisbacteriophoraH06）品系對(duì)紅棕象甲各蟲(chóng)態(tài)的致病力，并對(duì)其侵染途徑及侵染過(guò)程等進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以期為紅棕象甲生物防治策略的科學(xué)制定提供參考。

1材料與方法

1.1材料

紅棕象甲和嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所生物防治實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)。其中紅棕象甲采用半人工飼料[15]飼養(yǎng)；嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系以大蠟螟幼蟲(chóng)為寄主進(jìn)行擴(kuò)繁，采用Whitetrap法[16]收集3齡侵染期線蟲(chóng)（infectivejuveniles，IJs），用蒸餾水稀釋成系列濃度，備用。

試蟲(chóng)繁育及實(shí)驗(yàn)均在溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度70%±5%的昆蟲(chóng)繁育室開(kāi)展。

1.2方法

1.2.1嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲的致病力測(cè)定養(yǎng)蟲(chóng)杯（直徑4cm，高3cm）杯底覆蓋濾紙，杯頂置通氣孔，用移液槍滴加1mL不同濃度線蟲(chóng)液至濾紙上，將紅棕象甲5個(gè)齡期段（1～2齡、3～4齡、5～6齡、7～8齡、9～10齡）幼蟲(chóng)、卵、蛹、成蟲(chóng)分別置于養(yǎng)蟲(chóng)杯中。處理5d后統(tǒng)計(jì)試蟲(chóng)死亡率，并以對(duì)照組死亡率對(duì)處理死亡率進(jìn)行校正。每處理30頭，重復(fù)3次，以蒸餾水處理為對(duì)照。幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)死亡標(biāo)準(zhǔn)：以昆蟲(chóng)針輕觸蟲(chóng)體，完全不動(dòng)者為死亡。卵死亡標(biāo)準(zhǔn)：以變紅色或黑色為死亡。

死亡率=死亡蟲(chóng)口數(shù)/處理總蟲(chóng)口數(shù)×100%

校正死亡率=（處理死亡率-對(duì)照死亡率）/（1-對(duì)照死亡率）×100%

1.2.2紅棕象甲不同蟲(chóng)態(tài)被嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系侵染后的形態(tài)學(xué)變化使用線蟲(chóng)液（500IJs/mL）分別對(duì)紅棕象甲6齡幼蟲(chóng)、預(yù)蛹、初產(chǎn)1d卵、新羽化成蟲(chóng)進(jìn)行處理。其中幼蟲(chóng)和預(yù)蛹滴加200μL于前胸背板處，成蟲(chóng)滴加200μL于前胸背板和中胸之間連接處，卵直接在線蟲(chóng)液中浸漬5s取出，處理后將試蟲(chóng)單獨(dú)放置于養(yǎng)蟲(chóng)盒中，成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)以甘蔗塊為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。處理72h后用索尼攝像機(jī)（FDR-AX700）拍照記錄紅棕象甲各蟲(chóng)態(tài)被EPNs侵染后的典型形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系從紅棕象甲幼蟲(chóng)不同部位的侵入效果選取紅棕象甲3齡、6齡、8齡幼蟲(chóng)，以每克蟲(chóng)體重接種100IJs劑量嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系，分別接種于紅棕象甲口器、氣孔和肛門(mén)周?chē)?，處?d后統(tǒng)計(jì)死亡蟲(chóng)數(shù)。死亡標(biāo)準(zhǔn)為用昆蟲(chóng)針輕觸蟲(chóng)體，完全不動(dòng)者為死亡。每處理接種30頭，重復(fù)3次，以未接種處理為對(duì)照。

1.2.4嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲幼蟲(chóng)腹側(cè)氣孔的侵入行為觀測(cè)以紅棕象甲8齡幼蟲(chóng)為寄主，接種24h后觀察蟲(chóng)體氣孔周?chē)染愋U線蟲(chóng)H06品系的分布情況。為便于觀察，用防水藍(lán)色記號(hào)筆在紅棕象甲幼蟲(chóng)氣孔處進(jìn)行輕微涂抹，利用解剖鏡（鳳凰XTL-165-LD500u）持續(xù)觀察線蟲(chóng)從紅棕象甲氣孔侵入蟲(chóng)體的過(guò)程并記錄。

