白花重樓葉綠體基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

張書東 凌立貞 謝丹丹 劉禎珍

關(guān)鍵詞：白花重樓；重樓屬；藜蘆科；系統(tǒng)發(fā)育；葉綠體基因組

重樓原隸屬于百合科（Liliaceae），根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果，現(xiàn)歸屬于藜蘆科（Melanthiaceae），為重樓屬（Paris）植物的統(tǒng)稱，全球約有26種[1]，主要分布于我國的西南各省（區(qū)）。重樓具有重要的藥用價(jià)值，據(jù)記載，該屬11個(gè)物種（包括種下單位，下同）的根莖可作藥用，用于治療損傷、中毒、腮腺炎等多種疾病[2]，滇重樓（P.polyphyllavar.yunnanensis）和華重樓（P.polyphyllavar.chinensis）更是被收錄進(jìn)2020年版的《中國藥典》[3]。

白花重樓（P.polyphyllavar.alba）為七葉一枝花（P.polyphylla）的一個(gè)變種，主要分布于我國西南地區(qū)的云南、貴州、四川、重慶以及湖北等地[4-5]。白花重樓以根莖入藥，用于治療慢性氣管炎、胃痛、扁桃體炎、腮腺炎、乳腺炎、毒蟲咬傷和瘡瘍毒腫等病癥[6]。近年來由于企業(yè)對重樓原料藥需求量逐漸上漲，野生重樓遭到掠奪式采挖，致使部分未記錄有藥用價(jià)值的重樓屬植物的野生資源也遭到嚴(yán)重破壞。根據(jù)最新發(fā)布的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》[7]，重樓屬除北重樓（P.verticillata）外均被列為國家二級重點(diǎn)保護(hù)植物，白花重樓同時(shí)還被《世界自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名錄》（IUCN）列為易危種。然而，到目前為止，有關(guān)白花重樓的研究還很少[8-10]。

為更好地開展白花重樓遺傳背景、種質(zhì)資源保護(hù)及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究，本研究對白花重樓進(jìn)行了全基因組建庫測序，從中篩選并組裝出完整的葉綠體基因組，并對白花重樓葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征及其在重樓屬的系統(tǒng)位置進(jìn)行了分析。

1材料與方法

1.1材料

采自云南省麗江市麗江高山植物園種質(zhì)資源圃（100°11′E，27°00′N）的白花重樓新鮮健康葉片裝入取樣袋后立即加入變色硅膠進(jìn)行干燥，室溫保存。

1.2方法

1.2.1基因組總DNA的提取和全基因組測序取白花重樓硅膠干燥葉片，利用CTAB法[11]提取基因組總DNA。分別采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop-2000微量分光光度計(jì)檢測總DNA質(zhì)量和濃度。雙端高通量測序由北京諾禾致源科技股份有限公司的IlluminaHiSeqXTen平臺完成，測序總數(shù)據(jù)量為6Gb。

1.2.2葉綠體基因組的組裝與注釋利用SPAdesv3.6.1[12]以默認(rèn)參數(shù)對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝生成一系列contigs。利用Bandage[13]手動對生成的contigs進(jìn)行編輯，生成可靠的完整葉綠體基因組。以金線重樓（P.delavayi，登錄號：MN125581）為參考基因組，利用PGA[14]對序列進(jìn)行功能注釋。注釋后的完整葉綠體基因組數(shù)據(jù)提交至GenBank（登錄號：MW980523）。利用OGDRAW[15]在線工具（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/index.shtml）繪制白花重樓葉綠體基因組圖譜。

1.2.3葉綠體基因組特征分析利用Geneiousv8.0.2[16]讀取白花重樓基因組基本特征信息。利用REPuter[17]鑒定葉綠體基因組中的長重復(fù)序列，最小重復(fù)設(shè)置為30bp，最小重復(fù)序列長度距離設(shè)置為3。利用MISA[18]對白花重樓葉綠體基因組進(jìn)行微衛(wèi)星（simplesequencerepeats，SSR）位點(diǎn)檢測，參數(shù)閾值設(shè)置為單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基最少重復(fù)次數(shù)分別為10、5、5、5、5、5，2個(gè)SSR位點(diǎn)間最小距離設(shè)置為100bp。

