CRNDE介導(dǎo)miR-33a-5p/CDK6軸影響細胞周期調(diào)控人體肝癌細胞增殖的實驗研究

梅小平 姚明 周清河 許瀏 周鴻鯤 李彥

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率和死亡率高，是我國最常見的惡性腫瘤之一。HCC起病隱匿，早期多無典型癥狀，臨床發(fā)現(xiàn)時多已進入腫瘤中晚期，錯過了可行根治性手術(shù)的最佳時機。即便接受了手術(shù)切除，HCC患者5年生存率仍較低［1］。CRNDE（Colorectal neoplasia differentially expressed）具有組織表達特異性，參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程，是腫瘤的潛在治療靶點［2］。CDK6（cyclin-dependent kinase 6）是影響細胞周期的重要蛋白之一，CDK6過表達可通過多種方式促進HCC的增殖，是細胞信號傳導(dǎo)途徑中的“中心節(jié)點”［3］。通過生物信息學(xué)分析，作者發(fā)現(xiàn)miR-33a-5p與CRNDE及CDK6均有潛在的結(jié)合位點［4］。本研究通過探討CRNDE介導(dǎo)miR-33a-5p/CDK6軸影響細胞周期調(diào)控人體肝癌細胞增殖的作用機制，發(fā)現(xiàn)CRNDE能通過靶向調(diào)節(jié)作用抑制miR-33a-5p的表達，進而介導(dǎo)CDK6的升高，促進肝細胞肝癌的增殖，報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HL-7702人體肝細胞株和HuH-7人體肝癌細胞株均購于中國科學(xué)院上海細胞庫。細胞株按期進行傳代，維持指數(shù)生長。構(gòu)建穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達CRNDE人體肝癌細胞模型。正義鏈按5′→3′順序序列為：酶切位點（Xho I）、干擾序列（21bp）、loop環(huán)（TTCAAGAGA）、干擾序列的反向序列、終止信號（TTTTTT）；反義鏈按5′→3′順序序列為：酶切位點（BamH I）、終止序列的序列（AAAAAA）、干擾序列（21bp）、環(huán)路環(huán)的序列（TCTCTTGAA）和干擾序列的反向序列。

1.2 實驗分組 HL-7702人體肝細胞組、HuH-7人體肝癌細胞組及穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達CRNDE人體肝癌細胞shRNA-CRNDE-HuH-7組。

1.3 RT-qPCR及Western blotting檢測HL-7702細胞株、HuH-7細胞株 shRNA-CRNDE-HuH-細胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6 mRNA的表達情況 （1）細胞RNA提取和實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）：總RNA提取使用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix反應(yīng)系統(tǒng)。在PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，Ct值的獲取采用MJ Opticon Monitor2.5分析軟件進行計算，最后以GAPDH mRNA作為內(nèi)參進行標準化核算，計算標本中各RNA相對表達量。（2）Western blotting分析：總蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度，采用超敏型ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑對其進行顯色，使用UVP凝膠成像儀檢測其蛋白灰度并成像。

1.4 對HL-7702細胞株、HuH-7細胞株及shRNACRNDE-HuH-7細胞株分別進行細胞增殖實驗 CCK8（收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測在450 nm處 24 h、48 h、72 h OD值）；細胞凋亡檢測（收集細胞懸液，重懸于Binging Buffer，流式細胞儀檢測，NovoExpressTM分析軟件進行分析）；細胞侵襲測試（采用Transwell檢測，通過細胞血清饑餓、接種消化、染色等步驟后，顯微鏡觀察細胞數(shù)/視野）；細胞周期檢測（收集細胞懸液，加入碘化丙啶，通過流式細胞技術(shù)測量細胞DNA含量，確定每個細胞周期中細胞的比例，NovoExpressTM分析軟件進行分析）。通過上述方法評估在不同CRNDE表達情況下個別細胞株增殖、凋亡、侵襲能力及細胞周期的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達CRNDE人體肝癌細胞株構(gòu)建檢測 RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示：shRNA-CRNDEHuH-7細胞株中CRNDE表達量（1.081±0.141）相比HuH-7細胞株（3.014±0.361）減少，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1；Western blotting檢測結(jié)果同以上結(jié)論。由此說明穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達CRNDE的shRNA-CRNDE-HuH-7人體肝癌細胞株的構(gòu)建成功。

