中藥調(diào)節(jié)GLP-1的分子機制研究進展

錢紫星,陳 俊,2

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430061;2. 湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢 430061)

2型糖尿病(T2DM)是常見的慢性代謝性疾病,隨著生活水平的提高及生活方式的改變,其發(fā)病率逐年升高,成為心腦血管疾病、腎衰竭、神經(jīng)病變、認知障礙等疾病的重要風(fēng)險因素[1-2],嚴重危害人類健康,因此如何有效控制血糖,延緩并發(fā)癥的發(fā)生是治療T2DM的主要方向。近年來,由腸道內(nèi)分泌細胞分泌的腸促胰島素胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)逐漸進入大眾的視野,因其以葡萄糖依賴性的方式促進胰島素分泌、保護胰島細胞功能、參與糖脂代謝、抑制食欲、延緩胃排空等作用及特點,成為當(dāng)下的研究熱點,臨床上GLP-1受體激動劑已廣泛使用。目前大量實驗已證實某些中藥、中藥提取物及中藥復(fù)方可有效上調(diào)GLP-1水平降低血糖,其中部分研究通過探索其干預(yù)GLP-1的信號通路揭示了中藥降糖作用的分子機制,筆者結(jié)合近年來基于促進GLP-1的中藥降糖分子機制研究進行綜述,以期為中藥的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供依據(jù),為降糖機制研究提供參考。

1 GLP-1生理作用

GLP-1由近端結(jié)腸、遠端回腸的腸道內(nèi)分泌L細胞分泌,其特異性受體廣泛分布于胰腺、胃腸、心臟、腎臟、垂體等多個器官[3-4],其表達、合成、分泌機制復(fù)雜。胰高血糖素原基因(PG)是 GLP-1的前體,在胰腺、腸L細胞及腦中表達,在L細胞中經(jīng)前激素轉(zhuǎn)化酶1/3(PC1/3)的作用生成GLP-1,另外,膳食攝入特別是一種富含脂肪和碳水化合物的食物,是GLP-1分泌的主要生理刺激因素,可通過相應(yīng)感應(yīng)受體激活相關(guān)途徑促進GLP-1的分泌[3,5]。

當(dāng)GLP-1與胰島細胞上的受體結(jié)合后,通過激活環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)途徑,使細胞內(nèi)cAMP濃度升高,促進胰島素原基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,提高對葡萄糖刺激信號的敏感性,從而促進胰島素合成與分泌[6-8]。而當(dāng)血糖低于正常水平時,GLP-1對血糖的抑制作用減弱,不促進胰島素分泌,避免了低血糖的發(fā)生[9]。同時,GLP-1可通過促進胰十二指腸同源基因盒-1(PDX-1)表達活化,促進胰島B細胞增殖和分化[10-11],并通過上調(diào)抗凋亡因子,下調(diào)促凋亡因子減少胰島細胞的凋亡[12-13]。

在胰腺外,GLP-1可直接作用于胃腸或通過調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)作用于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸器官,使機體產(chǎn)生飽食感,降低食欲,延緩胃排空,進而減輕體重,調(diào)節(jié)餐后血糖狀態(tài)[14]。另外,GLP-1通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路對心肌細胞缺氧、應(yīng)激損傷及凋亡起到拮抗作用,從而發(fā)揮其心臟保護作用[15-16]。

2 中藥調(diào)節(jié)GLP-1分泌的分子機制

多項動物實驗及臨床實驗已證實某些中藥及復(fù)方可通過上調(diào)機體GLP-1水平發(fā)揮改善胰島素抵抗、恢復(fù)胰島細胞功能、控制血糖等作用,但是關(guān)于其調(diào)控GLP-1的分子機制有效通路卻只占一小部分,因此如需理解中藥降糖機制,應(yīng)從分子水平進行深入探索?，F(xiàn)有研究報道的分子機制復(fù)雜多樣,證實中藥可通過多靶點、多通路調(diào)節(jié)GLP-1的分泌,現(xiàn)將其影響機制總結(jié)如下。

