布魯氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法檢測(cè)評(píng)價(jià)

劉麗婭,剡文亮,張子榮, 宋 潔,鄭 瑩,馬曉菁,葉 鋒,谷文喜,易新萍,李 巖

布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,宿主范圍廣、對(duì)環(huán)境抵抗力較強(qiáng),可以通過(guò)多種途徑感染動(dòng)物和易感人群[1-2],對(duì)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和社會(huì)公共衛(wèi)生安全造成巨大威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道,每年布病新增病例數(shù)超過(guò)50萬(wàn)[3]。人感染布病主要是通過(guò)接觸患病動(dòng)物及其動(dòng)物產(chǎn)品。做好畜間布病防控,對(duì)于控制人間布病至關(guān)重要。疫苗接種是控制畜間動(dòng)物布病的有效手段。目前應(yīng)用于動(dòng)物布病防控的疫苗主要為弱毒活疫苗,給人和動(dòng)物帶來(lái)一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[4]。從病原學(xué)角度來(lái)說(shuō),核酸探針分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)、聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、巢式PCR方法、熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR等方法可鑒別布魯氏菌疫苗株與自然感染菌株[5-6]。但在免疫學(xué)層面目前尚無(wú)檢測(cè)區(qū)分自然感染抗體與疫苗免疫抗體的方法,難以對(duì)布病自然感染動(dòng)物進(jìn)行準(zhǔn)確診斷,有效剔除傳染源[7]。

半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(NH-AGID)是基于脂多糖(S-LPS)和半抗原多糖(NH)的免疫原性差異建立的一種鑒別診斷方法[8-9]。國(guó)外研究報(bào)道,NH-AGID方法中NH抗原對(duì)布魯氏菌疫苗Rev.1株和S19株的免疫抗體多呈陰性反應(yīng),檢測(cè)特異性>90%,據(jù)此,應(yīng)用NH-AGID方法可鑒別診斷布魯氏菌疫苗Rev.1株和S19株的免疫抗體與感染抗體[10-11]。本研究擬使用我國(guó)羊用布病疫苗M5株和S2株免疫羊,在抗體持續(xù)期內(nèi)應(yīng)用NH-AGID方法進(jìn)行檢測(cè),評(píng)估該方法區(qū)分M5和S2疫苗免疫抗體和感染抗體的特異性,以期為我國(guó)布病防控診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑與疫苗 布病活疫苗(M5株)購(gòu)自天康生物制藥有限公司(批號(hào)2021004);布病活疫苗(S2株)購(gòu)自天康生物制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)2021031)。布病虎紅平板凝集和試管凝集試驗(yàn)抗原購(gòu)自青島中創(chuàng)匯科生物科技有限公司;布病抗體瓊擴(kuò)法檢測(cè)試劑盒,包含NH、LPS混合抗原、布魯氏菌病陽(yáng)性對(duì)照血清、21孔瓊脂板等,購(gòu)自青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司(批號(hào) 2112002)。均在有效期內(nèi)使用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取3～5月齡且健康狀況良好的綿羊羔羊74只,免疫前采血,分離血清,經(jīng)布病虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

1.2 方 法

1.2.1 分組免疫 將74只實(shí)驗(yàn)羊隨機(jī)分為3組,即M5組24只、S2口服組25只、S2皮下組25只。按照M5、S2疫苗說(shuō)明書規(guī)定的用法與劑量進(jìn)行免疫。分組情況見表1。

表1 免疫分組情況Tab.1 Immunization groups

1.2.2 血清采集 免疫后7 d、14 d、21 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d采血分離血清,并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè) 按照國(guó)標(biāo)GB 18646-2018,應(yīng)用RBT方法對(duì)免疫血清樣品進(jìn)行初篩,陽(yáng)性血清再經(jīng)SAT方法進(jìn)行確診。確診的免疫抗體陽(yáng)性血清置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 NH-AGID試驗(yàn) 應(yīng)用NH-AGID方法對(duì)確診的免疫陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。待檢血清僅出現(xiàn)一條LPS沉淀線、未出現(xiàn)NH沉淀線,表明該動(dòng)物檢測(cè)LPS抗體陽(yáng)性,NH抗體陰性,判定為免疫動(dòng)物;出現(xiàn)NH和LPS兩條沉淀線,表明該動(dòng)物檢測(cè)LPS抗體和NH抗體均為陽(yáng)性,動(dòng)物機(jī)體內(nèi)布魯氏菌為活動(dòng)期或排菌期,判定為布魯氏菌感染動(dòng)物。LPS沉淀線和NH沉淀線位置見圖1。

注:1為布魯氏菌病陽(yáng)性對(duì)照感染動(dòng)物;4為免疫動(dòng)物。圖1 NH-GD方法結(jié)果顯示圖Fig.1 Result display diagram of the MH-Gd method