1.2.4密碼子偏好性分析利用Geneiousv8.0.2[16]提取白花重樓葉綠體基因組蛋白質(zhì)編碼基因序列（codingsequence，CDS），并手工剔除一個(gè)IR區(qū)的重復(fù)序列和基因長度<300bp的序列。利用CodonW1.4.2在線軟件（http：//codonw.sourceforge.net/）分析以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG、TGA為終止密碼子的編碼基因的同義密碼子相對使用度（relativesynonymouscodonusage，RSCU）。RSCU是指某一特定密碼子在使用頻率與其無偏好性使用時(shí)預(yù)期頻率之間的比值[19]，當(dāng)RSCU>1時(shí)，表明該密碼子使用頻率較高；當(dāng)RSCU=1時(shí)，說明該密碼子無偏好性；當(dāng)RSCU<1時(shí)，表明該密碼子使用頻率較低。

1.2.5重樓屬葉綠體基因組比較分析利用Geneiousv8.0.2[16]讀取重樓屬已公布33個(gè)物種葉綠體基因組特征信息，對34個(gè)物種的基因組大小、基因數(shù)目、蛋白編碼基因數(shù)目、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA數(shù)目、核糖體RNA數(shù)目和GC含量進(jìn)行比較分析。

1.2.6系統(tǒng)發(fā)育分析為探討白花重樓的系統(tǒng)位置，從NCBI下載藜蘆科48個(gè)物種的葉綠體全基因組序列用于重建重樓屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，包括重樓屬33條，藜蘆屬（Veratrum）3條、白絲草屬（Chionographis）1條、沼紅花屬（Helonias）2條、延齡草屬（Trillium）6條、熊尾草屬（Xerophyllum）1條和丫蕊花屬（Ypsilandra）2條。根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果[20-22]，選擇藜蘆屬3個(gè)物種作為外類群。序列比對利用MAFFTv7.245[23]（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）完成。貝葉斯推論（Bayesianreference，BI）建樹時(shí)選擇的最佳替代模型依據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則（Akaikeinformationcriterion，AIC）利用Modeltest[24-25]計(jì)算。最大似然法（maximumlikelihood，ML）建樹時(shí)使用RAxMLv.8.2.11[26]完成，核苷酸替代模型設(shè)置為GTRGAMMA，1000次靴帶值估算各分支的支持率（bootstrap，BS）。貝葉斯推論建樹使用Mrbayes3.2.6[27]軟件完成，四條馬爾科夫－蒙特卡洛鏈（markovchainmontecarlo，MCMC）運(yùn)行50萬代，每100代取樣一次，當(dāng)數(shù)據(jù)達(dá)到收斂時(shí)，前25%的樣本作為老化樹被丟棄。剩余樣本生成50%的多數(shù)一致樹（50%majority-ruleconsensustree），并生成各分支的后驗(yàn)概率（posteriorprobability，PP）。

2結(jié)果與分析

2.1白花重樓葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

去除接頭和低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后，白花重樓共獲得34225418條長度為150bp的序列（reads）。利用SPAdes軟件進(jìn)行組裝，Bandage手工編輯后得到白花重樓完整葉綠體基因組序列。結(jié)果表明，白花重樓葉綠體基因組總長度為163944bp，GC含量為37.1%（表1）?；蚪M呈雙鏈環(huán)狀，1個(gè)大單拷貝區(qū)（largesingle-copy，LSC）和1個(gè)小單拷貝區(qū)（smallsingle-copy，SSC）被1對反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)（invertedrepeats，IRs）分隔成典型的四分體結(jié)構(gòu)（圖1）。GC含量在4個(gè)區(qū)域存在明顯差異，IR區(qū)的GC含量最高（39.7%），其次是LSC區(qū)（35.7%）和SSC區(qū)（32.2%）（表1）。

