火龍果軟腐病病原菌鑒定及鏈霉菌菌株LWL1827的防效測定

張鴻雁 陳盈營 周雁微 林麗靜 劉鍇棟

關(guān)鍵詞：火龍果；串珠鐮刀菌；鏈霉菌；拮抗作用

火龍果又稱仙蜜果、紅龍果、情人果，屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）或蛇鞭柱屬（Seleniereus），原產(chǎn)于熱帶中美洲地區(qū)，20 世紀(jì)90 年代初引入我國臺灣后被馴化試種，后陸續(xù)在海南、廣西、廣東、福建等地推廣種植?；瘕埞粌H有豐富的營養(yǎng)成分，還具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)激素及解毒等功效。隨著火龍果種植面積的不斷擴大，銷售儲藏量的增加，儲藏病害種類也越來越多，發(fā)病程度也越來越重。李敏等[1] 發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌（ Colletotrichum gloeosporioides）、MEETUM 等[2]發(fā)現(xiàn)亞洲炭疽菌（C.aenigma）和暹羅炭疽菌（C. siamense）、LI 等[3]發(fā)現(xiàn)平頭炭疽菌（C. truncatum）均可引起火龍果炭疽病。姚昇華等[4] 發(fā)現(xiàn)仙人掌平臍蠕孢（Bipolaris cactivora），鄭樊等[5]發(fā)現(xiàn)雙間柱頂孢（Scytalidium dimidiatum）是火龍果果腐病的主要病原菌，GUO 等[6]發(fā)現(xiàn)桃吉爾霉（Gilbertellapersicaria）亦可引起火龍果果腐病。王會會等[7]發(fā)現(xiàn)引起火龍果潰瘍病的病原菌是新暗色柱節(jié)孢（Neoscytalidium dimidiatum）。

火龍果軟腐病是火龍果儲藏時期的主要病害。發(fā)病部位變褐軟腐，甚至全部腐敗，造成巨大的經(jīng)濟損失[8]。崔志婧等[9]發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）是上海進(jìn)口火龍果軟腐病最主要的病原真菌。林珊宇等[10]發(fā)現(xiàn)木賊鐮刀菌（F. equiseti）亦能引起火龍果軟腐病。但未見串珠鐮刀菌（F.verticillioides）引起火龍果軟腐病的報道。對火龍果軟腐病病原菌的分離鑒定可對火龍果儲藏病害的防治提供理論依據(jù)。

針對火龍果果實病害防治，目前有采用化學(xué)防治[11]、生物防治[12]和天然產(chǎn)物防治[13]等方法，但仍以化學(xué)防治為主。因化學(xué)農(nóng)藥具有高效、快速、方便的特點，人們在防治病害過程中高頻使用化學(xué)農(nóng)藥，從而使病原菌的抗藥性增加，防治效果減弱，環(huán)境微生態(tài)失衡。另外，化學(xué)農(nóng)藥在田間及水果表面不能完全降解而導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題也日益嚴(yán)重，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對食品質(zhì)量安全越來越重視，化學(xué)農(nóng)藥的問題也越來越受到關(guān)注。人們期待一種綠色、安全、環(huán)保的防治方法。而生物防治就是一種有效、安全的病害防治途徑，也是未來病蟲害防治的發(fā)展趨勢。

水果儲藏期病害的生防菌有多種，包括細(xì)菌[14]、放線菌[15]、霉菌[16]和酵母菌[17]等，但火龍果果實病害生物防治的研究較少。曾金興等[18]利用解淀粉芽孢桿菌10075 拮抗2 株火龍果致腐菌，防腐效果高于30%。張振華等[19]從11 個不同生境分離出15 株具有拮抗活性的細(xì)菌，其中有2 株溫室防效接近50%。陳迪等[20]發(fā)現(xiàn)7 株木霉菌對3 種火龍果病原菌均有一定的抑制作用。而未見利用放線菌防治火龍果儲藏期病害的相關(guān)報道。本研究從發(fā)生軟腐病的火龍果病果中分離純化病原菌，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，以鏈霉菌為生物拮抗菌，研究其發(fā)酵濾液對火龍果軟腐病的防治效果，以期為防止火龍果儲藏期軟腐病病害發(fā)生，提高儲藏保鮮效果提供一定的理論基礎(chǔ)和防控途經(jīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試火龍果 采自廣東省湛江市麻章區(qū)金綠寶生態(tài)農(nóng)場。選取新鮮健康、無機械損傷、大小和成熟度一致的新鮮紅寶石火龍果，進(jìn)行常規(guī)儲存。儲存期間挑選典型軟腐病發(fā)病火龍果進(jìn)行試驗。

