苦參素對(duì)2 型糖尿病雄性大鼠生殖損傷及Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的影響*

楊芳，馬靜芬，鄭聰聰，韋志坤

（1.邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056008；2.邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲 056002）

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)（IDF）報(bào)告，2021 年全球糖尿病患者約5.37 億，預(yù)計(jì)2045 年將上升至7.83 億，其中2 型糖尿病（T2DM）患者占90%以上[1]。糖尿病會(huì)導(dǎo)致包括男性生殖損傷在內(nèi)的多種系統(tǒng)性健康問題，有研究報(bào)道糖尿病男性精子濃度與活力均明顯低于正常男性，損傷男性生殖功能，與空腹血糖呈負(fù)相關(guān)[2]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高血糖引起線粒體活性氧（ROS）過度生成導(dǎo)致氧化應(yīng)激，是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[3]。E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO-1）是參與調(diào)控氧化應(yīng)激的重要信號(hào)通路，研究證實(shí)，通過調(diào)控Nrf2/HO-1 信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激能夠改善糖尿病雄性大鼠生殖損傷[4]。

苦參素（OMT）又名氧化苦參堿，是由苦參根莖中提取的一類活性生物堿，具有較好的抗氧化、抗炎作用[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道OMT 能夠通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路減輕急性肝衰竭小鼠和肝硬化大鼠氧化應(yīng)激損傷[6-7]，并且能夠減輕糖尿病所致心肌組織損傷[8]。但OMT 能否通過抑制氧化應(yīng)激減輕糖尿病雄性大鼠生殖損傷尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過OMT干預(yù)T2DM 雄性大鼠模型，探討OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠生殖損傷及Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的影響，以期為臨床防治T2DM 男性患者生殖損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 53 只清潔級(jí)雄性SD 大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011，6 周齡，體質(zhì)量200～220 g。飼養(yǎng)于河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院，控制室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%、光暗各12 h 循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)通過邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批[HDZXYY（K）字2022-006]，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作嚴(yán)格遵循3R 原則。

1.2 藥物與試劑 OMT 片（規(guī)格：0.1 g/片）購自山東齊都藥業(yè)有限公司（批號(hào)：202203019）；二甲雙胍（Met，規(guī)格：0.25 g/片）購自北京中新藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：202204B03005）；鏈脲佐菌素（STZ）和比色法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：ST1668、S0109、S0051、S0131S）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)睪酮（T）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司（貨號(hào)：RXJ302700R、RX303076R、RX302805R）；ELISA 法檢測(cè)促性腺激素釋放激素（GnRH）試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、ECL 發(fā)光液購自南京建成生物工程研究所（貨號(hào)：H297、D006-1-1、W028-2-1）；總RNA 提取試劑TRIzol 購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號(hào)：R1100）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司（批號(hào)：013071205）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒購自日本Takara 公司（批號(hào)：RR651A）；RIPA 裂解液和Nrf2 抗體、p-Nrf2 抗體、HO-1 抗體、β-actin 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：C5028、bs-1074R、bs-2013R、bs-2075R、bs-0061R）；IgG 二抗和BCA 法蛋白定量試劑盒購自美國SantaCruz 公司（貨號(hào)：sc-2357、sc-14036）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備與給藥 53 只實(shí)驗(yàn)用大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)8 只設(shè)為正常（Normal）組，Normal組大鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。剩余45 只參照Rahimiyan-Heravan 等[9]報(bào)道的方法，通過高脂飲食（58%脂肪+17%蛋白質(zhì)+25%碳水化合物）喂養(yǎng)4 周，禁食12 h后35 mg/kg 腹腔注射STZ 制備T2DM 大鼠模型，注射STZ 1 周后檢測(cè)空腹血糖（FBG）水平>16.7 mmol/L即可判斷造模成功。共造模成功42 只大鼠，去除FBG 水平最低的2 只后，將剩余40 只成模大鼠隨機(jī)分為模型（Model）組、Met 組和OMT 低、中、高劑量組，每組8 只。Met 組每日1 次灌胃給藥200 mg/kg[10]，OMT 低、中、高劑量組分別每日1 次灌胃給藥25、50、100 mg/kg（參照人臨床使用劑量，根據(jù)大鼠與人劑量換算公式計(jì)算，OMT 低、中、高劑量組分別相當(dāng)于人臨床劑量的1/2 倍、1 倍、2 倍），Normal 組和Model 組每日1 次灌胃給予生理鹽水，療程4 周。

