基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討化濁行血湯抗高脂血癥的作用機(jī)制*

席加秋，邵玉澤，王中琳，2

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250355）

高脂血癥以總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，和/或高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低為特征[1]。高脂血癥能夠引發(fā)復(fù)雜的血管病變。在經(jīng)過血管內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞增生等病理環(huán)節(jié)后，血管壁逐漸增厚、狹窄，失去其應(yīng)有彈性，引發(fā)高血壓、冠心病、心肌梗死、腦梗死等多種心腦血管疾病。心腦血管疾病造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為人類主要死亡原因之一[2-3]。因此，對(duì)高脂血癥進(jìn)行有效干預(yù)是防治心腦血管疾病的重要舉措。目前，他汀類藥物被推薦為一線降脂藥[4]。但不容忽視的是，越來越多的證據(jù)表明，他汀藥物在降脂的同時(shí)能夠引發(fā)肌痛、橫紋肌溶解、肝腎毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)[5-6]。鑒于目前治療方法的局限性，尋找天然、有效的補(bǔ)充或替代策略逐漸成為治療高脂血癥的關(guān)注重點(diǎn)。

王新陸教授在《腦血辨證》一書中首次提出了“血濁”的概念。血濁指血液受各種因素影響，失去其清純狀態(tài)，或喪失其循行規(guī)律，影響臟腑氣機(jī)的病理現(xiàn)象，與高脂血癥的特點(diǎn)相契合[7-8]。王新陸教授認(rèn)為，運(yùn)氣不同，古今異軌，現(xiàn)代疾病譜的構(gòu)成已由過去感染、營(yíng)養(yǎng)不良等單因素疾病為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐詸C(jī)體自身代謝和調(diào)控失常導(dǎo)致的慢性非傳染性疾病為主。后者也被稱為“現(xiàn)代生活方式病”，由精神壓力增加，過食肥甘厚味，勞逸失度等因素誘發(fā)，與當(dāng)今物質(zhì)文明飛速發(fā)展息息相關(guān)?！把獫帷闭窃谶@一新的時(shí)代背景下應(yīng)運(yùn)而生的概念。對(duì)血濁狀態(tài)的干預(yù)能夠?qū)⑿哪X血管疾病的治療方向前移到“治未病”層面，若及渴而穿井，斗而鑄錐，則治療難度增大，且易出現(xiàn)后遺癥狀。因此，在血濁學(xué)術(shù)理論的指導(dǎo)下，王新陸教授創(chuàng)制了治療高脂血癥的化濁行血湯?；瘽嵝醒獪珊扇~、焦山楂、決明子、赤芍、酒大黃、路路通、虎杖、何首烏、水蛭粉9 味中藥組成。方中荷葉、決明子、焦山楂功善清化濁邪而無耗血傷陰之弊，共為君藥。水蛭粉、酒大黃、赤芍通行血脈，善消堅(jiān)積，助君藥清化血濁，共為臣藥。路路通利水除濁，兼通經(jīng)活絡(luò)，虎杖活血化濁，兼清血濁內(nèi)郁之熱，何首烏消脂通便，兼補(bǔ)濁邪內(nèi)耗之陰血，共為佐藥。諸藥合用，共奏化濁消脂，行血暢血之功。前期臨床研究已證明，化濁行血湯能夠有效降低高脂血癥患者的血脂水平，且未出現(xiàn)明顯的毒副作用[9]。目前，化濁行血湯抗高脂血癥的作用機(jī)制尚未闡明，故本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行科學(xué)預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為深入探究化濁行血湯抗高脂血癥的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠60 只，6 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）20190003。SD 大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)保持12 h 晝夜節(jié)律，溫度（25±2）℃，自由攝食飲水。本研究通過山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，審查編號(hào)：AWE-2019-042。

