基于滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其在黃精屬資源分析中的應(yīng)用

錢(qián)麗華　嚴(yán)建立　吳曉疆　阮松林　尹舒雅　崔海瑞

摘要：本研究基于滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記并將其應(yīng)用于黃精屬資源分析。設(shè)計(jì)合成了45對(duì)SSR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，選擇其中20對(duì)SSR引物對(duì)75份黃精屬資源進(jìn)行分析。結(jié)果表明，共在46 416個(gè)Unigene中檢出含有二核苷酸～六核苷酸重復(fù)類型的SSR位點(diǎn)60 238個(gè)，序列SSR發(fā)生頻率為22.78%，平均分布距離約7.07 kb；SSR位點(diǎn)中的主導(dǎo)類型是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，分別占50.06%和34.89%。測(cè)試的45對(duì)SSR引物中有34 對(duì)（75.56%）可擴(kuò)增SSR條帶。篩選的20對(duì)引物共擴(kuò)增出153個(gè)條帶，多態(tài)率為98.69%，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶4.00～14.00個(gè)，平均7.65個(gè)，不同SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息含量為0.626～0.973，平均為0.870。75份材料的等位基因數(shù)和遺傳相似系數(shù)分別為7.00～52.00個(gè)和0.531～0.941，平均值分別為24.65個(gè)和0.689，顯示出豐富的遺傳多樣性?；赟SR標(biāo)記分析的聚類圖顯示，在遺傳相似系數(shù)0.666處可將供試材料分為4類，較好地反映了供試材料的分類歸屬。此外，還發(fā)現(xiàn)5份多花黃精材料具有特異性的SSR條帶擴(kuò)增或缺失，可作為不同多花黃精材料鑒定的重要分子依據(jù)。本研究開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性較高，能夠有效揭示黃精屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對(duì)于豐富黃精分子標(biāo)記種類、構(gòu)建遺傳圖譜、促進(jìn)種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與育種應(yīng)用、開(kāi)展特定性狀的輔助選擇等研究都具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：黃精；轉(zhuǎn)錄組；SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)；資源分析

中圖分類號(hào)：S567.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2023）05-1120-12

Development of simple sequence repeat （SSR） markers based on transcriptome sequences of Polygonatum kingianum and their application in analysis of Polygonatum germplasm resourcesQIAN Li-hua1，YAN Jian-li1，WU Xiao-jiang2，RUAN Song-lin1，YIN Shu-ya1，CUI Hai-rui2

（1.Hangzhou Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310024， China;2.Institute of Nuclear-Agricultural Sciences， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Abstract：In this study， simple sequence repeat （SSR） markers were developed based on transcriptome sequence data of Polygonatum kingianum and were utilized in germplasm resource analysis of Polygonatum. Forty-five pairs of SSR primers were designed and synthetized， then 20 of them were selected by PCR amplification verification test to analyse 75 Polygonatum resources. The results showed that， a total of 60 238 SSR loci including dinucleotide to hexanucleotide repeats were detected from 46 416 Unigenes in P. kingianum transcriptome， with an occurring frequency of 22.78% and an average distribution distance of 7.07 kb. Dinucleotide repeat and trinucleotide repeat were the dominant types， with frequencies of 50.06% and 34.89% of all SSRs， respectively. Among 45 pairs of SSR primers， 34 of them showed amplification ability， which accounted for 75.56%. A total of 153 bands were amplified by the selected 20 pairs of primers， with a polymorphism rate of 98.69%. Each pair of primer could amplify 4.00-14.00 bands， with an average of 7.65 bands. The polymorphic information content varied from 0.626 to 0.973 for different SSR markers， with an average value of 0.870. Number of allele genes and genetic similarity coefficients of 75 materials were 7.00-52.00 and 0.531-0.941 respectively， and the average values were respectively 24.65 and 0.689， which displayed rich genetic diversity. A dendrogram constructed based on SSR markers showed that， the test materials could be classified into four cluster groups with the genetic similarity coefficient of 0.666， which presented a good reflection of affiliation in taxonomy of tested Polygonatum materials. In addition， five P. cyrtonema materials showed specific present or absent SSR bands， which could be used as important molecular basis for identification of different materials. The SSR markers developed in this study were highly polymorphic and could be used to effectively reveal the genetic diversity of the Polygonatum germplasm resources. The markers are of great significance for enriching molecular marker types， constructing genetic linkage map， promoting the evaluation and breeding application of germplasm resources， and carrying out assisted selection of specific traits in Polygonatum.