1.3.2 FBG 水平和血清T、GnRH、LH、FSH 含量檢測(cè) 治療完成后，禁食禁水12 h，經(jīng)尾靜脈取血并通過動(dòng)物血糖儀（JPS-5 型，北京怡成生物科技公司）檢測(cè)FBG 水平。麻醉后開腹、經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫靜置30 min 后2 000 r/min 離心（24D 型臺(tái)式離心機(jī)，深圳市賽泰克生物科技有限公司，離心半徑10 cm）5 min 取血清，遵照ELISA 試劑盒說明，通過酶標(biāo)儀（MB-530 型，深圳匯松科技公司）檢測(cè)血清T、GnRH、LH、FSH 含量。

1.3.3 睪丸質(zhì)量和睪丸體積測(cè)量 取左側(cè)睪丸，生理鹽水沖洗并拭干后稱其質(zhì)量；測(cè)量睪丸上下徑（L1）、前后徑（L2）和左右徑（L3），睪丸體積=π×L1×L2×L3/6。

1.3.4 HE 染色法觀察睪丸病理學(xué)改變及輸精管直徑（STD）和輸精管上皮厚度（TSE）測(cè)量 將測(cè)量后左側(cè)睪丸置于10%中性甲醛溶液中固定48 h，脫水、石蠟埋機(jī)（TEC 5 型組織包埋機(jī)，日本櫻花公司）、4 μm 厚度連續(xù)切片（RM-2135 型石蠟切片機(jī)，德國Leica 公司）、展片、烤片、脫蠟處理后，按照試劑盒操作說明進(jìn)行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡（CX41 型，日本Olympus 公司）下觀察睪丸病理學(xué)改變。在顯微鏡下，應(yīng)用目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量STD 和TSE，每只大鼠隨機(jī)取15 個(gè)輸精管進(jìn)行測(cè)量，取平均值。

1.3.5 精子數(shù)量、精子存活率和精子活力檢測(cè) 取大鼠右側(cè)附睪，加入37 ℃平衡鹽溶液1 mL 后剪碎，反復(fù)吹打使精子充分游離，取10 μL 上層液體加入37 ℃平衡鹽溶液稀釋至1 mL，通過精液分析儀（AS-CASA 型，俄羅斯ASL 公司）檢測(cè)精子數(shù)量和精子存活率。取1 滴新鮮精液和2 滴生理鹽水置于37 ℃載玻片上，在400 倍光學(xué)顯微鏡（CX41 型，日本Olympus 公司）下選取200 個(gè)以上精子進(jìn)行精子活力分級(jí)，參照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的精子活力分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：沿直線快速前進(jìn)為a 級(jí)，沿直線或曲線緩慢前進(jìn)為b 級(jí)，搖尾但不向前移動(dòng)為c 級(jí)，不搖尾且不移動(dòng)為d 級(jí)。

1.3.6 睪丸組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性和MDA 含量檢測(cè) 取右側(cè)睪丸部分組織，加入9 倍量（質(zhì)量比）4 ℃生理鹽水后研磨勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心（24D 型臺(tái)式離心機(jī)，深圳市賽泰克生物科技有限公司，離心半徑10 cm）10 min 取上清，采用比色法，通過分光光度計(jì)（ND2000C 型，美國Thermo 公司）檢測(cè)SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量。

