食品中金黃葡萄球菌的檢測方法研究

徐愛民，郭國棟，何曉軍

（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤 274000）

金黃葡萄球菌是革蘭陽性菌，廣泛存在于空氣、水體、人與動物的排泄物中，很容易污染肉、蛋、奶等食物。其引起的食物中毒現(xiàn)象，是一個世界性的衛(wèi)生問題[1]。近年來，隨著人們生活節(jié)奏的加快，快餐成為一種常見的用餐方式，與此同時人們更加關(guān)注食品安全問題。根據(jù)不同的食品種類，選擇合適的檢測技術(shù)方法，既能保證檢測結(jié)果的準確性，又能提高效率、有效控制成本，是從業(yè)人員的重要研究課題。本文結(jié)合筆者實踐經(jīng)驗和現(xiàn)有研究成果，對食品中金黃葡萄球菌的檢測方法進行綜述。

1 金黃葡萄球菌概述

1.1 金黃葡萄球菌的特點

金黃葡萄球菌多為球狀或橢圓狀，一般聚集排列成葡萄串，可產(chǎn)生黃色的脂溶性色素。它對熱、鹽、干燥均有較強的抵抗能力，在80 ℃下可存活 30 min，在10%的氯化鈉溶液中可長期存活并繁殖，在干燥的膿液、痰液中可存活2 ～3 個月。金黃葡萄球菌一般分為A、B、C、D、E 這5 個類型，以A型腸毒素引起的中毒最為多見[2]。

1.2 金黃葡萄球菌的危害

正常情況下，機體可在一定程度上抵抗金黃葡萄球菌感染；但當皮膚黏膜受損、機體免疫力降低時，病原侵入機體就會產(chǎn)生危害。一類是侵襲性疾病，以組織感染為特征，常見如皮膚感染、傷口化膿、內(nèi)臟器官感染、敗血癥等。另一類是毒素性疾病，以食物中毒、毒素休克綜合征為特征，常見如急性胃腸炎、高熱、腹瀉、皮疹等。對此，《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》（GB 29921——2013）中，明確規(guī)定了金黃葡萄球菌在8 大類食品中的檢測限量。

1.3 金黃葡萄球菌的耐藥性

隨著細菌感染引起的疾病越來越多，臨床上對于抗生素的使用不合理，導致耐藥性的產(chǎn)生。相關(guān)研究證實，金黃葡萄球菌對多種抗生素具有耐藥性，較為常見且嚴重的是耐甲氧西林金黃葡萄球菌、耐萬古霉素金黃葡萄球菌[3]。

2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

《食品安全國家標準 食品微生物學檢 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10——2016）中規(guī)定傳統(tǒng)培養(yǎng)法是金黃葡萄球菌檢測的國家強制標準，可實現(xiàn)定性與定量檢測。該方法雖然成本低廉，但檢驗操作復雜，整個檢驗周期長，需要5 d 左右才能得到檢驗結(jié)果。區(qū)楚君等[4]以冷凍肉及肉制品為對象，針對傳統(tǒng)培養(yǎng)法受雜菌干擾導致假陰性較高的問題，對分離方法進行改進，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的分離率從2.61%提高至19.98%，有效避免了假陰性現(xiàn)象的發(fā)生。

3 免疫學方法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

3.1 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗是使用有抗體的彩色乳膠顆粒，對金黃葡萄球菌細胞懸液進行檢測，若懸液中有特異性抗原，就會發(fā)生凝集或沉淀。該試驗方法的優(yōu)點是操作簡單、反應(yīng)快速，缺點是靈敏度不高，需在檢測前進行增菌處理。以法國生物梅里埃公司為例，對樣品進行24 h 增菌處理，只需20 s 就能得到陽性或陰性結(jié)果。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法在食品檢測領(lǐng)域的適用范圍廣、技術(shù)成熟。其原理是利用固相載體上的抗體，捕捉樣本中的抗原，加入酶標抗體后，形成抗體-抗原-抗體復合物；最后加入顯色底物反應(yīng)后，用肉眼觀察并使用酶標儀判定。該方法的靈敏度不高，需在檢測前進行增菌處理。時玉菲等[5]針對金黃色葡萄球菌A 型腸毒素，使用單克隆抗體作為捕獲抗體，抗SEA 兔多抗血清作為檢測抗體，建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，檢測下限為1.89 μg·L-1，回收率為94%～114%，變異系數(shù)小于10%。