2.2白花重樓葉綠體基因組基因功能及分類

利用PGA軟件注釋和手動校對后，白花重樓葉綠體基因組共注釋有134個(gè)基因，包括88個(gè)蛋白編碼基因、38個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）基因和8個(gè)核糖體RNA（rRNA）基因（圖1）。根據(jù)基因功能可以把它們分為4大類，分別是45個(gè)與光合作用相關(guān)的基因、74個(gè)與自我復(fù)制相關(guān)的基因、6個(gè)與蛋白編碼相關(guān)的其他基因，以及8個(gè)未知功能的蛋白質(zhì)基因（表2）。在這些基因中，有10個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（ndhB、rpl2、rpl22、rpl23、rps12、rps15、rps19、rps7、ycf1、ycf2）、7個(gè)tRNA基因（trnA-UGC、trnH-GUG、trnI-CAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC）和4個(gè)rRNA基因（rrn16S、rrn23S、rrn4.5S、rrn5S）位于反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)，為雙拷貝基因（表2）。白花重樓葉綠體基因組未注釋到拷貝數(shù)大于2的基因。白花重樓葉綠體基因共有23個(gè)基因含有內(nèi)含子，其中19個(gè)基因（包括11個(gè)蛋白編碼基因和8個(gè)tRNA基因）含有1個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（ycf3、clpP、rps12×2）含有2個(gè)內(nèi)含子（表2）。

2.3白花重樓長重復(fù)序列和SSR分析

長重復(fù)序列分析表明，白花重樓葉綠體基因組包括全部4種長重復(fù)序列，其中正向重復(fù)序列305條，反向重復(fù)序列21條，互補(bǔ)重復(fù)序列19條，回文重復(fù)序列300條，總長度為68889bp（表3）。除IR區(qū)外，重復(fù)長度范圍在30～152bp之間，主要集中在30、31、43、55、77bp（圖2）。簡單重復(fù)序列分析表明，白花重樓葉綠體基因組共檢測到97個(gè)SSR位點(diǎn)，其中單核苷酸重復(fù)基序66個(gè)，二核苷酸重復(fù)基序23個(gè)，三核苷酸重復(fù)基序4個(gè)，六核苷酸重復(fù)基序4個(gè)，未發(fā)現(xiàn)四核苷酸和五核苷酸重復(fù)基序（圖3）。SSR的類型以A/T為主，其次為AT/AT，分別有65個(gè)和18個(gè)，占檢測到的SSR數(shù)量的67.01%和18.56%（圖3）。進(jìn)一步在比對的49個(gè)藜蘆科葉綠體基因組數(shù)據(jù)矩陣（與系統(tǒng)發(fā)育分析取樣相同）中考察白花重樓97個(gè)SSR位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，（GGAAGA）5重復(fù)類型僅在白花重樓的葉綠體基因組中出現(xiàn)，可用于準(zhǔn)確鑒別白花重樓。

2.4白花重樓葉綠體基因組密碼子偏好性分析

白花重樓葉綠體基因組篩選出用于密碼子偏好性分析的50條CDS共有64個(gè)密碼子，其中61個(gè)密碼子編碼20種氨基酸，其余3個(gè)為終止密碼子。密碼子總使用頻次為20818次，其中編碼亮氨酸（Leu）的密碼子（UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG）使用頻次最高，為2076次，占總數(shù)的9.97%；編碼半胱氨酸（Cys）的密碼子使用頻次最低，為245次，占總數(shù)的1.18%。白花重樓葉綠體CDS中RSCU≤1的密碼子共34種，其中31種以G/C結(jié)尾；RSCU>1的密碼子共30種，其中29種以A/U結(jié)尾（圖4），表明白花重樓葉綠體基因組對A/U結(jié)尾密碼子的偏好性高于G/C結(jié)尾密碼子。

2.5重樓屬葉綠體基因組比較分析

將白花重樓與同屬其他33種植物葉綠體基因組進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，重樓屬植物葉綠體基因組的GC含量均在37%以上，基因組大小為155957～163944bp，注釋基因133～137個(gè)，除白花重樓（88個(gè)）外，蛋白編碼基因均為87個(gè)，tRNA基因?yàn)?8～42個(gè)，rRNA基因數(shù)量保守均為8個(gè)（表4）。白花重樓葉綠體基因組有2個(gè)完整的ycf1基因（圖1），因此擁有最大的葉綠體基因組序列長度。