Key words：Polygonatum;transcriptome;simple sequence repeat （SSR） marker development;resource analysis

黃精是多年生草本植物，屬百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum Mill），全世界有70余種，主要分布于北半球，分布地包括中國(guó)、朝鮮半島、俄羅斯、歐洲和北美等[1]。滇黃精（Polygonatum kingianum）、黃精（P. sibiricum）和多花黃精（P. cyrtonema）的根莖統(tǒng)稱為黃精，含有甾體皂苷類、多糖類、黃酮類、生物堿類等多種活性成分，在抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血糖血脂等方面具有重要的藥用價(jià)值[1-2]，作為藥食同源藥材，黃精在保健品、食品、日化領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。

種質(zhì)資源的鑒定與科學(xué)評(píng)價(jià)是合理利用遺傳資源和選育新品種的基礎(chǔ)。中國(guó)黃精屬種質(zhì)資源有30余種[3]，傳統(tǒng)的鑒別大多依據(jù)產(chǎn)地和形態(tài)，但因其植物形態(tài)上具有過(guò)渡性，生藥學(xué)性狀較相似，地理分布存在重疊性，種間也常伴有雜交現(xiàn)象而界限模糊，導(dǎo)致其分類和種的識(shí)別與鑒定十分困難，且存在爭(zhēng)議[4-6]。與傳統(tǒng)鑒別方法相比，DNA分子鑒定技術(shù)可在基因組水平上揭示植物存在差異的內(nèi)在遺傳本質(zhì)，因其客觀性與準(zhǔn)確性迅速成為傳統(tǒng)中藥鑒定的重要手段，并在黃精屬植物中得到了應(yīng)用[7-8]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）是指基因組中以幾個(gè)核苷酸（一般1～6個(gè)）為基本單位的重復(fù)序列重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA，其長(zhǎng)度具有高度變異性，是建立多態(tài)性DNA標(biāo)記的資源[9]，其種屬特異性強(qiáng)，在品種鑒別和育種中應(yīng)用很廣[10-11]。在黃精屬植物研究中，基于生物素富集法[12-13]、特異性長(zhǎng)度擴(kuò)增片段測(cè)序（SLAF-seq）[14]、基因組測(cè)序[15]、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[16-17]等不同策略，已開(kāi)發(fā)了一些SSR引物，分析了引物在黃精屬植物間的可轉(zhuǎn)移性[12-13]，并利用這些SSR標(biāo)記進(jìn)行了指紋圖譜構(gòu)建[16]和遺傳多樣性分析[14-15]。這些研究為黃精屬植物的準(zhǔn)確鑒別和進(jìn)一步開(kāi)展新品種選育奠定了基礎(chǔ)。

目前，黃精屬植物能夠利用的SSR 標(biāo)記數(shù)量較少，尚不能滿足相關(guān)遺傳研究與育種的實(shí)際需要[14，17]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)新崛起的全面快速獲取物種特定組織或器官在某狀態(tài)下的所有轉(zhuǎn)錄本信息的研究方法，在藥用植物研究中也得到了廣泛應(yīng)用[18-20]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)為SSR 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)。本研究對(duì)滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR位點(diǎn)與特征進(jìn)行挖掘和分析，開(kāi)發(fā)SSR 標(biāo)記并將其用于75份黃精屬植物資源的分析，以期為黃精屬種質(zhì)資源的合理利用與新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試黃精屬植物材料75份，均種植于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院黃精資源圃。其中多花黃精53份、黃精17份、長(zhǎng)梗黃精4份、川黃精1份（表1）。