1.2 藥物及試劑 化濁行血湯：荷葉15 g，焦山楂10 g，決明子15 g，赤芍10 g，酒大黃10 g，路路通10 g，虎杖10 g，何首烏10 g，水蛭粉3 g，以上藥物浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮20 min 后取濾液，加水繼煮15 min 后再取濾液，兩次濾液合并，濃縮成質(zhì)量濃度為4 g/mL 的化濁行血湯水煎液，存于4 ℃冰箱備用（山東省中醫(yī)院藥劑科），辛伐他汀片20 mg/片（杭州默沙東制藥有限公司），高脂飼料：豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽酸鹽0.2%，基礎(chǔ)飼料78.8%（山東百朋生物科技有限公司），TG、TC、LDL-C、HDL-C 試劑盒（山東賽恩斯生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（山東思科捷生物技術(shù)有限公司），TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，No.9767），Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR Ⅱ（ACCURATE，No.AG11711），SYBR Green Premix Pro TaqHS qPCR Kit（ACCURATE，No.AG11701）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica，德國(guó)），熒光倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)），PRONTO EVOLUTION 全自動(dòng)生化分析儀（BPC Bio Sed，意大利），Nano Drop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），Light Cycler 480ⅡReal-time PCR 儀（Roche，瑞士）。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、化濁行血湯高劑量組、化濁行血湯中劑量組、化濁行血湯低劑量組、辛伐他汀組，每組10 只。對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，其余組給予高脂飼料喂養(yǎng)。8 周后目?jī)?nèi)眥靜脈叢取血，測(cè)得受試動(dòng)物血中TC、TG、LDL-C 顯著升高，確定高脂血癥模型復(fù)制成功。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的不同種類受試對(duì)象劑量換算方法，查詢?nèi)伺c大鼠間劑量換算系數(shù)及校正系數(shù)，計(jì)算得出180 g 大鼠每日用藥劑量是標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量成人每日用藥劑量的5.8 倍[10]，故化濁行血湯高、中、低劑量組每日給藥劑量分別為18、9、4.5 g/kg，辛伐他汀組每日給藥劑量為4 mg/kg，對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水5 mL/kg。連續(xù)灌胃8 周，每日1 次。

1.5 體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)測(cè)定 每?jī)芍軠y(cè)定1 次大鼠體質(zhì)量。末次給藥后，禁食不禁水12 h，予40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈取血8 mL，并在冰上迅速分離肝組織，使用預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，濾紙吸取多余水分，稱取肝臟濕質(zhì)量。稱量完畢后分裝速凍，存于-80 ℃冰箱備用。肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6 HE 染色 取部分分離的肝組織于4%多聚甲醛中固定，脫水包埋后將組織切片，厚度為5 μm，對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化處理，進(jìn)行HE 染色，脫水封片，光鏡下觀察肝臟的組織學(xué)變化。

1.7 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀，嚴(yán)格按試劑盒說明檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C 和HDL-C 含量。

1.8 化濁行血湯成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及中藥分子機(jī)制生物信息分析工具數(shù)據(jù)庫（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）預(yù)測(cè)荷葉、山楂、決明子、赤芍、大黃、水蛭、路路通、虎杖、何首烏九味藥物的化學(xué)成分及潛在靶點(diǎn)。TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選條件設(shè)置為口服生物利用度OB ≥30% ，且類藥性DL ≥0.18；BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫篩選條件設(shè)置為截?cái)嘀怠?0，P<0.05。應(yīng)用通用蛋白質(zhì)資源庫（UniProt，https：//www.uniprot.org）對(duì)靶點(diǎn)蛋白名進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.9 高脂血癥靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“高脂血癥”為檢索詞，應(yīng)用藥物銀行（Drugbank，https：//www.drugbank.ca）、疾病相關(guān)基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（DisGeNET，https：//www.disgenet.org）、比較毒理基因組數(shù)據(jù)庫（CTD，http：//ctdbase.org）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org）及遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov）查找高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)。應(yīng)用UniProt 數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)蛋白名進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.10 化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 首先，借助TBtools v0.5確定化濁行血湯與高脂血癥的交集靶點(diǎn)，交集靶點(diǎn)即為化濁行血湯抗高脂血癥的潛在靶點(diǎn)。查找交集靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)化濁行血湯的活性成分，構(gòu)建化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并借助Cytoscape3.7.2 插件cytoHubba 拓?fù)浠瘽嵝醒獪垢咧Y的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.11 基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 將化濁行血湯抗高脂血癥的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入基因注釋形象集成數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov），設(shè)置背景基因?yàn)椤癏omo sapiens”，P<0.05。利用R 語言工具包繪制生物過程、細(xì)胞組分、分子功能條形圖及通路高級(jí)氣泡圖。