1.2.5 NH-AGID方法對(duì)M5和S2疫苗免疫抗體與感染抗體的鑒別診斷特異性 應(yīng)用公式計(jì)算:特異性(Sp)=未檢測(cè)出NH抗體血清數(shù)/疫苗免疫血清總數(shù)[12]。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗免疫抗體陽(yáng)性率 免疫后7 d～150 d內(nèi),對(duì)M5、S2疫苗組免疫羊進(jìn)行采血并分離血清,應(yīng)用RBT初篩、SAT確診檢測(cè)。SAT檢測(cè)結(jié)果表明布魯氏菌S2疫苗和M5疫苗免疫組的免疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律趨勢(shì)基本一致。M5和S2株免疫綿羊14 d后均可檢測(cè)到免疫抗體,且抗體陽(yáng)性率最高;免疫60 d后免疫抗體陽(yáng)性率呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。S2株疫苗口服組免疫動(dòng)物在150 d時(shí)免疫抗體的血清學(xué)反應(yīng)均為陰性,約12%的M5株和S2株疫苗皮下注射接種動(dòng)物在150 d時(shí)免疫抗體血清學(xué)反應(yīng)仍為陽(yáng)性。SAT方法確診的免疫陽(yáng)性血清結(jié)果見表2。

表2 布病M5和S2株疫苗免疫羊血清SAT檢測(cè)結(jié)果Tab.2 SAT test results for sheep serum immunized with the M5 and S2 strains of Brucella

2.2 M5疫苗免疫組NH-AGID試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用NH-AGID方法對(duì)M5疫苗免疫后7 d～150 d內(nèi)經(jīng)SAT確診為陽(yáng)性的免疫血清樣品檢測(cè)結(jié)果表明:免疫后7 d～150 d內(nèi)NH-AGID方法對(duì)布魯氏菌M5株疫苗免疫陽(yáng)性血清的LPS抗體檢出率為100%;NH抗體檢出率為8.3%～29.2%,表明M5株疫苗免疫羊免疫后7 d～150 d一直存在免疫動(dòng)物排菌情況,其中免疫后14 d達(dá)最高為29.2%,近70%的免疫動(dòng)物此時(shí)處于排菌狀態(tài)。該結(jié)果顯示綿羊?qū)5株疫苗有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。結(jié)果見表3。

表3 布病M5株疫苗免疫羊血清NH-AGID檢測(cè)結(jié)果Tab.3 NH-AGID test results for sheep serum immunized with the M5 strain of Brucella

2.3 S2疫苗免疫組NH-AGID試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用NH-AGID方法對(duì)S2疫苗免疫后7 d～150 d內(nèi)經(jīng)SAT確診為陽(yáng)性的免疫血清樣品檢測(cè)結(jié)果表明:布魯氏菌S2株灌服免疫組免疫陽(yáng)性血清與NH抗原呈陰性反應(yīng),檢測(cè)特異性為100%。LPS抗體檢出率為31.2%～66.7%,其中免疫后21 d LPS的檢出率最低僅為31.2%,近65%的S2免疫動(dòng)物未檢出LPS抗體。

布魯氏菌S2株皮下注射免疫組免疫后60 d內(nèi),免疫陽(yáng)性血清的NH抗體檢出率為4.5%～20%,表明S2株疫苗皮下注射組免疫后60 d內(nèi)存在免疫動(dòng)物排菌現(xiàn)象;免疫后90～150 d NH抗體檢出率為0。LPS抗體檢出率為45.4%～100%。結(jié)果見表4。

表4 布病S2株疫苗免疫羊血清NH-AGID檢測(cè)結(jié)果Tab.4 NH-AGID test results for sheep serum immunized with the S2 strain of Brucella

2.4 NH-AGID方法特異性 共檢測(cè)M5疫苗免疫抗體陽(yáng)性血清192份,檢出NH抗體血清數(shù)為33份,NH-AGID方法檢測(cè)M5疫苗免疫抗體與感染抗體的鑒別診斷特異性為82.8%。檢測(cè)S2疫苗免疫抗體陽(yáng)性血清400份,檢出NH抗體血清數(shù)為14份,NH-AGID方法檢測(cè)S2疫苗免疫抗體與感染抗體的鑒別診斷特異性為96.5%。