1.1.2 培養(yǎng)基 病原菌分離、純化、活化和保存采用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。拮抗菌為本實驗室保藏的拮抗放線菌， 皆為鏈霉菌屬（ Streptomyces spp. ） ， 標(biāo)記為LWL1827 、LWL1828、LWL1829 等共26 株。拮抗菌的活化、平板涂布和發(fā)酵液制備采用高氏一號培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和設(shè)備 dNTP 和LA Taq TM 聚合酶[寶生物工程（北京）有限公司]，ITS 和EF1-α引物（上海派森諾生物科技股份有限公司），Axyprep DNA 凝膠回收試劑盒[愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司]，Neofuge 13R 臺式高速冷凍離心機（上海力申科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離鑒定 （1）病原菌菌株的獲得。采用組織分離法，切取發(fā)病火龍果病健交界處3 mm×3 mm 的組織塊，利用75%酒精和1%次氯酸鈉溶液消毒，無菌水清洗，無菌濾紙吸干水分，置于PDA 培養(yǎng)基，28 ℃黑暗培養(yǎng)5～7 d。用竹簽挑取邊緣菌絲，劃線純化，經(jīng)3 次繼代培養(yǎng)后，接種于PDA 斜面培養(yǎng)基，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）病原菌致病性測定。采用無傷接種和針刺接種法。將健康火龍果清洗干凈，75%酒精表面消毒。針刺接種：用滅菌竹簽刺穿火龍果表面大約直徑5 mm、深度5 mm 的傷口，將5 mm 病原菌瓊脂塊接種至傷口部位，置于無菌袋中，28 ℃培養(yǎng)。接種PDA 瓊脂塊為對照，重復(fù)3 次。不刺傷為無傷接種。定期觀察接種處是否有病害發(fā)生，觀察并記錄病害發(fā)生時間及癥狀。對發(fā)病火龍果進(jìn)行組織分離，根據(jù)柯赫法則確定是否為致病菌。

（3）病原菌形態(tài)特征觀察。于PDA 培養(yǎng)基上觀察病原菌菌落特征，如菌落形態(tài)、顏色、生長速度、菌絲形態(tài)等。插片法顯微鏡觀察病原菌的顯微特征，菌絲形態(tài)，大、小分生孢子產(chǎn)生情況及形態(tài)，厚垣孢子的有無和產(chǎn)生方式，產(chǎn)孢細(xì)胞類型等。參照《真菌鑒定手冊》[21]進(jìn)行鑒定。

（4）病原菌的分子鑒定。病原真菌rDNA-ITS及EF1-α 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，依照試劑盒說明書進(jìn)行病原菌DNA 提取，分別用ITS 引物（ITS1： 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ） 和EF1-α引物（ EFl-728F： 5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'， EF1-986R： 5'-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3'）進(jìn)行PCR 擴增，產(chǎn)物回收。委托上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 同源序列比對，選取同源性較高及形態(tài)相近的菌株序列， 經(jīng)拼接后， 用MEGA7.0 中的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，使用bootstraps 進(jìn)行自檢，1000 次重復(fù)以檢驗進(jìn)化樹置信度。通過親緣關(guān)系分析確定病原菌的分類地位。

1.2.2 拮抗菌的拮抗防病作用 （1）平板抑菌試驗。采用瓊脂塊法，用滅菌竹簽從斜面試管中取少量放線菌，均勻涂布于高氏1 號培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d。用直徑5 mm 的無菌打孔器打成菌餅，轉(zhuǎn)接至涂布病原菌的平皿上，菌面朝下，重復(fù)3次，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑及抑菌圈透明度。

無菌發(fā)酵濾液的制備。將供試放線菌接種到液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)9 d。發(fā)酵液4000×g 離心5 min 后，用0.22 μm 滅菌微孔濾膜過濾除菌，得無菌濾液。

抑菌率測定。采用生長速率法。將濾液配制成1∶1、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100（V/V）不同濃度上清液與PDA 培養(yǎng)基混合倒平板，以不加無菌濾液的PDA 培養(yǎng)基為對照。用5 mm 無菌打孔器取病原菌菌餅，置于PDA 平板中央，重復(fù)3 次，25 ℃培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。確定最佳拮抗菌及濾液濃度，用于后續(xù)試驗。抑制率=（對照菌落直徑–處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