1.3.7 睪丸組織Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取部分右側(cè)睪丸組織，TRIzol 法提取睪丸組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 作為模板進(jìn)行PCR（Quant Studio 5 型PCR 儀，美國ABI 公司）擴(kuò)增，擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃10 min 行預(yù)變性；95 ℃30 s、60 ℃30 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，運(yùn)用公式2-ΔΔCt計(jì)算Nrf2、HO-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列由北京擎科新業(yè)生物公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.8 睪丸組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取100 mg 右側(cè)睪丸組織，加入1 mL 4 ℃RIPA裂解液，組織剪碎后研磨勻漿，冰上靜置30 min，4 ℃12000 r/min 離心（CR22N 型高速低溫離心機(jī)，日本Hitachi 公司，離心半徑8 cm）30 min 取上清，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，各組均以30 μg 總蛋白量上樣行10%SDS-PAGE 凝膠電泳（1659001 型電泳儀，美國Bio-Rad 公司）、半干法轉(zhuǎn)至PVDF 膜（Turbo型轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad 公司）、5%蛋白封閉液37 ℃封閉2 h，洗膜后加一抗稀釋液Nrf2（1∶1 000）、p-Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后加二抗IgG 稀釋液（1∶2 000）37 ℃孵育1.5 h，洗膜后ECL 顯影，通過化學(xué)發(fā)光成像分析儀（Image Quant LAS4000 型，美國GE Healthcare 公司）拍照，通過Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間多重比較行LSD-t 檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Dunnett’T3 檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)），P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠FBG 水平的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠FBG 水平明顯升高（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT 低、中、高劑量組FBG 水平明顯降低（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組該作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met組比較，OMT 低、中劑量組FBG 水平明顯升高（P<0.05），OMT 高劑量組FBG 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠FBG 和血清T、GnRH、LH、FSH 水平的影響（±s）Tab.2 Effects of OMT on FBG and the level of T，GnRH，LH，F(xiàn)SH in serum of male rats with T2DM（±s）

表2 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠FBG 和血清T、GnRH、LH、FSH 水平的影響（±s）Tab.2 Effects of OMT on FBG and the level of T，GnRH，LH，F(xiàn)SH in serum of male rats with T2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

組別動(dòng)物數(shù)FBG（mmol/L）T（ng/mL）GnRH（pg/mL）LH（mIU/L）FSH（mIU/L）Normal 組84.81±0.692.88±0.35134.54±16.074.09±0.535.71±0.74 Model 組818.65±2.74*1.22±0.17*68.40±10.38*2.37±0.26*2.95±0.38*Met 組86.47±1.02#1.84±0.25#97.53±12.46#3.01±0.30#4.17±0.61#OMT 低劑量組814.19±2.36#△1.49±0.20#△80.24±11.73#△2.68±0.29#△3.22±0.43△OMT 中劑量組810.72±1.84#△▲2.12±0.26#△▲101.62±13.91#▲3.39±0.35#△▲4.38±0.62#▲OMT 高劑量組87.08±1.15#▲&2.46±0.31#△▲&119.57±17.04#△▲&3.86±0.42#△▲&5.50±0.78#△▲&

2.2 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠血清T、GnRH、LH、FSH 水平的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠血清T、GnRH、LH、FSH 水平明顯降低（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT 低、中、高劑量組T、GnRH、LH 水平明顯升高，Met 組和OMT 中、高劑量組FSH 水平明顯升高（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT 低劑量組T、GnRH、LH、FSH 水平明顯降低（P<0.05）；OMT 中劑量組T、LH 水平明顯升高（P<0.05），GnRH、FSH 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 高劑量組T、GnRH、LH、FSH 水平明顯升高（P<0.05）。見表2。

2.3 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸體積的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸體積明顯降低（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT 低、中、高劑量組睪丸質(zhì)量和睪丸體積明顯升高（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT低、中劑量組睪丸質(zhì)量和睪丸體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 高劑量組睪丸質(zhì)量和睪丸體積明顯升高（P<0.05）。見表3。

表3 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸體積的影響（±s）Tab.3 Effects of OMT on the mass and volume of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

表3 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸體積的影響（±s）Tab.3 Effects of OMT on the mass and volume of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

組別動(dòng)物數(shù)睪丸質(zhì)量（g）睪丸體積（cm3）Normal 組81.58±0.162.64±0.32 Model 組81.02±0.11*0.73±0.10*Met 組81.29±0.15#1.50±0.22#OMT 低劑量組81.16±0.12#1.29±0.18#OMT 中劑量組81.34±0.15#▲1.71±0.24#▲OMT 高劑量組81.55±0.17#△▲&2.30±0.29#△▲&