1.3數(shù)據(jù)處理

致病力測(cè)定結(jié)果中，根據(jù)黃劍等[17]的方法，采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件求毒力回歸方程及LC50、LC50的95%置信區(qū)間等。嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系致病力數(shù)據(jù)采用試蟲(chóng)的校正死亡率進(jìn)行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT法）進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲不同蟲(chóng)態(tài)的致病力

紅棕象甲各蟲(chóng)態(tài)均可被嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系侵染（表1）。從毒力測(cè)定結(jié)果可知，嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲卵和1～2齡幼蟲(chóng)的毒力水平最高，二者無(wú)顯著差異。隨著幼蟲(chóng)齡期增加，紅棕象甲對(duì)嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系的敏感性逐漸降低，其LC50值逐漸增大；嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲蛹和成蟲(chóng)的致病力無(wú)差異，但均低于卵和1～6齡幼蟲(chóng)。此外，5～6齡幼蟲(chóng)與7～8齡幼蟲(chóng)之間、7～10齡幼蟲(chóng)與蛹之間、9～10齡幼蟲(chóng)與成蟲(chóng)之間對(duì)嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系的敏感性均無(wú)顯著差異。

2.2紅棕象甲不同蟲(chóng)態(tài)被嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系侵染后的形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系侵染后，紅棕象甲幼蟲(chóng)、預(yù)蛹、蛹和卵均死亡，輕觸蟲(chóng)體無(wú)自主反應(yīng)，體色變成紅色或紅褐色，同時(shí)伴隨蟲(chóng)體體壁皺縮僵硬。成蟲(chóng)經(jīng)嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系處理后體色加深，體表斑紋逐漸消失（圖1）。

2.3嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)不同齡期紅棕象甲幼蟲(chóng)不同部位的侵入效果

紅棕象甲幼蟲(chóng)不同部位被嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系侵染后，紅棕象甲死亡率如表2所示。紅棕象甲3齡幼蟲(chóng)的接種處理中，以氣孔和肛門(mén)處接種的致死率較高，且二者無(wú)顯著差異，分別為91.11%和78.89%，均顯著高于口器接種處理；而在6齡幼蟲(chóng)和8齡幼蟲(chóng)的接種處理中均以口器接種致死率最高，分別為95.56%和98.89%，其次為肛門(mén)接種和氣孔接種。

口器接種處理中，6齡和8齡紅棕象甲幼蟲(chóng)死亡率無(wú)顯著差異，但均顯著高于3齡幼蟲(chóng)死亡率；在氣孔接種處理中，3齡幼蟲(chóng)的死亡率顯著高于6齡和8齡幼蟲(chóng)；而在尾部肛門(mén)接種處理中，供試3個(gè)齡期的紅棕象甲幼蟲(chóng)死亡率無(wú)顯著差異。

2.4嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系從紅棕象甲幼蟲(chóng)氣孔侵入的行為觀測(cè)

研究結(jié)果表明，嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系接近紅棕象甲氣孔后，在氣孔周?chē)Ａ粢欢螘r(shí)間，之后從氣孔進(jìn)入蟲(chóng)體（圖2），從開(kāi)始進(jìn)入氣孔至完全進(jìn)入蟲(chóng)體整個(gè)過(guò)程持續(xù)2～5min；部分線蟲(chóng)在進(jìn)入氣孔的過(guò)程中會(huì)退出，亦有部分線蟲(chóng)直接從氣孔上爬過(guò)而不侵入蟲(chóng)體，接觸到紅棕象甲蟲(chóng)體氣孔的線蟲(chóng)且成功進(jìn)入蟲(chóng)體的比例為33.33%。