3.3 免疫層析檢測

免疫層析檢測利用毛細原理，在硝酸纖維素膜上固定抗體，干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品溶液中，樣品沿著毛細管移動，移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中的抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，根據(jù)顏色變化達到特異性檢測目標。該方法的檢測速度快，結(jié)果準確性較高。布日額等[6]建立牛乳中金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析檢測方法，結(jié)果顯示最低檢出限為1.0×105CFU·mL-1，分離鑒定符合率在83.3%～90.0%，具有操作簡單、快捷、穩(wěn)定等優(yōu)點。

4 分子生物學在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

4.1 PCR 技術(shù)

PCR 即聚合酶鏈式反應(yīng)，具有快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點。由于食品成分較為復雜，加工過程中可能破壞DNA，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。對此，通過技術(shù)創(chuàng)新可彌補這一缺陷，如實時熒光定量PCR、微滴式數(shù)字PCR、多重PCR 等。滕要輝等[7]以速凍食品為對象，針對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌建立了多重PCR 檢測方法，結(jié)果特異性為100%，可檢出菌落數(shù)低于100 CFU·g-1的菌群。

4.2 LAMP 技術(shù)

LAMP 即DNA 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，適用于基因診斷，顯著特點是反應(yīng)時間短、靈敏度高。郭建平等[8]采用LAMP 技術(shù)，基于顏色判定對金黃色葡萄球菌進行檢測，結(jié)果表明基因組靈敏度達到 0.01 fg·μL-1，菌落靈敏度達到1.9 CFU·mL-1，不僅可靠性和特異性良好，而且不需要特殊設(shè)備。

4.3 RPA 技術(shù)

RPA 即重組酶聚合酶恒溫擴增技術(shù)，它主要依賴于3 種酶：①能與單鏈核酸結(jié)合的重組酶；②鏈置換DNA 聚合酶；③單鏈DNA 結(jié)合蛋白，最佳反應(yīng)溫度是37 ℃。該檢測技術(shù)的優(yōu)點包括：①常溫下檢測，不需要熱循環(huán)，對儀器設(shè)備要求低；②僅需少量核酸分子，在3 ～10 min 即可完成檢測任務(wù)，且一個人就能完成操作過程；③能在同一個管中，同時進行多個擴增反應(yīng)；④靈敏度高，可滿足定量檢測要求。在市場應(yīng)用方面，英國TwistDX 公司研發(fā)的TwistAmp 產(chǎn)品，可在常溫下完成檢測，用時在15 min 以內(nèi)，尤其適用于食品安全、生物安全、體外診斷、獸醫(yī)以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[9]。

4.4 SAT 技術(shù)

SAT 即實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)，它的標靶和擴增產(chǎn)物均是RNA，整個反應(yīng)時間較短，熒光信號經(jīng)熒光檢測儀器實時捕獲，可實時反映擴增循環(huán)情況。李桂金等[10]采用SAT 法檢測食品中的金黃色葡萄球菌，并對檢測能力進行評價，結(jié)果顯示純培養(yǎng)物檢出限為103CFU·mL-1，靈敏度為100%，假陰性率為0%，假陽性率為2.9%，各項結(jié)果均達標。

4.5 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)利用核苷酸堿基順序互補的原理，對DNA 或RNA 片段進行標記，檢測樣本中某個特定微生物的核苷酸順序。不同微生物的基因序列不同，因此該檢測技術(shù)具有先進性。然而，食品中金黃葡萄球菌的含量少，一般不直接采用核酸探針檢查，目前只有少數(shù)公司在研究推廣該技術(shù)。例如，美國GEN-Probe 公司研制的AccuProbe 試劑，可在72 h 內(nèi)對食品中的金黃葡萄球菌進行檢測。