1.12 RT-PCR 檢測(cè) 對(duì)肝組織樣本使用液氮研磨，使用Buffer RL 進(jìn)行裂解，按說明書要求提取總RNA，測(cè)定總RNA 濃度及完整性。將總RNA 按說明書要求，使用M-MLV RTase Enzyme MIX 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA 按說明書要求，使用2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃30 s（1 個(gè)循環(huán)）；定量分析95 ℃5 s，60 ℃30 s（40 個(gè)循環(huán)）；溶解曲線采集95 ℃5 s，60 ℃60 s，95 ℃酶瞬間滅活（1 個(gè)循環(huán)）；冷卻40 ℃30 s（1 個(gè)循環(huán)）。以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由山東賽恩斯生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequence used for RT-PCR analysis

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)的影響 各組大鼠間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)升高（P<0.01）。與模型組比較，辛伐他汀與化濁行血湯各劑量組均能降低高脂血癥大鼠肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)（P<0.05 或P<0.01）。見表2。

表2 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)的影響（±s）Tab.2 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on weight，hepatic wet weight，and liver index in hyperlipidemia rats（±s）

表2 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)的影響（±s）Tab.2 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on weight，hepatic wet weight，and liver index in hyperlipidemia rats（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

肝指數(shù)（%）對(duì)照組10-471.20±61.11 10.18±1.312.09±0.17模型組10-526.40±32.54 14.07±1.50** 2.67±0.15**辛伐他汀組102×10-3 479.70±66.95 10.88±1.15▲▲ 2.29±0.24▲▲化濁行血湯組1018.0 458.70±34.45 10.64±1.42▲▲ 2.32±0.25▲▲109.0 476.20±36.21 11.22±1.38▲▲ 2.35±0.15▲104.5 492.10±66.75 11.47±0.54▲▲ 2.36±0.29▲組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）體質(zhì)量（g）肝濕質(zhì)量（g）

2.2 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠TC，TG 及LDL-C水平升高（P<0.01），HDL-C 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，辛伐他汀與化濁行血湯各劑量組均能降低高脂血癥大鼠TC，TG 及LDL-C 水平，高中劑量化濁行血湯能夠升高大鼠HDL-C 水平（P<0.05 或P<0.01）。以上結(jié)果表明高中劑量化濁行血湯的降脂作用與辛伐他汀療效相當(dāng)（表3）。

表3 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（±s）Tab.3 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on lipid levels in hyperlipidemia rats（±s）

表3 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響（±s）Tab.3 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on lipid levels in hyperlipidemia rats（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與辛伐他汀組比較，##P<0.01。

組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）對(duì)照組10-0.97±0.070.53±0.160.33±0.030.97±0.18模型組10-1.61±0.03**1.94±0.16**0.67±0.03**0.85±0.11辛伐他汀組102×10-31.10±0.09▲▲0.89±0.15▲▲0.43±0.04▲▲0.80±0.09化濁行血湯組1018.01.16±0.06▲▲0.86±0.08▲▲0.51±0.05▲▲1.21±0.03▲▲##109.01.24±0.05▲1.00±0.20▲▲0.49±0.08▲▲1.12±0.03▲##104.51.38±0.07▲##1.20±0.07▲▲0.53±0.07▲1.02±0.08

2.3 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響 HE 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇缺失，肝細(xì)胞腫脹變性，內(nèi)部可見脂肪滴沉積，部分細(xì)胞核因脂滴擠壓而發(fā)生偏位。與模型組相比，化濁行血湯各劑量組和辛伐他汀組肝臟組織結(jié)構(gòu)排列較整齊，脂肪變性明顯減輕（圖1）。