2.4 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織病理學(xué)改變及STD、TSE 的影響 Normal 組大鼠睪丸組織輸精管排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，精子發(fā)生正常。Model 組睪丸組織呈現(xiàn)輸精管萎縮、管腔直徑變窄、上皮厚度變薄，生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂，精原細(xì)胞退化、脫落、數(shù)量減少等病理學(xué)改變。與Model 組比較，Met 組和OMT 低、中、高劑量組睪丸組織病理學(xué)改變不同程度改善，OMT 低、中、高劑量組改善效果呈現(xiàn)劑量依賴性，OMT 高劑量組改善效果優(yōu)于Met 組。與Normal 組比較，Model 組大鼠睪丸組織STD、TSE 明顯降低（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT低、中、高劑量組STD、TSE 明顯升高（P<0.05），OMT低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT 低劑量組STD、TSE 明顯降低（P<0.05）；OMT 中劑量組STD 明顯升高（P<0.05），TSE 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 高劑量組STD、TSE 明顯升高（P<0.05）。見圖1、表4。

圖1 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織病理學(xué)改變的影響（HE 染色，×400）Fig.1 Effect of OMT on histopathological changes of testicular tissue in male rats with T2DM（HE staining，×400）

表4 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織STD、TSE 的影響（±s）Tab.4 Effects of OMT on the STD and TSE of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

表4 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織STD、TSE 的影響（±s）Tab.4 Effects of OMT on the STD and TSE of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

組別動(dòng)物數(shù)STD（μm）TSE（μm）Normal 組8201.64±12.7538.52±3.67 Model 組8 8量組8145.26± 8.69*27.43±2.24*Met 組168.49±10.14#33.76±3.05#OMT 低劑157.33± 9.85#△30.29±2.36#△OMT 中劑量組8180.51±11.13#△▲34.08±3.19#▲OMT 高劑量組8194.07±13.28#△▲& 38.25±3.71#△▲&

2.5 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠精子數(shù)量、精子存活率和精子活力的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠精子數(shù)量、精子存活率和（a+b）級(jí)活力精子明顯降低（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT低、中、高劑量組精子數(shù)量、精子存活率、（a+b）級(jí)活力精子明顯升高（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT 低劑量組精子數(shù)量明顯降低（P<0.05），精子存活率和（a+b）級(jí)活力精子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 中劑量組精子數(shù)量和精子存活率明顯升高（P<0.05），（a+b）級(jí)活力精子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 高劑量組精子數(shù)量、精子存活率和（a+b）級(jí)活力精子明顯升高（P<0.05）。見表5。

表5 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠精子數(shù)量、精子存活率和精子活力的影響（±s）Tab.5 Effects of OMT on sperm count，sperm survival rate and sperm motility in male rats with T2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

精子活力（%）a 級(jí)b 級(jí)c 級(jí)d 級(jí)（a+b）級(jí)Normal 組867.92±6.5780.86±8.4564.17±4.9328.05±2.324.36±0.253.42±0.2192.22±5.80 Model 組813.01±2.24*41.73±3.93*51.26±4.87* 21.18±1.64* 13.48±0.95*14.03±1.07*72.49±4.63*Met 組839.50±4.63#49.85±4.71#58.74±5.10#24.82±2.09#8.73±0.65#7.71±0.62#83.56±4.91#OMT 低劑量組827.24±3.18#△50.64±5.28#54.08±4.9525.06±2.33#8.24±0.70#13.22±1.14△78.54±4.86#OMT 中劑量組847.01±5.29#△▲ 59.17±5.54#△▲59.57±5.03#▲ 25.46±2.41#6.59±0.52#△▲8.38±0.70#▲85.03±5.27#▲OMT 高劑量組861.48±6.52#△▲& 71.08±6.46#△▲& 63.82±5.17#▲ 27.40±2.85#5.26±0.49#△▲& 3.52±0.29#△▲& 91.22±5.45#△▲&組別動(dòng)物數(shù)精子濃度（106 個(gè)/mL）精子存活率（%）