5 快速檢測法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

傳統(tǒng)培養(yǎng)法是金黃葡萄球菌檢測的國家強制標準，可實現(xiàn)定性與定量檢測。但是，食品檢測具有工作量大、范圍廣的特點，傳統(tǒng)培養(yǎng)法在操作方法和檢測周期上不具有優(yōu)勢，不能滿足實際檢測需求。對此，相關(guān)企業(yè)和從業(yè)人員對傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行優(yōu)化改良，形成快速檢測技術(shù)，以顯色培養(yǎng)基法、鑒別培養(yǎng)基法、紙片法為代表，具有操作簡單、成本低廉、快速準確的優(yōu)點。

5.1 顯色培養(yǎng)基法

顯色培養(yǎng)基法是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶，加入顯色底物后反應(yīng)顯色實現(xiàn)檢測效果，在特異性酶的作用下，通過觀察菌落的顏色對菌種進行鑒定，其特異性和靈敏度均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。周霞霞等[11]對金黃色葡萄球菌標準菌株、食品樣本分離菌株采用顯色培養(yǎng)基進行檢驗，并與國標法、微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)的檢驗結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示顯色培養(yǎng)基能快速鎖定疑似目標菌落，定量檢測與其他方法在計數(shù)值上無顯著性差異。

5.2 鑒別培養(yǎng)基法

鑒別培養(yǎng)基法是在培養(yǎng)基中加入試劑或化學藥品，不同微生物對這些成分的分解能力不同，指示劑對不同菌落顯示不同顏色，達到鑒別與區(qū)分的效果。法國生物梅里埃公司研制的Baird Parket+RPF 培養(yǎng)基，加入兔血漿，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，得到不透明的菌落即是金黃色葡萄球菌。仇華磊等[12]以導致奶牛發(fā)生乳腺炎的金黃色葡萄球菌為對象，在Bairdparker 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上選擇mBP 培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)液是否渾濁、產(chǎn)生黑色物質(zhì)，判斷奶樣中金黃色葡萄球菌對所試抗生素的敏感性。該方法簡單、快速，不需使用專門的設(shè)備，具有較高推廣價值。

5.3 紙片法

美國3M 公司生產(chǎn)的第2 代金黃色葡萄球菌快速檢測紙片，檢測過程包括兩個階段：第一階段使用改良后的B-P 培養(yǎng)基，含有金黃色葡萄球菌的樣本培養(yǎng)24 h 后，在紙片上呈現(xiàn)為暗紫色；第二階段若呈現(xiàn)為其他顏色，就使用含有顯色劑和DNA 的確認反應(yīng)片，1 ～3 h 后金黃色葡萄球菌形成粉紅色環(huán)，其他菌落不會形成，作為鑒別判斷依據(jù)。孫鑫澤等[13]的研究中，以乳制品、熟肉制品和方便食品為對象，對比紙片法和B-P 平板法對金黃色葡萄球菌的檢出率和用時，結(jié)果顯示兩種方法的檢出率無明顯差異，但紙片法檢測用時明顯縮短。

此外還有其他檢測技術(shù)，如生物素標記法、魯米諾信號化學發(fā)光法、BAX Q7 全自動病原菌檢測系統(tǒng)等[14]。

6 結(jié)語

綜上所述，食品衛(wèi)生安全直接關(guān)系到人體健康，金黃葡萄球菌檢測一直是食品檢測的一個重要項目。文章以傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學方法、分子生物學、快速檢測法為例，闡述了其在金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀。未來，快速檢測技術(shù)因操作簡單、成本低廉、方便快捷的優(yōu)點，具有良好的市場發(fā)展前景，將會成為一個重點發(fā)展方向。