圖1 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響（HE，×400）Fig.1 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on pathological and morphological changes of liver in hyperlipidemia rats（HE，×400）

2.4 化濁行血湯成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 化濁行血湯各中藥符合TCMSP 數(shù)據(jù)庫及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫篩選條件的化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)目如下：山楂2 個(gè)化學(xué)成分涉及25 個(gè)作用靶點(diǎn)，荷葉15 個(gè)化學(xué)成分涉及430 個(gè)作用靶點(diǎn)，決明子14 個(gè)化學(xué)成分涉及231 個(gè)作用靶點(diǎn)，赤芍29 個(gè)化學(xué)成分涉及218 個(gè)作用靶點(diǎn)，大黃16 個(gè)化學(xué)成分涉及183 個(gè)作用靶點(diǎn)，水蛭1 個(gè)化學(xué)成分涉及171 個(gè)作用靶點(diǎn)，虎杖10 個(gè)化學(xué)成分涉及294 個(gè)作用靶點(diǎn)，路路通4 個(gè)化學(xué)成分涉及110 個(gè)作用靶點(diǎn)，何首烏1 個(gè)化學(xué)成分涉及14 個(gè)作用靶點(diǎn)。經(jīng)去重處理后，化濁行血湯全方共涉及56 種化學(xué)成分，327 個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.5 高脂血癥靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在各疾病數(shù)據(jù)庫分別檢索得到高脂血癥靶點(diǎn)數(shù)目如下：Drugbank29 個(gè)、DisGeNET19 個(gè)、CTD33 個(gè)、OMIM50 個(gè)、GAD72 個(gè)。經(jīng)去重處理后，共獲取148 個(gè)高脂血癥作用靶點(diǎn)。

2.6 化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建韋恩圖獲取化濁行血湯與高脂血癥的交集靶點(diǎn)37 個(gè)（見OSID 標(biāo)識(shí)碼），交集靶點(diǎn)即為化濁行血湯抗高脂血癥的潛在治療靶點(diǎn)。37 個(gè)交集靶點(diǎn)涉及化濁行血湯37 種生物活性成分。應(yīng)用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見OSID 標(biāo)識(shí)碼）。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，菱形?jié)點(diǎn)代表中藥成分，degree 值越大，菱形節(jié)點(diǎn)越大。根據(jù)degree 值可知quercetin（槲皮素）的潛在靶點(diǎn)最多，其次為Crocetin（藏花酸）、kaempferol（山柰酚）、Stigmastero（l豆甾醇）、Physovenine（毒扁豆次堿）等（表4）。說明上述化學(xué)成分為化濁行血湯抗高脂血癥的關(guān)鍵成分。

表4 化濁行血湯抗高脂血癥的活性成分（degree 值排名前10）Tab.4 Active compounds of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia（top 10 of degree value）

2.7 化濁行血湯抗高脂血癥的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將37 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），該網(wǎng)絡(luò)包括36 個(gè)節(jié)點(diǎn)和157 條邊。借助Cytoscape3.7.2 插件cytoHubba 獲取排名前15 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包括15 個(gè)節(jié)點(diǎn)和77 條邊（圖2）。15 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)如下：胰島素（INS）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ABCA1）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管細(xì)胞黏附因子1（VCAM1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3）、氧磷酶1（PON1）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1（ABCG1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ （PPARG）、脂聯(lián)素（ADIPOQ）、肝X 受體α（NR1H3）、微粒體甘油三酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MTTP）、乙酰輔酶A 羧化酶（ACACA）、E 選擇素（SELE）、載脂蛋白A2（APOA2）。