圖1 RT-qPCR檢測shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7組CRNDE基因表達

2.2 HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三組細胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6的表達情況及相關(guān)性分析 RT-qPCR檢測結(jié)果見表1；Western blotting檢測結(jié)果同以上結(jié)論，見圖2。當控制位點為CDK6時，HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三組細胞株中CRNDE表達量與其呈正相關(guān)（r=0.856，P＜0.05；）；當控制位點為miR-33a-5p時，三組細胞株中miR-33a-5p表達量與CDK6及CRNDE均呈負相關(guān)（r=-0.883，P＜0.05；r=-0.937，P＜0.05）。

表1 三組細胞株RT-qPCR 檢測結(jié)果分析（）

表1 三組細胞株RT-qPCR 檢測結(jié)果分析（）

組別CRNDEmiR-33a-5pCDK6 HL-77020.798±0.2133.014±0.3610.992±0.227 shRNA-CRNDE-HuH-71.081±0.1412.211±0.3431.981±0.276 HuH-73.014±0.3611.081±0.1413.021±0.303 t值2.7662.6982.031 P值0.0090.0090.027

圖2 Western blotting檢測三組細胞株CRNDE、miR-33a-5p及CDK6表達情況。

2.3 細胞增殖實驗 采用CCK8法分別檢測24 h、48 h、72 h OD值，繪制生長曲線，檢測結(jié)果顯示：HuH-7組細胞增殖能力顯著，shRNA-CRNDE-HuH-7細胞增殖能力明顯受到抑制，基本與HL-7702組細胞增殖曲線重合，見圖3A；shRNA-CRNDE-HuH-7組24 h、48 h及72 h相對OD值與HL-7702組接近，但明顯低于HuH-7組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 CCK8法檢測三組細胞聲勢浩大細胞增殖能力（*P＜0.05）

2.4 Transwell測定法檢測 shRNA-CRNDE-HuH-7細胞株遷移及侵襲能力，相比HuH-7組，shRNA-CRNDEHuH-7組細胞數(shù)明顯減少，基本接近于HL-7702組細胞數(shù)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明shRNACRNDE-HuH-7細胞株相比HuH-7細胞株遷移及侵襲能力明顯下降，見圖4。

圖4 Transwell 測定法檢測三組細胞株遷移及侵襲能力（*P＜0.05）

2.5 流式細胞儀檢測 三組細胞株凋亡率分別為：HL-7702組33.19%±6.14%，shRNA-CRNDE-HuH-7組23.26%±4.86%，HuH-7組14.21%±3.92%。通過單因素方差分析統(tǒng)計，三組細胞株凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=34.219，P＜0.001），表明三組間細胞計數(shù)差異不同或不完全相同，進一步組間兩兩比較q檢驗：三組細胞凋亡率在不同欄，表明P值均＜0.05，說明三組間細胞凋亡率兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。流式細胞儀檢測三組細胞株，觀察CRNDE低表達對肝癌細胞周期影響，結(jié)果顯示，shRNA-CRNDE-HuH-7組G1期細胞比例增加，S期和G2期細胞比例減少，相比HuH-7組有明顯差異（P＜0.05），見圖5，說明CRNDE低表達抑制了細胞從G1期向S期和G2期的轉(zhuǎn)變。

圖5 流式細胞儀檢測下調(diào)CRNDE對HuH-7細胞株細胞周期影響（*P＜0.05）

3 討論

CRNDE最早在結(jié)直腸惡性腫瘤的研究中被發(fā)現(xiàn)存在差異表達，可參與染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控［5］。隨著研究的進展，GRNDE被發(fā)現(xiàn)可通過多種方式調(diào)控腫瘤的進展，尤其是通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化狀態(tài)來影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，起到了促進腫瘤增殖的作用［6］。為探究CRNDE對人原發(fā)性肝癌細胞的影響，作者對人原發(fā)性肝癌細胞（Huh-7細胞株）CRNDE的表達進行RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)對比正常人體肝細胞（HL-7702細胞株），其表達量明顯增加。同時，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，沉默CRNDE的表達，作者構(gòu)建了CRNDE低表達的shRNA-CRNDE-HuH-7細胞株，發(fā)現(xiàn)其細胞的增殖、遷移及侵襲能力相比Huh-7細胞株明顯下降。以上結(jié)果均表明CRNDE在人體肝癌中的高表達，促進了腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。