（2）火龍果接種試驗。選取健康火龍果，經(jīng)75%酒精和無菌水各擦拭3 次。選取對峙試驗拮抗效果較好的拮抗菌株制備不同濃度的無菌發(fā)酵濾液，噴涂火龍果、晾干。將病原菌孢子懸浮液（孢子濃度為1.0×107 個/mL）噴涂火龍果，以空白培養(yǎng)基和清水為對照，3 次重復(fù)。處理火龍果室溫3～11 d，每隔2 d 觀察，計算病情指數(shù)（diseaseindex， DI）和防效（control efficacy， CE）。病情指數(shù)=（發(fā)病級別×該級別發(fā)病數(shù)）/（調(diào)查總個數(shù)×最高病級別）×100。防效=（對照病情指數(shù)?處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

判定標(biāo)準(zhǔn)[22]：無褐變?yōu)? 級；褐變面積小于20%為1 級；褐變面積在20%～50%之間為2 級；褐變面積在50%～75%之間為3 級；褐變面積大于75%為4 級；整果褐變?yōu)? 級。

火龍果經(jīng)無菌濾液處理后，參考曹建康等[23]的方法對果實中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019 軟件記錄、統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進(jìn)行基礎(chǔ)分析，采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncans 多重比較進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

從火龍果軟腐病發(fā)病組織中分離獲得病原菌，得到純培養(yǎng)物標(biāo)記為ZYW18。

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)分析 將病原菌ZYW18接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第3 天，菌落直徑達(dá)到30 mm；第5 天菌落直徑達(dá)50 mm；第7 天菌落直徑達(dá)80 mm，菌落圓形，氣生菌絲初期為白色，疏松，棉絮狀，邊緣具有卷毛狀，逐漸變?yōu)闇\黃色。菌落背面米黃色（圖1A）。大型分生孢子罕見，鐮刀狀，中等偏窄，兩端稍尖，略微向內(nèi)彎曲，多數(shù)單隔膜，大小1.5～3.0 μm×20.0～30.0 μm。小型分生孢子呈鏈狀排列，橢圓形或圓錐形，大小為5.0～12.0 μm×1.5～2.5 μm（圖1B）。根據(jù)病原菌菌落形態(tài)和分生孢子特征，初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusarium sp.）。

2.1.2 致病性測定 將病原菌ZYW18 回接于健康火龍果上，經(jīng)無傷和針刺接種進(jìn)行致病性測定（圖1C）。發(fā)現(xiàn)2 種接種方法均出現(xiàn)癥狀。病原菌接種5 d 后病斑直徑達(dá)到32.5 mm，果肉褐變，表層覆蓋一層白色菌絲，后期菌絲范圍逐漸擴大，果肉開始出現(xiàn)軟爛，侵染部位組織軟化褐變明顯。癥狀與自然發(fā)病火龍果相符。從回接后的發(fā)病部位病健交界處取得組織塊，分離得到病原菌與接種病原菌一致。證明接種的病原菌是引起火龍果軟腐病的致病菌。

2.1.3 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育分析 病原菌菌株ZYW18 的ITS 和EF1-α PCR 產(chǎn)物測序后，分別獲得長度為540、590 bp 的擴增片段，產(chǎn)物純化后測序，將rDNA-ITS 和EF1-α 基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（登錄號分別為ON012775 和ON087601），經(jīng)數(shù)據(jù)比對分析后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。ITS 序列聚類結(jié)果顯示，ZYW18 與F. verticillioides LAPEMI10.2015（ITS 和EF1-α 登錄號分別為KR052812 和MG195125.1）相似度達(dá)99%～100%，遺傳距離最小，聚為一類，支持率為99%。結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，表明引起火龍果軟腐病的病原菌為串珠鐮刀菌（F. verticillioides）。

2.2 拮抗性鏈霉菌對病原菌的拮抗作用及防效

2.2.1 拮抗作用 在PDA 平板涂布接種病原菌ZYW18，接種拮抗組織塊，篩選拮抗菌株（圖3，表1）。由表1 可知，26 株拮抗性鏈霉菌中，抑菌效果較明顯的有5 株。其中抑菌圈直徑較大，抑菌效果較明顯的菌株為LWL1827，抑菌圈直徑為（18.32±2.13）mm，且抑菌圈透明，抑制徹底，與其他菌株相比差異顯著；其次為LWL1828，抑菌圈直徑為（12.55±1.56）mm 。LWL1829 和LWL1818 抑菌不徹底，抑菌圈不透明。