1.2基因組 DNA 提取

取黃精幼嫩葉片，洗凈晾干后按每份100～200 mg放入1.5 ml離心管中，加液氮用組織研磨器（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品）在60 Hz頻率下磨至粉末狀，按DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品）操作說(shuō)明書(shū)提取DNA，采用微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司產(chǎn)品）測(cè)定DNA濃度，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量和完整性，-15 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3序列來(lái)源與SSR挖掘

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/474626）下載滇黃精（Polygonatum kingianum）鞭芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后組裝和拼接的Unigene序列，共203 772條，總長(zhǎng)度約426 Mb[21]。利用SSRIT軟件對(duì)這些序列按二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸至六核苷酸重復(fù)分別不少于6次、5次、4次的要求進(jìn)行SSR查找，對(duì)查找出的SRR相關(guān)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.4SSR引物設(shè)計(jì)與PCR

根據(jù)SSR相關(guān)信息統(tǒng)計(jì)和分析結(jié)果，參考重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率和重復(fù)次數(shù)，選擇部分SSR用PRIMER 3（http：//frodo.wi.mit.edu/）設(shè)計(jì)引物，引物由杭州擎科生物技術(shù)有限公司合成。

從參試樣品中隨機(jī)抽取10個(gè)樣本，將其DNA等量混合作為模板，并對(duì)引物進(jìn)行不同退火溫度（50～62 ℃）的PCR 測(cè)試。SSR-PCR反應(yīng)體系為：含7.5 μl的2×Taq Master Mix（北京百奧萊博科技有限公司產(chǎn)品）、1.0 μl DNA模板（約50 ng）、上下游引物各0.5 μl（終濃度0.4 μmol/L）和5.5 μl的超純水。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性45 s，適宜溫度退火45 s，72 ℃延伸45 s；72 ℃終延伸10 min。對(duì)75份黃精資源分析時(shí)PCR擴(kuò)增所采用的退火溫度為58 ℃。

混合模板測(cè)試引物時(shí)采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（AGE）檢測(cè)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。黃精資源分析時(shí)采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)樣量為1 μl，以110～120 V恒壓電泳約2.5 h，銀染檢測(cè)，掃描電泳圖譜并保存。

1.5擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)所擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜進(jìn)行條帶數(shù)量記錄（有記作1，無(wú)記作0），生成原始數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù) Botstein 等[22]描述的方法計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC值）。采用 NTSYS-pc 2.10 軟件分析數(shù)據(jù)，利用 SIMQUAL 程序計(jì)算各黃精材料間的遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類生成聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1滇黃精轉(zhuǎn)錄組 SSR的分布、頻率及特征

對(duì)滇黃精203 772條Unigene序列搜索后發(fā)現(xiàn)46 416條序列含有SSR位點(diǎn)（表2）。其中36 003條序列只含1個(gè)SSR位點(diǎn)，其他10 413條序列含有2個(gè)及以上的SSR位點(diǎn)，個(gè)別序列所含SSR位點(diǎn)數(shù)高達(dá)9個(gè)。

在滇黃精總長(zhǎng)度約426 Mb的轉(zhuǎn)錄組序列中共檢出60 238個(gè)SSR位點(diǎn)（表3），平均約7.07 kb檢測(cè)到1個(gè)SSR，序列發(fā)生頻率（含有SSR的序列數(shù)與序列總數(shù)之比）為22.78%，出現(xiàn)頻率（SSR總數(shù)與序列總數(shù)之比）為29.56%。

在檢出的SSR重復(fù)類型中，二核苷酸至六核苷酸重復(fù)均有出現(xiàn)，但頻率差異很大（表3）。其中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)占主導(dǎo)地位，出現(xiàn)頻率分別為14.80%和10.31%，分別占總SSR的50.06%和34.89%；四核苷酸至六核苷酸重復(fù)數(shù)量較少，出現(xiàn)頻率分別為2.02%、0.86%和1.57%， 分別占SSR總數(shù)的6.82%、2.90%和5.33%。

滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列中含有的SSR基元種類有262種，各基元重復(fù)次數(shù)為4～52次，基元越長(zhǎng)，重復(fù)次數(shù)越少（表4）。盡管四核苷酸至六核苷酸SSR發(fā)生頻率較低，但其基元的種類卻較多，占重復(fù)基元總數(shù)的94.7%；而占據(jù)主導(dǎo)地位的二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元種類則較少，僅占重復(fù)基元總數(shù)的5.3%。

在二核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率較高的依次是AG、AT、AC和CG，AG和 AT重復(fù)次數(shù)大多分布在6～12，而AC和CG則以6～9次重復(fù)為主（表5）。在三核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)較多的4種基元依次是AGG、AAG、AAT和ACG，占三核苷酸SSR的比例均在13.0%以上，其他6種基元出現(xiàn)的頻率較低，占三核苷酸SSR的比例為4.7%～8.1%。所有三核苷酸重復(fù)基元均以5～8次重復(fù)為主，重復(fù)次數(shù)在9次及以上的只占約3.2%。

2.2SSR引物篩選

根據(jù)滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列中SSR的挖掘結(jié)果，設(shè)計(jì)合成了45對(duì)引物（表6），并進(jìn)行溫度梯度PCR測(cè)試。經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，11對(duì)引物（PkSSR3、PkSSR12、PkSSR15、PkSSR16、PkSSR17、PkSSR19、PkSSR20、PkSSR34、PkSSR38、PkSSR42、PkSSR45）無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，其余34對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，可擴(kuò)增引物約占75.56%，其中31對(duì)引物擴(kuò)增出了預(yù)期大小的條帶，另外3對(duì)引物（PkSSR1、PkSSR13、PkSSR27）的擴(kuò)增產(chǎn)物大小大于預(yù)期長(zhǎng)度，圖1是部分引物的擴(kuò)增結(jié)果。

2.3SSR引物的多態(tài)性

選擇其中條帶清晰的20對(duì)SSR引物（表7）對(duì)75份參試材料進(jìn)行分析。20對(duì)引物共擴(kuò)增出153個(gè)條帶，多態(tài)性條帶151個(gè)，多態(tài)率為98.69%。不同SSR的擴(kuò)增條帶數(shù)為4.00～14.00個(gè)，平均7.65個(gè)，多態(tài)性條帶比率為87.50%～100.00%。不同SSR標(biāo)記分析所揭示的75份材料等位基因數(shù)為7.00～52.00個(gè)，平均24.65個(gè)。20個(gè)SSR標(biāo)記的PIC為0.626～0.973，大多在0.800以上，平均值為0.870。結(jié)果表明這些SSR標(biāo)記的多態(tài)性較高，對(duì)不同材料具有較強(qiáng)的鑒別能力。

2.4遺傳多樣性與親緣關(guān)系聚類分析

采用20個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)75份黃精材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有5份多花黃精材料出現(xiàn)特異性的SSR條帶擴(kuò)增或缺失（表8）。其中H-QDN-45和H-CA-1具有特異性擴(kuò)增條帶，分別來(lái)自標(biāo)記PkSSR31和PkSSR36，而H-QDN-49、H-QDN-43和H-HZ-4這3份材料則表現(xiàn)為特異性條帶缺失，缺失條帶分別來(lái)自標(biāo)記PkSSR5、PkSSR11、PkSSR41。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的這些特異性的SSR條帶擴(kuò)增和缺失可作為不同多花黃精材料鑒定的重要分子依據(jù)，也揭示了參試多花黃精材料遺傳的特異性。

經(jīng)聚類分析（圖2）發(fā)現(xiàn)：參試的75份材料的遺傳相似系數(shù)為0.531～0.941，大部分材料的遺傳相似系數(shù)為0.60～0.80，平均值約為0.689。其中以多花黃精H-CA-4（52號(hào)）與H-CA-4-2（53號(hào)）間的遺傳相似系數(shù)最高，這2個(gè)種源都來(lái)自淳安左口鄉(xiāng)同一個(gè)采集點(diǎn)，因采集時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者葉片背部顏色有一定差異而作為2個(gè)種源，實(shí)則為同一個(gè)種質(zhì)，而多花黃精H-QDN-38-2（32號(hào)）與長(zhǎng)梗黃精H-LA-3（75號(hào)）間遺傳相似系數(shù)最低。從結(jié)果來(lái)看，筆者發(fā)現(xiàn)多數(shù)材料之間具有一定的遺傳相似性，而少數(shù)材料之間遺傳差異較大，且遺傳相似系數(shù)變化范圍較大，說(shuō)明參試材料之間具有遺傳多樣性。