3 討 論

生產(chǎn)實(shí)踐中因無(wú)法區(qū)分布魯氏菌病自然感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物,造成部分假陽(yáng)性動(dòng)物誤殺,真陽(yáng)性動(dòng)物漏殺,不僅帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重阻礙了布魯氏菌病的凈化進(jìn)程。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》指出,NH-AGID方法適用于布病免疫地區(qū)反芻動(dòng)物的鑒別診斷。應(yīng)用該方法可甄別出畜群中的布魯氏菌病自然感染動(dòng)物,為布魯氏菌病防控提供技術(shù)支撐。該方法中光滑型LPS抗原和天然半抗原(NH)大多從牛種和羊種布魯氏菌中獲得,是布魯氏菌抗原中的兩種重要檢測(cè)標(biāo)識(shí)物[13]。LPS抗原免疫原性強(qiáng),光滑型布魯氏菌均能刺激機(jī)體產(chǎn)生LPS抗體。NH抗原因缺少LPS的免疫核心位點(diǎn)使得其免疫原性較弱[14],布魯氏菌病感染動(dòng)物在布魯氏菌活動(dòng)期或排菌期可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生NH抗體。NH-AGID方法應(yīng)用LPS抗原和NH抗原檢測(cè)血清中的抗體,由于LPS抗原分子量大、擴(kuò)散慢,在靠近中央抗原孔出現(xiàn)沉淀線;NH抗原分子量小、擴(kuò)散快,靠近被檢血清孔出現(xiàn)沉淀線。據(jù)此,可根據(jù)抗原擴(kuò)散速度差異而形成沉淀線位置不同來(lái)鑒別布魯氏菌感染抗體和疫苗免疫抗體。本研究應(yīng)用NH-AGID方法對(duì)M5株疫苗免疫陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),LPS檢出率為100%,NH抗原對(duì)M5疫苗的免疫抗體部分呈陽(yáng)性反應(yīng),NH抗體檢出率介于8.3%～29.2%。研究表明NH抗體的產(chǎn)生與布魯氏菌排出情況密切相關(guān)[15]。部分免疫M(jìn)5株疫苗血清檢出NH抗體,可能與M5疫苗毒力較強(qiáng)有關(guān)[16]。NH-AGID是否適用于M5疫苗抗體與感染抗體的鑒別診斷,尚需對(duì)該疫苗菌株的毒力、免疫途徑、免疫劑量等方面進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示該方法應(yīng)用于M5疫苗免疫后的鑒別診斷特異性為82.8%。

通過(guò)灌服、皮下注射兩種不同免疫方式和免疫劑量對(duì)適齡羔羊進(jìn)行S2疫苗免疫接種,獲得S2疫苗免疫陽(yáng)性血清,應(yīng)用NH-AGID方法進(jìn)行檢測(cè),表明其對(duì)S2株疫苗免疫血清的鑒別診斷特異性為96.5%。S2疫苗灌服免疫后陽(yáng)性血清與NH抗原呈陰性反應(yīng),其鑒別診斷特異性達(dá)100%。但與文獻(xiàn)報(bào)道NH-AGID方法能夠鑒別S2免疫背景下布病感染抗體和疫苗免疫抗體不同的是[17],S2疫苗皮下注射組免疫后部分陽(yáng)性血清與NH抗原呈陽(yáng)性反應(yīng),NH抗體檢出率為4.5%～20%。NH-AGID方法對(duì)S2疫苗兩種不同免疫方式獲得的陽(yáng)性血清LPS抗體檢出率均低于M5疫苗免疫陽(yáng)性血清的LPS抗體檢出率,究其原因,推測(cè)S2疫苗與牛、羊布魯氏菌的LPS抗原反應(yīng)原性可能存有差異。NH-AGID方法僅適用于反芻動(dòng)物,LPS和NH抗原主要提取自光滑型牛、羊種布魯氏菌。該方法對(duì)豬種布魯氏菌S2疫苗中的LPS和NH抗體的反應(yīng)原性,以及豬種S2株跨宿主感染后的鑒別診斷特異性尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本文研究結(jié)果表明,NH-AGID方法對(duì)我國(guó)現(xiàn)階段應(yīng)用的羊用布魯氏菌疫苗M5株和S2株的鑒別診斷應(yīng)用還存在一定缺陷。由于NH-AGID方法對(duì)免疫抗體與自然感染抗體的鑒別診斷能力與不同疫苗的免疫背景、疫苗毒力、免疫劑量、免疫途徑或其他等多方面因素相關(guān),因此還需進(jìn)一步研究并明確該方法在我國(guó)現(xiàn)有S2、M5疫苗免疫背景下的適用范圍和條件。NH-AGID方法可鑒別出布病感染且處于布魯氏菌活動(dòng)期或排菌期的動(dòng)物,有助于及時(shí)清除畜群中的布病傳染源,有效促進(jìn)動(dòng)物布病的防控與凈化。同時(shí)布病防控應(yīng)采取多法并存、相互補(bǔ)充,以“One Health”為理念[18],從動(dòng)物無(wú)疫、人類健康和環(huán)境生物安全角度出發(fā),切實(shí)推進(jìn)我國(guó)布病防控工作的順利進(jìn)行。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:劉麗婭,剡文亮,張子榮,等.布魯氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法檢測(cè)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):766-771. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.083