2.1PG/PC1/3 GLP-1由胰高血糖素原(PG/GCG)基因表達,在腸道內(nèi)分泌L細胞中,PC1/3將PG切割、轉(zhuǎn)錄、修飾為GLP-1,因此中藥是否能通過干預(yù)PG或PC1/3表達影響GLP-1水平值得探究。李俊燕等[17]臨床研究發(fā)現(xiàn)清化顆粒(黃芩、黃連、葛根)可顯著降低糖尿病患者的血糖水平,提高血清GLP-1濃度;動物實驗發(fā)現(xiàn)清化顆?？擅黠@提升db/db糖尿病小鼠的血清GLP-1水平,并可顯著上調(diào)小鼠回腸組織中PG和PC1/3的基因和蛋白表達,并且具有劑量依賴效應(yīng),提示清化顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)PG和PC1/3表達而促進GLP-1分泌。鄭延坤等[18]通過黃芩素灌胃2型糖尿病模型小鼠,發(fā)現(xiàn)灌藥后GLP-1水平明顯升高,回腸組織中PG和PC1/3基因表達明顯上調(diào),提示黃芩素能夠通過此通路促進糖尿病小鼠GLP-1的分泌。為證實黃連有效成分對GLP-1影響及機制,胡茹楠等[19]以NCI-H716細胞為模型,用已證實可以促進GLP-1分泌的鹽酸小檗堿(BER)為陽性對照組,發(fā)現(xiàn)鹽酸藥根堿(JAT)、黃連堿(COP)以及高、低濃度BER+COP+JAT均能促進GLP-1的分泌,并且BER+COP+JAT組可通過促進GCG表達,進而在蛋白質(zhì)水平促進GLP-1的合成,證實了其具有恢復(fù)內(nèi)源性GLP-1的功能。上述研究不僅證實了中藥可通過上調(diào)GLP-1水平從而發(fā)揮降糖效果,更是揭示了其可通過PG/PC1/3通路促進內(nèi)源性GLP-1的分泌。

2.2cAMP/PKA cAMP由腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化的三磷酸腺苷(ATP)合成,是GCG編碼的效應(yīng)因子之一,cAMP的升高在GCG轉(zhuǎn)錄的激活及其編碼的肽激素產(chǎn)生中也發(fā)揮了重要作用,其下游效應(yīng)因子,包括PKA和Epac,在調(diào)節(jié)GLP-1的分泌中也有重要作用[7]。李俊燕等[20]對清化顆粒的另一項研究發(fā)現(xiàn),清化顆粒干預(yù)后可明顯增加db/db糖尿病小鼠腸組織cAMP的濃度,降低ATP的濃度,由此推測其促進GLP-1分泌的機制與cAMP通路相關(guān),但是否能提升PKA或Epac濃度未進行進一步的研究。劉云西[21]分別進行體內(nèi)動物模型實驗究及體外實驗,在基礎(chǔ)狀態(tài)下及病理狀態(tài)下探究水菖蒲乙酸乙酯(ACE)對NCI-H716細胞GLP-1分泌的分子機制,體內(nèi)實驗顯示ACE可明顯增加葡萄糖刺激的血漿GLP-1水平,并伴隨著GCG、PG1/3表達的增加,體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)生理及病理狀態(tài)下ACE均可增加cAMP水平及其下游蛋白PKA的磷酸化水平,從而促進GLP-1分泌。

2.3Wnt信號通路 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移及凋亡等生物學(xué)過程,其中β-catenin蛋白是Wnt信號通路上的關(guān)鍵分子,β-catenin蛋白入核是激活Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵[22]。該通路的異常調(diào)控與腫瘤、肥胖、糖尿病、骨骼疾病、神經(jīng)退行性疾病等存在密切聯(lián)系[23]。研究證實Wnt信號通路可影響GLP-1的產(chǎn)生,該通路可通過兩個關(guān)鍵效應(yīng)子β-cat和TCF7L2,上調(diào)GCG mRNA表達和GLP-1在腸道內(nèi)分泌L細胞中的產(chǎn)生[24-26]。鄧姝穎等[27]發(fā)現(xiàn),在枸杞多糖(LBP)的干預(yù)下,STC-1細胞核和細胞質(zhì)中β-catenin的表達上調(diào),并且隨著干預(yù)濃度的增加,核轉(zhuǎn)位愈發(fā)明顯,轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2與β-catenin的結(jié)合能力增強,GCG 基因和GLP-1的表達增加,表明LBP可通過激活調(diào)節(jié)Wnt信號通路,增加β-catenin 蛋白的分泌,進而促進GCG基因的表達,上調(diào)GLP-1的水平。劉云西[21]的實驗研究亦發(fā)現(xiàn)ACE可促進β-catenin在核內(nèi)的蛋白水平,減少其胞漿內(nèi)水平,并增加該信號通路下游基因Cyclin D的蛋白水平,可見水菖蒲可通過多信號通路促進GLP-1分泌。