圖2 化濁行血湯抗高脂血癥靶點(diǎn)蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia

2.8 GO 與KEGG 富集分析 將37 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 與KEGG 富集分析，結(jié)果表明化濁行血湯抗高脂血癥涉及152 個(gè)生物過程、23 個(gè)細(xì)胞組分、33 種分子功能、22 條作用通路。對(duì)P 值排名前10 的GO 條目及全部KEGG 通路進(jìn)行可視化處理（圖3、圖4）。其中，排名前3 的生物過程：GO：0010745 negative regulation of macrophage derived foam cell differentiation（對(duì)巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控）、GO：0010887 negative regulation of cholesterol storage（對(duì)膽固醇儲(chǔ)存的負(fù)調(diào)控）、GO：0010875 positive regulation of cholesterol efflux（對(duì)膽固醇外流的正調(diào)控）；細(xì)胞組分：GO：0043235 receptor complex（受體復(fù)合物）、GO：0045121 membrane raft（膜筏）、GO：0034366 spherical high-density lipoprotein particle（球形高密度脂蛋白顆粒）；分子功能：GO：0004879 RNA polymerase Ⅱtranscription factor activity，ligand -activated sequence -specific DNA binding（RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA 結(jié)合）、GO：0003707 steroid hormone receptor activity（類固醇激素受體活性）、GO：0008131 primary amine oxidase activity（初級(jí)胺氧化酶活性）；作用通路為：hsa03320：PPAR signaling pathway（PPAR 信號(hào)通路）、hsa04931：Insulin resistance（胰島素抵抗）、hsa04932：Non-alcoholic fatty liver disease（非酒精性脂肪肝）。

圖3 化濁行血湯抗高脂血癥的GO 功能富集分析Fig.3 GO functional annotation enrichment analyses of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia

圖4 化濁行血湯抗高脂血癥的KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analyses of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia

2.9 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠AdipoR2、PPARα、APOA2 mRNA 表達(dá)的影響 根據(jù)富集分析結(jié)果，PPAR 信號(hào)通路是富集程度最高的通路，ADIPOQ、APOA2、PPARα、PPARγ、NR1H3、PPARD、RXRA 是富集在該通路上的信號(hào)分子，其中ADIPOQ、APOA2、PPARα、PPARγ、NR1H3 是“2.4 化濁行血湯抗高脂血癥的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建”中鑒定出的關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此，初步篩選出以上5 個(gè)靶點(diǎn)為后續(xù)的研究指標(biāo)。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，ADIPOQ 發(fā)揮其生物學(xué)作用主要是通過與其受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)[11]，而AdipoR2 是肝臟中ADIPOQ 的主要受體[12]。研究證實(shí)，AdipoR2 為PPARα 上游信號(hào)分子，APOA2為PPARα 下游信號(hào)分子[12-13]，故本研究最終選取AdipoR2、PPARα、APOA2 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。與對(duì)照組比較，模型組大鼠AdipoR2、PPARα mRNA 表達(dá)下調(diào)（P<0.05 或P<0.01），APOA2 mRNA 與對(duì)照組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，化濁行血湯高劑量組及辛伐他汀組AdipoR2 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05 或P<0.01），化濁行血湯高中劑量組及辛伐他汀組PPARα mRNA 表達(dá)上調(diào)（P<0.01），化濁行血湯高中劑量組APOA2 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P<0.01），見表5。表明化濁行血湯改善脂代謝紊亂，減輕脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制可能與干預(yù)AdipoR2/PPARα/APOA2 信號(hào)通路相關(guān)。

表5 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA 水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on the expression of AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA in hyperlipidemia rats（±s）

表5 化濁行血湯對(duì)高脂血癥大鼠AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA 水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on the expression of AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA in hyperlipidemia rats（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別動(dòng)物數(shù)劑量（g/kg）AdipoR2PPARαAPOA2對(duì)照組10- 1.011±0.176 1.001±0.049 1.001±0.063模型組10- 0.677±0.078* 0.395±0.004** 0.788±0.161辛伐他汀組102×10-3 1.003±0.099▲ 1.537±0.038▲▲0.586±0.065化濁行血湯組1018.0 1.246±0.044▲▲1.523±0.037▲▲0.226±0.024▲▲109.0 0.636±0.028 1.073±0.064▲▲0.417±0.022▲▲104.5 0.457±0.013 0.449±0.007 0.610±0.057