2.6 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織SOD、GSHPx 活性和MDA 含量的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠睪丸組織SOD、GSH-Px 活性明顯降低，MDA 含量明顯升高（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT 低、中、高劑量組SOD、GSH-Px 活性明顯升高，MDA 含量明顯降低（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT 低劑量組GSH-Px 活性明顯降低、MDA 含量明顯升高（P<0.05），SOD 活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 中劑量組SOD 活性明顯升高（P<0.05），GSH-Px 活性和MDA 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 高劑量組SOD 活性明顯升高、MDA 含量明顯降低（P<0.05），GSH-Px 活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表6。

表6 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織SOD、GSH-Px活性和MDA 含量的影響（±s）Tab.6 Effects of OMT on the activity of SOD，GSH-Px and the content of MDA of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

表6 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織SOD、GSH-Px活性和MDA 含量的影響（±s）Tab.6 Effects of OMT on the activity of SOD，GSH-Px and the content of MDA of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

MDA（nmol/mg pro）Normal 組856 829.15±7.31179.63±24.5020.08±2.73 Model 組.04±3.86*76.42±11.37* 38.49±5.50*Met 組839.15±5.02#153.80±23.15# 25.04±3.19#OMT 低劑量組837.47±4.68#106.52±18.36#△ 31.52±3.74#△OMT 中劑量組846.08±6.15#△▲ 137.84±20.72#▲ 25.79±3.26#▲OMT 高劑量組854.73±7.58#△▲& 168.11±25.03#▲& 22.36±2.91#△▲&組別動(dòng)物數(shù)SOD（U/mg pro）GSH-Px（U/mg pro）

2.7 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠睪丸組織Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT 低、中、高劑量組Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT 低劑量組Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)量明顯降低（P<0.05），OMT 中劑量組Nrf2、HO-1mRNA 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 高劑量組Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。見表7。

表7 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s）Tab.7 Effects of OMT on the mRNA expression of Nrf2 and HO-1 of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

表7 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s）Tab.7 Effects of OMT on the mRNA expression of Nrf2 and HO-1 of testicular tissue in male rats with T2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

組別動(dòng)物數(shù)Nrf2/GAPDHHO-1/GAPDH Normal 組81.35±0.231.62±0.29 Model 組80.2 80.8量組80.5量組80.86±0.05*0.38±0.07*Met 組8±0.17#0.97±0.18#OMT 低劑7±0.11#△0.64±0.12#△OMT 中劑4±0.16#▲1.03±0.20#▲OMT 高劑量組81.16±0.21#△▲&1.41±0.24#△▲&

2.8 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響 與Normal 組比較，Model 組大鼠睪丸組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1 表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。與Model 組比較，Met 組和OMT低、中、高劑量組Nrf2、p-Nrf2、HO-1 表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；OMT 低、中、高劑量組上述作用呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）。與Met 組比較，OMT 低劑量組Nrf2、p-Nrf2 表達(dá)量明顯降低，HO-1 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OMT 中、高劑量組Nrf2、p-Nrf2、HO-1 表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。見圖2、表8。

圖2 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of OMT on the protein expression of Nrf2，p-Nrf2，HO-1 of testicular tissue in male rats with T2DM

表8 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.8 Effects of OMT on the protein expression of Nrf2，p-Nrf2，HO-1oftesticulartissueinmaleratswithT2DM（±s）

表8 OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.8 Effects of OMT on the protein expression of Nrf2，p-Nrf2，HO-1oftesticulartissueinmaleratswithT2DM（±s）

注：與Normal 組比較，*P<0.05；與Model 組比較，#P<0.05；與Met 組比較，△P<0.05；與OMT 低劑量組比較，▲P<0.05；與OMT 中劑量組比較，&P<0.05。

組別Nrf2/β-actinp-Nrf2/β-actin HO-1/β-actin Normal 組0.98±0.180.48±0.070.45±0.10 Model 組0.16±0.03*0.11±0.02*0.08±0.02*Met 組0.31±0.06#0.18±0.03#0.20±0.04#OMT 低劑量組0.21±0.04#△0.14±0.03#△0.18±0.03#OMT 中劑量組0.40±0.08#△▲0.24±0.05#△▲0.28±0.06#△▲OMT 高劑量組0.58±0.12#△▲&0.37±0.06#△▲&0.39±0.07#△▲&