2.4GPCRs/GLP-1 G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是人體中最大的膜蛋白家族,可通過胞外信號分子激活,與下游效應(yīng)蛋白相互作用,完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而影響人體的生理活動。部分G蛋白偶聯(lián)受體如GPR119、GPR40、GPR120等已證實可以引起cAMP升高,PKA活化,促進GLP-1的分泌,近年來,以G蛋白偶聯(lián)受體為靶的抗糖尿病藥物的研發(fā)成為新的熱點[28-29]。葛根芩連湯是經(jīng)方運用于治療2型糖尿病的典型代表,陳俊等[30]以不同濃度葛根芩連湯含藥血清培養(yǎng)NCI-H716細胞,不同濃度葛根芩連湯均可顯著提高GLP-1、cAMP濃度,上調(diào)GLP-1和GPR119基因的表達,表明葛根芩連湯的降糖作用可能與其激活GPR119-cAMP-GLP-1通路有關(guān)。劉文科[31]對清熱降濁方(黃連、苦瓜、知母、苦參、酸棗仁等)及黃連素促進GLP-1分泌作用進行體外試驗觀察,發(fā)現(xiàn)經(jīng)清熱降濁方或黃連素干預(yù)后,細胞上清液中GLP-1含量顯著增加,并且隨著葡萄糖濃度的增高,GPR119及cAMP分泌量也明顯增加,其水平與葡萄糖濃度呈正相關(guān),這表明清熱降濁方及其主要成分黃連素可能對GPR119通路具有調(diào)控作用。

2.5腸道菌群/SCFAs/GLP-1和腸道菌群/BA/GLP-1 短鏈脂肪酸(SCFAs)由腸道菌群通過發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生,主要包括丁酸、丙酸和乙酸等,SCFAs中丙酸、丁酸可與GPR41和GPR43作用,促進GLP-1和酪酪肽(PYY)等腸道激素分泌[32];膽汁酸(BA)可通過法尼醇X受體(FXR)和G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)調(diào)節(jié)脂質(zhì)、葡萄糖、能量代謝和炎癥反應(yīng),腸道菌群通過膽汁酸代謝,作用于靶點TGR5,促使cAMP水平升高,進而GLP-1分泌增加[33-36]。穆國華[37]抓住2型糖尿病“火熱”病機及“補腎水陰寒之需”治療之要,以交泰丸組成黃連-肉桂藥對為研究對象,以腸道菌群及膽汁酸代謝途徑為研究方向進行動物實驗,發(fā)現(xiàn)黃連-肉桂能夠影響db/db小鼠腸道菌群的分布,提高TGR-5、GLP-1的表達,表明此藥對可以通過改善小腸狀態(tài),修復(fù)其屏障功能,同時作用于BA/TGR5/GLP-1信號通路發(fā)揮治療糖尿病的作用。黃連素的降糖、改善腸道菌群作用均已得到實驗證實,為研究其相關(guān)性及作用機制,夏敬勝等[38]以小、大劑量黃連素分別灌胃2型糖尿病大鼠模型,以利拉魯肽藥物組為陽性組,結(jié)果顯示小、大劑量黃連素組均明顯增加梭桿菌屬以及乳酸桿菌屬含量,顯著增加糖尿病大鼠GPR43、TGR5、GCG及PC1/3 mRNA的表達,增加糖尿病大鼠血清GLP-1、GLP-1R mRNA及GLP-1蛋白表達,表明黃連素可能通過腸道菌群的代謝產(chǎn)物SCFAs以及BA的作用,激活GPR43、TGR5活性,上調(diào)GCG及PC1/3表達,從而促進GLP-1分泌。為探究逍遙散通過調(diào)節(jié)糖代謝抗抑郁的作用靶點,宋美芳[39]以肝郁脾虛型抑郁癥大鼠為模型,給藥組分別用逍遙散和氟西汀治療,結(jié)果顯示逍遙散組大鼠結(jié)腸和肝組織中TGR5、GLP-1的蛋白表達量增高,證實逍遙散可通過激活BA-TGR5-GLP-1通路調(diào)節(jié)葡萄糖代謝來發(fā)揮抗抑郁作用,然而此研究未進行上游信號分子膽汁酸濃度的測定,此機制能否運用于2型糖尿病的治療值得進一步探究。Le等[40]研究發(fā)現(xiàn)番瀉葉苷A(SA)作用于通過膳食補充劑在高脂肪飲食(HFD)誘導(dǎo)的肥胖小鼠,可有效改善肥胖和高血脂癥,修復(fù)結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)腸道微生物群,恢復(fù)SCFAs,促進GPR43和GPR41生成,上調(diào)GLP-1表達,糾正線粒體功能障礙,表明SA可能通過影響腸道菌群/SCFAs/GLP-1軸發(fā)揮其作用。