在遺傳相似系數(shù)約0.666處，可將參試材料劃分為4個(gè)類群：A和C均為單一種群，分別包含11份黃精和34份多花黃精，而B(niǎo)和D則為不同種混聚類群。其中，聚在B類的有16份材料，包括12份多花黃精和4份長(zhǎng)梗黃精，長(zhǎng)梗黃精在此類群中單獨(dú)歸入同一亞類；D類有14份材料，包括7份多花黃精、6份黃精和1份川黃精，且后兩者也歸入同一亞類。這一結(jié)果表明，聚類分析結(jié)果與種類歸屬符合度較好。

3討論與結(jié)論

前人研究結(jié)果表明，不同物種中SSR位點(diǎn)的分布和頻率不同。造成這種差異的原因有三個(gè)：一是物種遺傳基礎(chǔ)特異性， 有研究認(rèn)為SSR出現(xiàn)頻率隨著物種基因組變大而越來(lái)越低，與物種單拷貝DNA百分比之間存在高度顯著的正相關(guān)線性關(guān)系[23]；二是SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)（SSR重復(fù)類型及次數(shù)、長(zhǎng)度等）不同，統(tǒng)計(jì)的SSR發(fā)生頻率則相差較大；三是分析和統(tǒng)計(jì)的SSR序列數(shù)和類型等數(shù)據(jù)量不同。比如搜索的序列數(shù)可以從幾千到幾十萬(wàn)不等，統(tǒng)計(jì)的SSR類型也不盡相同，在黨參[24]、甘草[25]、黃秦艽[26]和厚樸[27]中統(tǒng)計(jì)的SSR數(shù)據(jù)中包含單核苷酸重復(fù)，而在杜仲[28]、多花黃精[17]以及本研究中統(tǒng)計(jì)的SSR則未包含單核苷酸重復(fù)。本研究共在46 416條序列中發(fā)現(xiàn)二核苷酸至六核苷酸SSR位點(diǎn)60 238個(gè)，序列發(fā)生頻率22.78%，平均分布頻率約1/7.07 kb。與模式植物水稻和擬南芥相比，滇黃精SSR發(fā)生頻率和分布頻率高于擬南芥，低于水稻[29]。與其他藥用植物相比，滇黃精序列SSR發(fā)生頻率高于杜仲（2.9%）[28]、丹參（3.79%）[30]、人參（7.3%）[31]和黨參（12.22%）[24]，但低于甘草（60.10%）[25]、黃秦艽（30.73%）[26]和厚樸（52.75%）[27]，平均分布頻率高于杜仲（1/26.13 kb）[28]、丹參（1/12.74 kb）[30]，但低于人參（1/5.80 kb）[31]、黨參（1/4.52 kb）[24]、甘草（1/3.23 kb）[25] 、黃秦艽（1/4.11 kb）[26]和厚樸（1/3.43 kb）[27]。與黃精屬植物相比，滇黃精SSR發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于多花黃精（9.73%），但分布頻率則略低于多花黃精（1/5.91 kb）[17]。