3 討論

糖尿病患者生殖損傷發(fā)病率是非糖尿病患者的5～10 倍，男性發(fā)病率高于女性[12]。隨著國家鼓勵(lì)生育政策相繼出臺(tái)，民眾生育欲望升高，糖尿病所致男性生殖損傷甚至不育成為亟待解決的健康問題。

睪丸是男性生殖系統(tǒng)主要器官，是T 分泌和精子生成的場(chǎng)所，其生理功能受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控。糖尿病可引發(fā)多器官并發(fā)癥，持續(xù)高血糖可導(dǎo)致睪丸萎縮、T 分泌減少、精子質(zhì)量降低，最終導(dǎo)致男性生殖功能受損甚至不育[13]。糖尿病患者中超過90%為T2DM，而T2DM 男性患者普遍存在生殖損傷。本研究采用高脂飲食結(jié)合注射STZ 損傷胰島β 細(xì)胞的方法構(gòu)建T2DM 雄性大鼠模型，該方法操作簡便、成功率高、重復(fù)性好，并且成模過程與人類T2DM 發(fā)病機(jī)制及病理特點(diǎn)相似，是國內(nèi)外普遍認(rèn)可的T2DM 動(dòng)物模型制備方法[14]。結(jié)果顯示，與正常組比較，T2DM 雄性大鼠FBG 水平明顯升高，血清T、GnRH、LH、FSH 含量水平明顯降低，睪丸質(zhì)量和睪丸體積明顯降低，睪丸組織呈現(xiàn)輸精管萎縮、生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂、精原細(xì)胞退化、脫落、數(shù)量減少等病理學(xué)改變，STD 和TSE 均明顯降低，與Sudirman等[10，15]報(bào)道一致；精子數(shù)量、精子存活率、（a+b）級(jí)活力精子明顯降低，與Heidari 等[16]報(bào)道一致；說明T2DM 雄性模型大鼠睪丸組織出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)和功能損傷，下丘腦-垂體-性腺軸功能受損。OMT 能夠劑量依賴性降低T2DM 雄性大鼠FBG 水平，提高血清T、GnRH、LH、FSH 含量水平，減輕睪丸萎縮和睪丸組織病變，提高精子質(zhì)量，并且OMT 高劑量組對(duì)除FBG 外其他指標(biāo)的作用均優(yōu)于Met 組，提示OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠生殖損傷及下丘腦-垂體-性腺軸功能具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是糖尿病所致生殖損傷等發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。高血糖引發(fā)線粒體過度生成ROS，致使SOD、GSH-Px 等內(nèi)源性抗氧化酶被過度消耗，破壞“ROS 生成-還原清除”平衡，ROS 蓄積而攻擊生物膜脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)并生成具有生物毒性的MDA，并且ROS 可破壞蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子結(jié)構(gòu)，造成氧化應(yīng)激損傷[17]。Nrf2 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。正常狀態(tài)下存在于細(xì)胞質(zhì)的Nrf2 通過Neh2 結(jié)構(gòu)域與其抑制劑Keap-1 結(jié)合而無生理活性[18]。ROS 可誘導(dǎo)Nrf2 磷酸化并促使“Nrf2-Keap-1”復(fù)合體解離，p-Nrf2 核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)SOD、GSH-Px 等抗氧化酶轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，提高ROS 還原清除能力，降低氧化應(yīng)激損傷[19]。Nrf2 下游靶蛋白HO-1 為血紅素降解限速酶，可促使血紅素降解生成膽綠素IX、CO、Fe2+等內(nèi)源性抗氧化劑[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，OMT 能夠劑量依賴性提高T2DM 雄性大鼠睪丸組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA 含量，提高Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)和Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)，并且OMT 高劑量組對(duì)除GSH-Px 外其他指標(biāo)的作用均優(yōu)于Met組，提示OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，可能與激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，OMT 對(duì)T2DM 雄性大鼠生殖損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激，改善下丘腦-垂體-性腺軸功能有關(guān)。本研究為OMT 用于防治T2DM 男性生殖損傷提供了理論依據(jù)。氧化應(yīng)激也是T2DM 雌性大鼠生殖損傷的重要機(jī)制[22-23]，因此OMT 可能對(duì)T2DM雌性大鼠生殖損傷也具有保護(hù)作用，但尚需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。