5 株菌不同濃度的無菌發(fā)酵濾液對病原菌ZYW18 的抑菌作用見表1。由表1 可知，抑菌率最高的為LWL1827，1∶5、1∶10、1∶50（V/V）不同濃度無菌發(fā)酵濾液的抑菌率分別為91.23%±3.11%、87.21%±3.22%、和80.22%±2.03%，與其他菌相應(yīng)濃度相比差異顯著；其次為LWL1828，其濃度為1∶10 的抑菌率最高，為45.03%±1.98%；其他3 株菌抑菌效果相當(dāng)，抑菌率相對較小。抑菌效果最弱的是LWL1829。

由圖3 和表1 的拮抗試驗可知，對病原菌ZYW18 的拮抗效果最佳的為鏈霉菌LWL1827（Streptomyces sp. LWL1827），選取1∶5、1∶10、1∶50（V/V）不同濃度進(jìn)行火龍果接種試驗。

2.2.2 防治效果 噴涂菌株LWL1827 的發(fā)酵濾液后，常溫儲藏3、5、7、9、11 d。不同濃度和不同時間的火龍果病情指數(shù)（DI）和防治效果（CE）均有差異（表2）。不同儲藏時間的培養(yǎng)基對照和清水對照的病情指數(shù)相當(dāng)，差異不顯著。由表2 可知，儲藏3 d，處理和對照火龍果均未發(fā)??；儲藏5 d，培養(yǎng)基對照和清水對照火龍果的病情指數(shù)分別為26.30±1.95 和23.70±4.23，顯著高于LWL1827 發(fā)酵濾液處理的病情指數(shù)，濃度為1∶10 的防治效果較好，為53.59%±4.21%；儲藏7 d 和9 d 的病情指數(shù)也顯著低于培養(yǎng)基對照和清水對照；儲藏11 d，培養(yǎng)基對照和清水對照火龍果病情指數(shù)已分別高達(dá)85.11±5.36 和82.55±6.43，濾液處理的病情指數(shù)均低于50.00%，濃度為1∶50的防治效果最高為51.54%±3.06%，其次是濃度為1∶10 的防治效果43.06%±2.88%?？梢?，隨著儲藏時間延長，拮抗菌株發(fā)酵濾液處理的火龍果病情指數(shù)均顯著降低。同時，不同稀釋度發(fā)酵濾液的防病效果亦有所下降，其中濃度為1∶10 的防治效果下降幅度較小。

2.2.3 拮抗菌株對火龍果抗性酶活性的影響 火龍果經(jīng)濃度為1∶10 的拮抗菌株LWL1827 發(fā)酵液處理不同時間后，火龍果果實的抗性酶活性變化見表3。由表3 可知，3 種抗性酶PPO、POD和PAL活性均呈先逐漸上升，后逐漸下降的趨勢，與對照相比差異顯著。第7 天3 種酶活性均達(dá)峰值，PPO、POD 和PAL 活性分別為（1.90±0.15）、（3.88±0.55）、（1.48±0.43）U/g。由表中還可看出，菌株LWL1827 發(fā)酵濾液處理后火龍果3 種抗性酶活性均高于對照。對于PPO，儲藏9 d 和11 d的酶活性分別是對照的2.31 倍、2.28 倍；對于POD，儲藏7 d 的酶活性是對照的2.34 倍；對于PAL，儲藏3、5、7、9、11 d 的酶活性分別為對照的1.85 倍、2.20 倍、2.43 倍、2.79 倍、2.80 倍。可以看出，濾液處理后抗性酶活性的下降變緩。

3 討論

軟腐病作為火龍果儲藏期重要病害，是火龍果采后腐爛的主要原因，嚴(yán)重影響火龍果的儲運品質(zhì)，縮短貨架期，造成較大經(jīng)濟損失?；瘕埞浉〔≡蔫b定，以及該病害的生物防治對于火龍果儲運和綠色保鮮具有重要意義。