不同植物中SSR優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元的出現(xiàn)數(shù)量不同，這可能與其編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)時(shí)使用頻率有關(guān)，比如擬南芥[32]。理論上，在數(shù)量足夠且無(wú)偏倚的情況下，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)基元可能產(chǎn)生的種類分別有2種、4種、10種、33種、102種、350種[33]。本研究從滇黃精轉(zhuǎn)錄組中搜索出的SSR基元種類也較為豐富，共262種。二核苷酸和三核苷酸理論上的重復(fù)類型全部出現(xiàn)，但四核苷酸至六核苷酸只出現(xiàn)了理論上的一部分，說(shuō)明滇黃精轉(zhuǎn)錄組中 SSR也存在一定的偏倚性。在滇黃精轉(zhuǎn)錄組SSR中，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)是主要類型，分別占總SSR的50.06%和34.89%，這與多花黃精及大多數(shù)植物表達(dá)序列中 SSR 以二核苷酸、三核苷酸為主要類型相符[29，34]。從滇黃精占主導(dǎo)地位的二核苷酸、三核苷酸重復(fù)基元種類來(lái)看，二核苷酸重復(fù)基元以AG/CT最多， GC/CG 最少，種類與多花黃精相近，但三核苷酸重復(fù)基元種類滇黃精比多花黃精多出ACG/CGT和ACC/GGT 2種基元，且主要的2種基元AGG/CCT（2 145）與AAG/CTT（2 143）數(shù)量基本相近，而多花黃精中AGG/CCT則比AAG/CTT高出5.4%[17]，但均以AGG/CCT最多。而同樣是單子葉植物的小麥中卻以AAC/GTT居多，大麥、玉米、水稻和高粱則均以CCG/CGG為主要類型[29]。

基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中大量的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄組序列可開(kāi)發(fā)多種類型的分子標(biāo)記[35-36]，其中開(kāi)發(fā)較多和應(yīng)用廣泛的是SSR，也被稱為genic-SSR[10，37]。由于來(lái)自已知的表達(dá)基因序列，所以能夠更好地幫助挖掘植物重要性狀連鎖的基因，了解基因與表現(xiàn)型之間的聯(lián)系[38-39]。此外genic-SSR序列的兩端單拷貝序列保守性較高，具有較好的可轉(zhuǎn)移性[35-36，40]，可用于種內(nèi)甚至是種間的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。本研究中有24.4%的引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，這與多花黃精[17]、油菜[41]及茶樹(shù)[42]中的研究結(jié)果類似，這可能是滇黃精與多花黃精、長(zhǎng)梗黃精、川黃精對(duì)應(yīng)的序列存在差異導(dǎo)致引物同源性低、引物與模板不匹配或者跨越內(nèi)含子等原因造成的。

目前基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已對(duì)多花黃精和黃精開(kāi)發(fā)了genic-SSR標(biāo)記[16-17]，但數(shù)量有限且應(yīng)用甚少。王世強(qiáng)等[16]根據(jù)黃精轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定出黃精多糖代謝合成途徑中關(guān)鍵酶基因的SSR 位點(diǎn)，篩選出12對(duì)多態(tài)性豐富的SSR 引物，并應(yīng)用在32 份野生黃精資源的遺傳多樣性分析中， PIC平均為0.46，SSR標(biāo)記聚類結(jié)果能揭示供試材料之間的親緣關(guān)系。然而關(guān)于這12對(duì)引物的研究結(jié)果反映的只是不同材料多糖代謝的遺傳差異，難以用來(lái)全面評(píng)估材料間的遺傳多樣性。陳友吾等[17]通過(guò)對(duì)多花黃精轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)SSR 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率高，重復(fù)單元類型豐富，在測(cè)試的50對(duì)SSR引物中，有29對(duì)（58%）擴(kuò)增出符合預(yù)期的產(chǎn)物，但這些標(biāo)記尚未應(yīng)用于黃精屬植物的資源分析，其多態(tài)性還有待實(shí)際研究去評(píng)判。本研究在明確滇黃精轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中SSR位點(diǎn)信息和特征的基礎(chǔ)上，測(cè)試了45對(duì)SSR引物，有34對(duì)（75.6%）具有擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用其中20對(duì)引物對(duì)黃精、多花黃精、長(zhǎng)梗黃精及川黃精共75份資源進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)所測(cè)試的引物具有較高的多態(tài)性，PIC平均值達(dá)到0.870。聚類結(jié)果能夠反映參試材料的親緣關(guān)系，與分類歸屬具有較好的吻合度。SSR可擴(kuò)增引物比率和PIC均高于上述2篇文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道的結(jié)果，同時(shí)也證明根據(jù)滇黃精Unigene序列設(shè)計(jì)的SSR引物對(duì)黃精、多花黃精、長(zhǎng)梗黃精及川黃精均具有可轉(zhuǎn)移性。