3 討論

化濁行血湯是王新陸教授診病疏方五十余載，基于血濁學(xué)術(shù)理論創(chuàng)制的治療高脂血癥的經(jīng)驗(yàn)方。方中荷葉清香升散，利濕化濁；決明子“利五臟，除肝家熱”，通便祛濁；山楂入血分，善消肉食油膩之積，消積去濁，三藥合用，化濁邪，行血脈，共為君藥。赤芍清熱涼血，活血化瘀；大黃善入血分，泄下攻積；水蛭“性遲緩善入，遲緩則生血不傷，善入則堅(jiān)積易破”，三藥寓“見血之濁，知血當(dāng)滯，當(dāng)先行血”之意，通行血脈助君化濁，共為臣藥。虎杖清熱利濕化濁，尤善血濁郁而生熱者；路路通“通行十二經(jīng)穴”，引君臣藥直達(dá)病所；何首烏補(bǔ)肝腎、益精血，防瀉濁之品耗傷營(yíng)陰，3 味藥共為佐藥。9 味藥相伍，共奏化濁行血之功。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選得到槲皮素、藏花酸、山柰酚、豆甾醇等是化濁行血湯抗高脂血癥的關(guān)鍵活性成分。作為一種天然的黃酮類化合物，槲皮素具有確切的降脂作用[14]。研究表明，槲皮素能夠通過上調(diào)乙酰輔酶A 氧化酶（ACO）、乙酰輔酶A ?；D(zhuǎn)移酶（ACAT）等脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)脂質(zhì)分解代謝，并能通過抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP1c）、脂肪酸合酶（FAS）、羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）等脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)而減少脂質(zhì)的沉積[15-16]。藏花酸，又稱西紅花酸。有研究表明西紅花酸能夠降低高脂血癥動(dòng)物模型的TC 及TG 含量，其可能機(jī)制與選擇性抑制胰脂肪酶活性有關(guān)[17]。目前，關(guān)于山奈酚抗炎的作用特性研究較多。近年來，研究者逐漸關(guān)注到了山奈酚在調(diào)節(jié)脂代謝方面的作用。Alkhalidy 等[18]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)脂肪分解，改善胰島素敏感性和防止胰腺β 細(xì)胞功能障礙。豆甾醇則被證實(shí)能夠抑制TC 的吸收，減少內(nèi)源性TC 的合成[19-20]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，PPAR 信號(hào)通路為富集程度最高的通路。因此，筆者選擇富集在PPAR 信號(hào)通路上的關(guān)鍵信號(hào)分子ADIPOQ、PPARα、APOA2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。ADIPOQ 是一種由脂肪細(xì)胞分泌的內(nèi)源性生物多肽，能夠參與脂肪酸氧化、葡萄糖攝取和糖異生等多種生物過程，調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝[21]，而ADIPOQ 發(fā)揮其生物效應(yīng)主要是通過與ADIPOQ受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)[11]。因此，對(duì)ADIPOQ 受體表達(dá)情況的研究有助于更好地了解高脂血癥大鼠脂代謝紊亂的病理機(jī)制[22]。AdipoR2 是ADIPOQ 受體之一，主要表達(dá)于肝臟組織[12]。與經(jīng)典的7 層跨膜蛋白不同，AdipoR2 的羧基端位于細(xì)胞膜外，可與ADIPOQ 結(jié)合；氨基端位于細(xì)胞膜內(nèi)，可與信號(hào)接收蛋白結(jié)合[23-24]。當(dāng)AdipoR2 與ADIPOQ 結(jié)合，可以促進(jìn)脂肪酸β 氧化，改善脂代謝紊亂；同時(shí)，AdipoR2 又能與膜內(nèi)的PPARα 信號(hào)分子結(jié)合，從而激活PPARα 信號(hào)通路[12]。PPARs 是受配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠被內(nèi)源性脂肪酸及其代謝衍生物激活[25]，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。PPARα 是PPARs 家族中的一員，在維持肝臟脂肪酸代謝穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[26]。脂肪酸的氧化大部分發(fā)生在線粒體中，其他部分則是在過氧化物酶體中降解[27]。