另有研究顯示,桑枝總生物堿(SZ-A)可調(diào)節(jié)糞便中菌群多樣性及組成比例,使促進短鏈脂肪酸生成的菌種顯著增加,上調(diào)PG及GLP-1的表達發(fā)揮其抗糖尿病作用[41];參芪復(fù)方可調(diào)節(jié)增加產(chǎn)丁酸菌的相對豐度,促進GLP-1的分泌[42],但關(guān)于其中間作用機制仍需進一步深入。

2.6味覺受體/GLP-1 研究發(fā)現(xiàn),苦味中藥可通過激活腸道內(nèi)分泌L細胞苦味感受受體(TAS2R)刺激GLP-1分泌。腸道上TAS2R受到苦味刺激物后并與其結(jié)合,激活α-味導(dǎo)素(Gαgust)及磷脂酶C(PLC)通路和磷酸二酯酶(PDE)通路,促進三磷酸肌醇(IP3)生成,刺激細胞內(nèi)Ca2+釋放,進而誘導(dǎo)GLP-1的分泌,從而調(diào)節(jié)血糖[43-45]。 郭舜等[46]基于腸苦味受體途徑,利用小鼠腸分泌細胞株(STC-1)探索苦參堿促進GLP-1分泌的機制,發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制STC-1細胞增殖,并具有濃度和時間依賴性;苦參堿中、高劑量組可顯著升高STC-1細胞內(nèi)IP3含量及游離鈣離子的濃度,高劑量組可明顯升高Gαgust表達,同時PLC-β2蛋白表達水平也呈現(xiàn)增加的趨勢,表明苦參堿可通過激活腸上苦味受體/Gαgust/PLC-β2/IP3途徑刺激GLP-1分泌。Yu等[47]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿孵育后的NCI-H716細胞GLP-1分泌顯著增加,但其作用被TAS2R38抗體濃度依賴性抑制,不同濃度小檗堿(100,200 mmol/L)孵育均增強NCI-H716細胞中TAS2R38蛋白表達,但兩種濃度間無明顯差異。另外進一步用siRNA敲除NCI-H716細胞TAS2R38后,小檗堿組GLP-1分泌減少,同時PLC抑制劑U73122可濃度依賴性地抑制小檗堿介導(dǎo)的GLP-1分泌,表明小檗堿可作用于腸道TAS2R,并調(diào)控PLC通路從而促進GLP-1的分泌[48]。Yue等[49]研究也印證了小檗堿誘導(dǎo)的GLP-1從腸內(nèi)分泌細胞釋放通過苦味受體激活的過程以PLC依賴性方式調(diào)節(jié)。劉珍秀等[50]研究發(fā)現(xiàn),清化顆粒方低、中、高劑量均能上調(diào)db/db糖尿病小鼠腸道TAS2Rs7、TAS2Rs9、TAS2Rs38的基因表達和回腸PDE1A蛋白的表達,該復(fù)方可能通過PDE通路刺激小鼠腸道內(nèi)分泌細胞分泌GLP-1。