綜上，本研究基于滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記，是對(duì)現(xiàn)有滇黃精轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進(jìn)一步發(fā)掘和利用；所建立的標(biāo)記對(duì)于豐富黃精屬植物分子標(biāo)記類型、構(gòu)建遺傳圖譜、促進(jìn)資源的評(píng)價(jià)與育種應(yīng)用、開(kāi)展特定性狀的輔助選擇等都具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZHAO P， ZHAO C C， LI X， et al. The genus Polygonatum： a review of ethnopharmacology， phytochemistry and pharmacology [J]. Journal of Ethnopharmacology， 2018， 214：274-291.

[2]張嬌，王元忠，楊維澤，等. 黃精屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2019， 44（10）： 1989-2008.

[3]中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì)．中國(guó)植物志（第15卷） ［M］． 北京： 科學(xué)出版社，1978： 58-82.

[4]王雨婷，劉婉瀅，沈舶寧 ，等. 黃精的本草考證[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2019，47（3）： 81-86.

[5]田啟建，趙致. 黃精屬植物種類識(shí)別及資源分布研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2007，21（1）：18-21.

[6]魏曉楠，郝鐵成，劉慶華，等.中藥鑒別方法與技術(shù)探究[J]. 中國(guó)野生植物資源，2018，37（4）：65-69.

[7]龍炳宏，蔣向輝，宋榮，等 . DNA條形碼在黃精屬藥用植物鑒定與遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2022，40（4）：533-543.

[8]石乃星，文國(guó)松，趙明富.黃精屬植物 DNA 分子鑒定技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2021，22（5）： 1209-1218.

[9]TAUTZ D. Hyper-variability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers[J]. Nucleic Acids Research， 1989， 17（16）： 6463-6471.

[10]VARSHNEY R K， GRANER A， SORRELLS M E. Genic microsatellite markers in plants： features and applications[J]. Trends in Biotechnology， 2005， 23（1）： 48-55.

[11]KALIA R K， RAII M K， KALIA S， et al. Microsatellite markers： an overview of the recent progress in plants[J]. Euphytica， 2011， 177（3）： 309-334.

[12]LIU T，CHENG W J，ZHOU S，et al．Eleven polymorphic microsatellite loci in Polygonatum umfilipes and cross—amplification in other congeneric species[J]．Conservation Genetics Resources，2010，2（S1）： 77-79．

[13]CHENG W J，LIU T T，WU H L，et al．Isolation and characterization of twelve polymorphic microsatellite loci in Polygonatum cyrtonema and cross—species amplification[J]．Conservation Genetics Resources ，2010，2：105-107.

[14]朱巧，鄧欣，張樹(shù)冰，等. 黃精屬 6 種植物的 SSR 遺傳差異分析[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2018，43（14）：2935-2943.

[15]WOOKJIN K，YUN-UI J，YOUNGMIN K，et al．Evaluation of genetic diversity of Polygonatum spp by the analysis of simple sequence repeat[J]．Korean Herb Medicine Informations，2014，2（2）： 41-47.

[16]王世強(qiáng)，王立儒，劉帥，等. 基于 SSR 標(biāo)記的黃精品種（系）DNA 指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建[J].分子植物育種，2018，16（6）：1878-1887.

[17]陳友吾，廖榮俊，葉碧歡，等. 多花黃精轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)分析及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[J]. 中草藥，2020，51 （1）：182-189.

[18]趙振宇， 王仕玉， 郭鳳根，等. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其在藥用植物上的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2017， 36（2）： 820-825.

[19]劉厚伯，上官艷妮，潘胤池，等. RNA-Seq在藥用植物研究中的應(yīng)用[J]. 中草藥， 2019， 50（21）：5346-5354.

[20]慧芳，劉秀巖，李宗諭，等. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用[J]. 中草藥， 2019， 50（24）： 6149-6155.