3討論

EPNs作為一種生防因子，已經(jīng)在部分害蟲(chóng)的防治上得到了應(yīng)用。如小卷蛾斯氏線蟲(chóng)（Steinernemacarpocapsae）All品系與草地貪夜蛾數(shù)量比為劑，可長(zhǎng)期較好地抑制小地老虎對(duì)煙草幼苗的危害[19]；600IJs/mL線蟲(chóng)液處理24h后，Wn01線蟲(chóng)對(duì)紅脈穗螟的校正死亡率達(dá)到86.67%[20]。SHAHINA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，供試的7種EPNs對(duì)紅棕象甲各蟲(chóng)態(tài)均具有較好的致病效果；在阿聯(lián)酋椰棗園紅棕象甲的防控實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一種本土分離的Heterorhabditisindicus線蟲(chóng)能在短時(shí)間內(nèi)滅殺紅棕象甲幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)和蛹[22]。由于EPNs對(duì)昆蟲(chóng)宿主的高致病性[23]，小卷蛾斯氏線蟲(chóng)（SteinernemacarpocapsaeWeiser）和嗜菌異小桿線蟲(chóng)（H.bacteriophoraPoinar）[24]已制作成生防制劑并用于有害生物綜合治理（IPM）中。前期研究顯示，嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系對(duì)紅棕象甲幼蟲(chóng)具有一定的致死作用，且蟲(chóng)體呈現(xiàn)出僵硬皺縮、體色變褐、身體腫脹直至蟲(chóng)體腐爛、線蟲(chóng)游離而出的現(xiàn)象[7]。本研究進(jìn)一步證明，嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系不僅可侵染紅棕象甲幼蟲(chóng)，同時(shí)對(duì)紅棕象甲蛹、成蟲(chóng)、卵等也具有侵染活性。其中對(duì)紅棕象甲卵和1～2齡幼蟲(chóng)的毒力水平最高，這可能與不同蟲(chóng)態(tài)對(duì)EPNs的耐受力差異有關(guān)，也說(shuō)明在紅棕象甲卵期和低齡幼蟲(chóng)期利用嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系進(jìn)行可取得較好的防效。

EPNs侵染寄主的方式分為3種：潛伏型、攻擊型和中間型[25]。其中斯氏線蟲(chóng)的垂直擴(kuò)散能力較強(qiáng)，搜索策略為潛伏型，而異小桿線蟲(chóng)對(duì)寄主的感應(yīng)強(qiáng)烈且主動(dòng)搜索力較強(qiáng)，適于侵染隱蔽性害蟲(chóng)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系在有水為介質(zhì)的情況下會(huì)游離至紅棕象甲幼蟲(chóng)氣孔附近，并通過(guò)氣孔進(jìn)入蟲(chóng)體，但觀察發(fā)現(xiàn)其進(jìn)入蟲(chóng)體氣孔無(wú)目的性，即并不是所有抵達(dá)氣孔的線蟲(chóng)均會(huì)侵入至蟲(chóng)體，因此嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系從紅棕象甲氣孔侵入蟲(chóng)體，是由氣孔散發(fā)的氣味吸引其向氣孔定向移動(dòng)？還是偶然經(jīng)過(guò)氣孔附近進(jìn)而侵入？還需進(jìn)一步深入研究。

EPNs侵入蟲(chóng)體后會(huì)釋放共生細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌毒素和線蟲(chóng)消耗寄主營(yíng)養(yǎng)致寄主死亡[28]，蟲(chóng)尸棕色表示該蟲(chóng)是由斯氏線蟲(chóng)侵染所致，而紅色則為異小桿線蟲(chóng)侵染所致，顏色差異是由于尸體中共生細(xì)菌釋放的色素不同[10]，本研究結(jié)果也表明，經(jīng)嗜菌異小桿線蟲(chóng)H06品系侵染后，紅棕象甲的卵、幼蟲(chóng)、預(yù)蛹、蛹及成蟲(chóng)等各蟲(chóng)態(tài)體色均變成紅色或紅褐色，此結(jié)果與王國(guó)漢等[28]發(fā)現(xiàn)的異小桿線蟲(chóng)侵染蟲(chóng)體后導(dǎo)致寄主尸體初為桔紅色、后期為紅褐色一致。

EPNs從紅棕象甲幼蟲(chóng)不同部位接種后，死亡率存在顯著差異，其中3齡幼蟲(chóng)處理中，以氣孔和肛門(mén)處接種的致死率較高，而6齡和8齡幼蟲(chóng)處理均以口器接種致死率最高。在氣孔接種處理中，3齡幼蟲(chóng)的死亡率較高；而在尾部肛門(mén)接種處理中，供試3個(gè)齡期的紅棕象甲幼蟲(chóng)死亡率無(wú)顯著差異，究其原因可能與紅棕象甲幼蟲(chóng)的氣孔、口器及肛門(mén)的發(fā)育特征有關(guān)，其致病機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。