研究證明，激活的PPARα 能夠上調(diào)線粒體中電子傳遞鏈的組分，增加肝臟過氧化物酶體的豐度，從而能夠促進(jìn)脂肪酸的氧化利用[28-29]。此外，激活的PPARα 能夠與飽和及不飽和脂肪酸結(jié)合，增加其下游脂肪酸氧化基因的表達(dá)。APOA2 是PPARα 的下游靶基因之一，也是HDL 的主要成分，在指導(dǎo)脂代謝方面發(fā)揮重要作用[13，30]。HDL 顆粒主要由載脂蛋白、膽固醇、磷脂和少量脂肪酸組成。其中，組成HDL 顆粒的載脂蛋白主要是APOA1 和APOA2，分別占HDL 總蛋白成分的70%和20%[31-32]。APOA1 能夠與磷脂和非酯化游離膽固醇關(guān)聯(lián)，在ABCA1 的介導(dǎo)下形成前β-HDL，再經(jīng)卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)換酶（LCAT）的酯化，使游離膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，形成成熟的HDL[33-34]。誘導(dǎo)表達(dá)的APOA1 能夠增加循環(huán)血液中HDL 的水平，從而將外周組織中的TC 轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，最終以膽汁酸的形式排泄。這一過程又被稱為“膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)”（RCT）[35]。通過RCT 過程能夠?qū)崿F(xiàn)機(jī)體多余TC 的清除，減少TC 在動(dòng)脈壁的沉積，從而改善血脂紊亂，發(fā)揮心腦血管保護(hù)作用。HDL 因此被稱為“血管清道夫”[36]。APOA1 空間構(gòu)象的改變與HDL 結(jié)構(gòu)重塑和功能實(shí)現(xiàn)密切相關(guān)。目前雖然關(guān)于APOA2 的研究較少，但是已有研究表明APOA2 參與對(duì)APOA1 空間構(gòu)象的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致APOA1 依賴性eNOS 磷酸化減弱，NO 生成減少[37-38]。因此，APOA2含量變化將直接或間接影響HDL 清除TC 的能力，造成內(nèi)皮功能紊亂[39]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)，化濁行血湯抗高脂血癥的作用機(jī)制可能為通過槲皮素、藏花酸、山柰酚、豆甾醇等生物活性成分對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)INS、ABCA1、TNF、VCAM1、NOS3、PON1、ABCG1、PPARA、PPARG、ADIPOQ、NR1H3、MTTP、ACACA、SELE、APOA2 等進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、初級(jí)胺氧化酶活性等分子功能，在受體復(fù)合物、膜筏、球形高密度脂蛋白顆粒等細(xì)胞組分中參與對(duì)巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、對(duì)膽固醇儲(chǔ)存的負(fù)調(diào)控、對(duì)膽固醇外流的正調(diào)控等生物過程，以對(duì)PPAR、AMPK、PI3K-Akt等信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)，從而發(fā)揮改善脂代謝紊亂，減輕脂質(zhì)沉積的作用。對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，化濁行血湯能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥大鼠的TC，TG，LDL-C 的水平，升高HDL-C的水平，改善高脂血癥大鼠的肝臟病理損傷。RTPCR 結(jié)果顯示化濁行血湯能夠上調(diào)AdipoR2 及PPARα mRNA 的表達(dá)水平，下調(diào)APOA2 mRNA 的表達(dá)水平，表明化濁行血湯抗高脂血癥的機(jī)制可能與干預(yù)AdipoR2/PPARα/APOA2 信號(hào)通路相關(guān)。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從多成分-多靶點(diǎn)-多通路的角度對(duì)化濁行血湯抗高脂血癥的機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為后續(xù)深入探究化濁行血湯抗高脂血癥的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。