2.6重樓屬葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

基于49條完整的葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的藜蘆科ML和BI系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）可見，重樓屬的34個(gè)種聚為一個(gè)分支，構(gòu)成一個(gè)單系類群（BS/PP=100/1.0）。延齡草屬與重樓屬親緣關(guān)系較近，構(gòu)成重樓屬的姐妹群。重樓屬可進(jìn)一步劃分為5個(gè)支持率很高的分支（BS/PP=100/1.0），分別對應(yīng)于5個(gè)組（蚤休組Sect.Euthyra、五指蓮組Sect.Axialis、黑籽組Sect.Thibeticae、日本重樓組Sect.Kinugasa和北重樓組Sect.Paris）。七葉一枝花的幾個(gè)變種均屬于蚤休組，但并不構(gòu)成一個(gè)單系群，其中白花重樓與毛重樓（P.mairei）具有較近的親緣關(guān)系（圖5）。

3討論

本研究通過高通量測序、生物信息學(xué)方法組裝和注釋獲得了白花重樓完整葉綠體基因組，其全長為163944bp，略長于該屬已報(bào)道物種的葉綠體基因組[28-29]，但與被子植物葉綠體基因組已有數(shù)據(jù)一致[30]。造成以上特征的原因是白花重樓一對IR區(qū)均較同屬其他物種的長（白花重樓33399bp，其他種小于28000bp）。白花重樓葉綠體基因組具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)LSC區(qū)，1個(gè)SSC區(qū)和2個(gè)IR區(qū)，其GC含量為37.1%，與已報(bào)道的該屬物種葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和GC含量相似，并且LSC區(qū)（35.7%）和SSC區(qū)（32.2%）的GC含量顯著低于IR區(qū)（39.7%），其原因與完全分布在IR區(qū)的8個(gè)GC含量較高的rRNA基因有關(guān)（均在48.5%以上）。白花重樓葉綠體基因組共編碼134個(gè)基因，包括88個(gè)蛋白編碼基因、38個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因。在重樓屬已報(bào)道的葉綠體基因組中，蛋白編碼基因和rRNAs是非常保守的，但tRNAs的數(shù)目在物種間存在差異，盡管uniquetRNAs的數(shù)目都是30個(gè)。ycf1基因是葉綠體基因組中第二長的基因且存于大多數(shù)植物葉綠體基因組中[31]，但通常只有一個(gè)拷貝，白花重樓因?yàn)镮R區(qū)的擴(kuò)張導(dǎo)致注釋出2個(gè)完整的ycf1基因（均全部位于反向重復(fù)區(qū)），從而使其比同屬其他種多出1個(gè)蛋白編碼基因。

白花重樓葉綠體基因組共檢測到645條長重復(fù)序列，包括了全部4種重復(fù)類型，但以正向重復(fù)比例最高，其次是回文重復(fù)、反向重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)比例較低，這與其他重樓屬物種一致，而與同科其他屬物種的結(jié)果不同（未發(fā)表），說明物種的親緣關(guān)系與長重復(fù)序列的種類及數(shù)量存在一定的相關(guān)性。白花重樓葉綠體基因組97個(gè)SSR位點(diǎn)以單核苷酸和二核苷酸SSR為主，且含有較高的AT含量，與前人報(bào)道的植物葉綠體基因組中SSR位點(diǎn)多以A/T堿基出現(xiàn)相符。這些重復(fù)序列可為重樓屬物種遺傳多樣性研究及物種和產(chǎn)品鑒定提供一定的參考信息。密碼子偏好性是物種在長期的進(jìn)化過程中受外界環(huán)境和內(nèi)部因素共同作用的結(jié)果，密碼子偏好性分析可為研究生物進(jìn)化、蛋白結(jié)構(gòu)、基因功能和外源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯提供理論依據(jù)。本研究分析表明，亮氨酸（Leu）是白花重樓葉綠體基因組中占比最高的氨基酸，并且RSCU>1的30種密碼子均以A/U結(jié)尾，這與之前發(fā)表的重樓屬植物基本相似[32-33]。

基于葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，重樓屬分為5個(gè)主要分支，分別對應(yīng)蚤休組、五指蓮組、黑籽組、日本重樓和北重樓組，這與最新的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果一致[28-29]，但與基于形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果存在一定的分歧。本研究對七葉一枝花的6個(gè)變種的系統(tǒng)位置進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示七葉一枝花的所有變種均位于蚤休組，但并不構(gòu)成一個(gè)單系群，白花重樓與毛重樓具有較近的親緣關(guān)系?；诂F(xiàn)有的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果，七葉一枝花種下的各分類單元需進(jìn)一步的分類修訂。