2.7葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白/GLP-1 人體內(nèi)由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUTs)及鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(SGLTs)共同參與調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。GLUTs是一類調(diào)控葡萄糖入胞的跨膜蛋白,主要參與機體能量供給、糖代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等過程,其包括多個亞型,如GLUT-2、GLUT-4等[51]。SGLTs主要在腸道及腎臟中表達,負責(zé)腸道中的活性葡萄糖和半乳糖吸收以及腎臟中的葡萄糖重吸收,常見亞型有SGLT1、SGLT2等[52-53]。目前SGLT2抑制劑如達格列凈、恩格列凈等已廣泛運用于臨床?，F(xiàn)有實驗表明SGLT1和GLUT2在小腸中參與了GLP-1的葡萄糖依賴性刺激和GIP分泌,其作用機制可能與甜味受體T1R2/T1R3的活化、ATP、Ca+通道等密切相關(guān)[54-55]。 小檗堿已被證實具有促進GLP-1分泌的作用,為探索其機制,楊欣妤等[56]以腸道L細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運體為研究對象,發(fā)現(xiàn)小檗堿10,50 μmol/L可使STC-1細胞葡萄糖消耗率顯著增加,并可顯著升高SGLT1 mRNA表達,并且50 μmol/L小檗堿可顯著上調(diào)SGLT1蛋白表達,而各組對GLUT2 mRNA及GLUT2蛋白表達無明顯作用。結(jié)果證實小檗堿可通過上調(diào)SGLT1表達促進葡萄糖轉(zhuǎn)運,進一步增強腸道L細胞感應(yīng)葡萄糖,從而促進GLP-1的分泌,而對GLUT2無明顯影響。該實驗日后可通過研究敲除SGLT1后小檗堿對GLP-1的影響進行更深入的探索。李俊燕等[57-58]在對清化顆粒的進一步研究實驗中發(fā)現(xiàn),與模型組(0.9%氯化鈉溶液)相比,清化顆?？娠@著上調(diào)GLP-1水平,并且清化顆粒低、中、高劑量組db/db回腸組織中的SGLT1 mRNA的相對表達量分別增加31.5%、51.2%、60.6%,并可明顯上調(diào)SGLT1蛋白的相對表達量;另有實驗發(fā)現(xiàn)清化顆粒各劑量組均可顯著上升調(diào)GLUT2 mRNA和蛋白的表達水平,因此兩項研究證實清化顆粒可能通過影響GLUT2、SGLT1的表達來促進GLP-1的分泌,但該通路的中間分子機制值得進一步深入。

3 小 結(jié)

隨著對糖尿病的深入了解及GLP-1的深入研究,目前眾多GLP-1受體激動劑如利拉魯肽、度拉糖肽、司美格魯肽等已運用于臨床并取得了顯著的療效,因此基于促進GLP-1研究中藥的降糖作用機制為臨床運用提供了良好的理論依據(jù)。綜合上述眾多研究可以發(fā)現(xiàn),促進GLP-1分泌的中藥及復(fù)方中黃芩、黃連出現(xiàn)頻率較高,并以苦味藥物為多,具有清熱燥濕、瀉火存陰之功,與仝小林教授所認為2型糖尿病“中滿內(nèi)熱”的基本病機不謀而合[59]。另外多種藥物可通過多個通路促進GLP-1分泌,并且除了上述作用機制外,中藥能否通過其余途徑促進GLP-1的分泌或激活GLP-1受體或激活其下游通路如cAMP/PKA、PKA/PDX-1、PI3K/Akt等表達亦值得深入研究,進一步探索中藥多靶點、多途徑的降糖作用。需要注意臨床運用中藥治療2型糖尿病不可拘泥于機制通路,應(yīng)結(jié)合中醫(yī)辨證,補瀉結(jié)合,防止藥性傷人。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。