為了進一步探究CRNDE促進肝癌增殖的機制及可能的下游靶基因，作者查閱相關(guān)文獻，ZHANG C等［7］通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-33a-5p可能是CRNDE及CDK6的潛在靶點。為了明確三者之間可能的關(guān)系，作者對其進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CRNDE的表達與CDK6呈正相關(guān)（P＜0.05），而miR-33a-5p與CDK6及CRNDE均存在顯著的負相關(guān)性（P＜0.05），從側(cè)面驗證了CRNDE可介導(dǎo)miR-33a-5p/CDK6軸的假說。

CDK6屬于細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）家族成員，是細胞周期調(diào)控機制的最核心成員之一［8］。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CDK6在惡性腫瘤中過表達并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，被稱為細胞信號傳導(dǎo)的“中心節(jié)點”。miRNA-33a是一種位于甾醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因（sequences of the sterol-response-element-binding protein gene，SREBF2）內(nèi)含子序列中的內(nèi)含子miRNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。WU等［9］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，miRNA-33a的下調(diào)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，其過表達可顯著降低細胞增殖和侵襲，抑制腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。HAN等［10］也發(fā)現(xiàn)，miRNA-33a-5p的下調(diào)與HCC轉(zhuǎn)移和生存不良顯著相關(guān)，低表達的miRNA-33a-5p預(yù)示較低的5年生存率及早期復(fù)發(fā)率。本研究結(jié)果也支持上述觀點，miRNA-33a-5p的表達在HL-7702、shRNACRNDE-HuH-7及HL-7702三組細胞株中逐漸下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而在CCK8、Transwell及流式細胞儀等檢測中，此三組細胞株的增殖、遷移、侵襲能力卻逐步增強，說明miRNA-33a-5p的低表達與人原發(fā)性肝癌的進展及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究中RT-qPCR及Western blotting結(jié)果顯示，Huh-7細胞株中miR-33a-5p為低表達，而通過慢病毒轉(zhuǎn)染CRNDE低表達的shRNA-CRNDE-HuH-7細胞株及HL-7702細胞株中miR-33a-5p的表達卻顯著上調(diào)（P＜0.05）。同時有研究［11］顯示，在人結(jié)直腸癌細胞雙熒光酶素實驗中，CRNDE與miR-33a-5p能有效結(jié)合，抑制腫瘤增殖，使野生型CRNDE結(jié)合的熒光信號顯著降低，這與本研究中通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染沉默Huh-7細胞株CRNDE的效果相同。為了進一步驗證 miR-33a-5p與CDK6 間存在靶向關(guān)系。本研究通過RT-qPCR及Western blotting檢測，結(jié)果顯示Huh-7細胞株中CDK6的表達顯著升高，而沉默CRNDE或過表達miR-33a-5p后的shRNA-CRNDE-HuH-7及HL-7702細胞株中CDK6的表達逐級下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明CRNDE是miRNA-33a-5p的上游基因，而CDK6處于CRNDE及miR-33a-5p的下游，且miR-33a-5p與CDK6間存在靶向關(guān)系。

綜上所述，CRNDE能通過靶向調(diào)節(jié)作用抑制miR-33a-5p的表達，進而介導(dǎo)CDK6的升高，可能通過CRNDE/miRNA-33a-5p/CDK6軸促進肝癌增殖，其腫瘤生物學(xué)行為主要表現(xiàn)在影響腫瘤細胞周期的增殖調(diào)控上。作者預(yù)測CRNDE很可能成為人體肝細胞肝癌新的腫瘤標志物和分子生物治療靶點。