[21]WANG Y， LIU X， SU H， et al. The regulatory mechanism of chilling-induced dormancy transition from endo-dormancy to non-dormancy in Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl rhizome bud[J]. Plant Molecular Biology， 2019，99：205-217.

[22]BOTSTEIN D， WHITE R L， SKOLNICK M， et al. Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. The American Journal of Human Genetics， 1980， 32（3）： 314-331.

[23]MORGANTE M， HANAFEY M， POWELL W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes[J]. Nature Genetics，2000， 30：194-200.

[24]王東，曹玲亞，高建平. 黨參轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)信息分析 [J]. 中草藥， 2014， 45（16）： 2390-2394.

[25]LIU Y， ZHANG P， SONG M， et al. Transcriptome analysis and development of SSR molecular markers in Glycyrrhiza uralensis Fisch [J]. PLoS One， 2015， 10（11）： e0143017.

[26]WANG L， WANG Z， CHEN J， et al. De novo transcriptome assembly and development of novel microsatellite markers for the traditional Chinese medicinal herb， Veratrilla baillonii Franch （Gentianaceae） [J]. Evolutionary Bioinformatics， 2015， 11（S1）： 39-45.

[27]代嬌，時(shí)小東，顧雨熹，等. 厚樸轉(zhuǎn)錄組SSR 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及功能分析 [J]. 中草藥， 2017， 48（7）： 2726-2732.

[28]黃海燕，杜紅巖，烏云塔娜，等. 基于杜仲轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2013， 49（5）：176-181.

[29]李永強(qiáng)，李宏偉，高麗鋒，等. 基于表達(dá)序列標(biāo)簽的微衛(wèi)星標(biāo)記（EST-SSRs）研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2004， 5（1）：91-95.

[30]鄧科君，張勇，熊丙全，等. 藥用植物丹參EST-SSR標(biāo)記的鑒定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2009，44（10）：1165-1172.

[31]LI C F， ZHU Y J XU G， et al. Transcriptome analysis reveals ginsenosides biosynthetic genes， microRNAs and simple sequence repeats in Panax ginseng C. A. Meyer [J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 204-205.

[32]范三紅，郭藹光，單麗偉，等. 擬南芥基因密碼子偏愛(ài)性分析[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2003， 30（2）： 221-225.

[33]LA ROTA M， KANTETY R V， YU J K， et al. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice， wheat， and barley[J]. BMC Genomics， 2005， 6（23）：23.

[34]姜春芽，廖嬌，徐小彪，等. 植物EST-SSR技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2009，7（1）：125-129.

[35]李小白，崔海瑞，張明龍. EST分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及在比較基因組學(xué)中的應(yīng)用[J].生物多樣性，2006， 14（6）：541-547.

[36]李小白，向林，羅潔，等.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）策略及其數(shù)據(jù)在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)上的應(yīng)用[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013， 35（5）： 720-726.

[37]李小白，金鳳，金亮，等.利用建蘭轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)genic-SSR標(biāo)記[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014， 2（8）： 1046-1056.

[38]BOZHKO M， RIEGEL R， CHUBERT R， et al. A cyclophilin gene marker confirming geographical differentiation of Norway spruce populations and indicating viability response on excess soil-born salinity[J]. Molecular Ecology， 2003， 12（11）： 3147-3155.

[39]SCHUBERT R， STARCK G M， RIEGEL R. Development of EST-PCR markers and monitoring their intrapopulational genetic variation in Piceaabies （L.） Karst[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2001， 103（8）： 1223-1231.

[40]忻雅， 崔海瑞， 張明龍，等. 白菜EST-SSR標(biāo)記的通用性[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志， 2006， 28（2）： 248-252.

[41]李小白，張明龍，崔海瑞. 油菜EST-SSR標(biāo)記的建立[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2007， 40（2）： 137-144.

[42]金基強(qiáng)，崔海瑞，陳文岳，等. 茶樹(shù)EST-SSR的信息分析與標(biāo)記建立[J].茶葉科學(xué)，2006， 26（1）： 17-23.

（責(zé)任編輯：陳海霞）