鐮刀菌（Fusarium spp.）是真菌中的一個龐大的家族，普遍存在于土壤及動、植物有機體內(nèi)，世界各地均有分布，是危害最嚴(yán)重的植物病原真菌[24]。一種鐮刀菌往往可侵染不同種的植物，同種植物某種病害也會由于植物產(chǎn)地和來源不同，環(huán)境的差異，由不同鐮刀菌侵染，或者不同優(yōu)勢種的鐮刀菌復(fù)合侵染。本研究由火龍果軟腐病患病組織中獲得病原菌為串珠鐮刀菌（F. verticillioides）， 不同于文獻(xiàn)中尖孢鐮刀菌（ F. oxysporum）[9]和木賊鐮刀菌（F. equiseti）[10]，其原因可能是產(chǎn)地和來源不同，侵染的鐮刀菌或優(yōu)勢種不同所致。

串珠鐮刀菌是赤霉屬的重要植物病原真菌，可侵染農(nóng)作物、果樹、蔬菜、花卉等100 多種植物，引起根腐、莖腐、果腐等多種癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[25]。串珠鐮刀菌還可產(chǎn)生多種毒素，污染食品、飼料，危害人和動物健康和安全[26]。已有串珠鐮刀菌侵染蘋果[27]、西瓜[28]、香蕉[29]等的報道，而未見侵染火龍果的相關(guān)報道。本研究通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，將火龍果軟腐病病原菌ZYW18 確定為串珠鐮刀菌（F. verticillioides），為首次報道。菌株ZYW18 在PDA培養(yǎng)基常溫培養(yǎng)7 d ， 菌落直徑即可以達(dá)到80 mm，嚴(yán)重縮短火龍果的保鮮期。

在植物病害生防菌的研究和應(yīng)用中，放線菌因其資源豐富，拮抗活性次級代謝產(chǎn)物種類繁多，使其具有巨大的開發(fā)潛力。鏈霉菌屬（Streptomyces spp.）為放線菌科中最大的一個屬，在土壤、植物根際、根內(nèi)均有分布，是天然活性物質(zhì)的重要來源。鏈霉菌能夠產(chǎn)生多種抗生素和酶類，對病原菌具有拮抗作用[30-32]。另外，鏈霉菌還可以提高植物體內(nèi)抗性酶的活性，降低丙二醛含量，提升脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量，提高植物對外界環(huán)境的抗性[33]。張凱等[34]研究發(fā)現(xiàn)栗褐鏈霉菌（S. badius）對芒果炭疽病病原菌膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）具有較強的抑制作用，對染病果實有良好的防效。傅雁輝等[35]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌JD121 能增強柑橘抗病性，降低腐爛率，提高保鮮效果。而尚無利用放線菌，尤其是利用鏈霉菌對火龍果軟腐病進(jìn)行生物防治的相關(guān)報道。本研究篩選得到鏈霉菌LWL1827，經(jīng)平板抑菌試驗發(fā)現(xiàn)該菌株拮抗效果較好。將LWL1827發(fā)酵濾液經(jīng)不同濃度稀釋后處理火龍果，發(fā)現(xiàn)濃度為1∶10 的發(fā)酵濾液能降低火龍果軟腐病的病情指數(shù)，提高防治效果。同時，濃度為1∶10 的發(fā)酵濾液可以提高火龍果抗性酶活性，從而提高其抗病能力。本研究表明菌株LWL1827 及其發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以抑制病原菌的生長，同時可以提高火龍果抗性酶活力，使火龍果軟腐病病斑的發(fā)展得到控制，提高了火龍果對病原菌的抵抗能力，降低了病情指數(shù)，提高了防效。因此，可將濃度為1∶10 的LWL1827 發(fā)酵濾液噴涂于火龍果果實表面，作為火龍果儲藏期間軟腐病的防治措施。但因火龍果主要用于食用，拮抗菌LWL1827 及代謝產(chǎn)物的毒理學(xué)、生物安全性有待進(jìn)一步研究。平板抑菌試驗可以直觀地反映病原菌與拮抗菌的相互作用，表現(xiàn)拮抗菌抑菌能力的強弱，作為初步篩選的依據(jù)，但其忽視了拮抗菌-病原菌-植物三者的相互作用。通過火龍果接種試驗可以更全面地體現(xiàn)三者互作，更準(zhǔn)確地檢驗拮抗菌的拮抗能力。本研究利用拮抗菌發(fā)酵液對病情指數(shù)、防效和抗性酶活性的影響，體現(xiàn)了拮抗菌作用于病原菌和火龍果果實，對二者均產(chǎn)生作用。但拮抗菌、病原菌與火龍果間的互作機理有待進(jìn)一步研究。