藍(lán)細(xì)菌CRISPRa系統(tǒng)的開發(fā)及其代謝工程應(yīng)用

王甜甜，朱虹，楊琛

（1 中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200032； 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

藍(lán)細(xì)菌是光合作用研究的模式生物之一，它們與高等植物一樣能夠進(jìn)行產(chǎn)氧光合作用、固定CO2，為生物圈提供重要的初級(jí)生產(chǎn)力。藍(lán)細(xì)菌的光合固碳過程，可以將太陽能和CO2直接轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品，同時(shí)起到固碳減排和生物合成的作用，因此引起了重點(diǎn)關(guān)注。通過對(duì)藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行代謝工程改造，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)從CO2到數(shù)十種燃料及化學(xué)品的生物合成，展示出藍(lán)細(xì)菌光合生物技術(shù)的重要潛力［1?4］。

近年來藍(lán)細(xì)菌遺傳操作工具的開發(fā)取得了重要進(jìn)展，包括基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的啟動(dòng)子與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的挖掘以及核糖開關(guān)的應(yīng)用［5?9］。然而與大腸桿菌（Escherichia coli）等模式微生物相比，現(xiàn)有藍(lán)細(xì)菌的遺傳操作工具仍然較為缺乏且效率較低，因此開發(fā)高效的藍(lán)細(xì)菌基因調(diào)控工具對(duì)于藍(lán)細(xì)菌系統(tǒng)與合成生物學(xué)研究具有重要意義。隨著CRISPR 技術(shù)的發(fā)展，它在藍(lán)細(xì)菌中的應(yīng)用也受到了關(guān)注。目前在藍(lán)細(xì)菌中已建立了基于具有DNA 雙鏈切割活性的Cas9 或Cas12a 的CRISPR 基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)基因的插入、刪除及堿基替換［10?12］。研究者們也利用失去DNA 切割功能的dCas9（dead Cas9）或dCas12a（dead Cas12a）在藍(lán)細(xì)菌中建立了抑制基因表達(dá)的CRISPR 干擾（CRISPR interference，CRISPRi）系統(tǒng)［13?14］，即引導(dǎo)dCas9 或dCas12a 至目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcription start site，TSS），則dCas9 或dCas12a會(huì)物理性阻礙RNA聚合酶的通過，導(dǎo)致基因沉默。Yao 等［13］在集胞藻Synechocystissp. PCC 6803 中建立了基因組規(guī)模的CRISPRi文庫，并用于乳酸耐受和高產(chǎn)相關(guān)基因的挖掘。然而，藍(lán)細(xì)菌中激活基因表達(dá)的CRISPR（CRISPR activation， CRISPRa）系統(tǒng)尚未建立。事實(shí)上，細(xì)菌中CRISPRa 技術(shù)的報(bào)道仍然較少，目前只有在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）等少數(shù)幾種模式細(xì)菌中建立了該技術(shù)，主要是將dCas9和轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，靶向目標(biāo)基因啟動(dòng)子上游序列，通過招募或穩(wěn)定RNA聚合酶，從而激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄［15?17］。對(duì)于CRISPRa系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活因子，目前已報(bào)道的包括RNA聚合酶ω?亞基RpoZ［15?16，18?20］、氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白SoxS（superoxide response transcriptional regulator）［21?23］、抗Sigma 因子AsiA［24］以及σ54因子依賴型激活蛋白［17］。本研究在模式藍(lán)細(xì)菌聚球藻（Synechococcus elongatus）PCC 7942（以下簡稱為PCC 7942）中篩選轉(zhuǎn)錄激活因子，建立了CRISPRa系統(tǒng)，并從靶向位點(diǎn)等多個(gè)方面進(jìn)行測試對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。

異戊烯醇（isopentenol）包括3?甲基?3?丁烯?1?醇（isoprenol）和3?甲基?2?丁烯?1?醇（prenol），具有高研究法辛烷值（reaserch octane number，RON）和良好的燃燒特性，可作為汽油替代品，是一種重要的生物燃料。Wither 等［25?30］在大腸桿菌（Escherichia coli）中實(shí)現(xiàn)了異戊烯醇的異源合成。本研究以異戊烯醇在PCC 7942 中的異源合成為研究對(duì)象，測試了構(gòu)建的CRISPRa 系統(tǒng)能否用于藍(lán)細(xì)菌代謝工程，結(jié)果展示了該系統(tǒng)能夠用于多基因代謝途徑的優(yōu)化改造，大幅提高了PCC 7942 中異戊烯醇的生物合成。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑

3?甲基?3?丁烯?1?醇、3?甲基?2?丁烯?1?醇、硫酸鐵銨、3?甲基?2?苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物、氨基磺酸、溶菌酶，均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；RNA 抽提試劑盒，購自德國Macherey?Nagel 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TOYOBO；多片段一步法快速克隆試劑盒、DEPC水、qPCR SYBR Green Master mix，均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組抽提試劑盒，均購自美國AXYGEN 公司；高保真DNA 聚合酶（2×Phanta Max Master Mix），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶，購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司（New England Biolabs）；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購自深圳康體生命科技有限公司。

1.1.2 儀器

Biometra TAdvanced Twin PCR 儀，購自耶拿分析儀器（北京）有限公司；Eppendorf Centrifuge 5417R 冷凍離心機(jī)，Eppendorf Centrifuge 5418、5430 高速離心機(jī)，均購自德國艾本德股份公司；BioTek power wave XS2 全波長酶標(biāo)儀，購自貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司；TECAN Spark 多功能微孔板檢測儀，購自帝肯Tecan 上海貿(mào)易有限公司；Agilent 7890A 氣相色譜儀，購自安捷倫科技（中國）有限公司；Bio?Rad MYIQ2熒光定量PCR 儀，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Thermo Scientific NANODROP2000C 微量分光光度計(jì)，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；復(fù)日科技FR?980A 凝膠成像儀，購自上海復(fù)日科技有限公司；GXZ?280C 智能光照培養(yǎng)箱，購自寧波江南儀器廠。

1.2 基因克隆和質(zhì)粒的構(gòu)建

提取集胞藻PCC 6803 基因組，設(shè)計(jì)引物（P18082?F 與P18082?R，P18082upstream?F 與P18082upstream?R）進(jìn)行PCR 得到啟動(dòng)子P18082及其上游序列，通過同源重組的方法使用多片段一步法快速克隆試劑盒將其與綠色熒光蛋白基因sfgfp以及質(zhì)粒載體PCL1920?NSⅡ（以PLC1920 質(zhì)粒為骨架［1］，在SalⅠ與SacⅠ酶切位點(diǎn)處引入PCC 7942 中NSⅡ中性位點(diǎn)的同源臂序列）進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒P01，然后將不同的sgRNA基因序列及其啟動(dòng)子Pcpc（sgRNA 及啟動(dòng)子Pcpc 由南京金斯瑞公司合成）也通過同源重組的方法引入該質(zhì)粒，得到含有不同靶位點(diǎn)sgRNA的質(zhì)粒（P02?P07）。

提取大腸桿菌E.coli基因組，以此為模板，設(shè)計(jì)引物（nudⅠ?F 與nudⅠ?R）進(jìn)行PCR 得到nudⅠ（GenBank：UZX07358.1）；使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BsrGⅠ酶切質(zhì)粒P05，通過同源重組將nudⅠ連接到酶切后的質(zhì)粒載體上，得到質(zhì)粒P08；提取PCC 7942 基因組，以此為模板，設(shè)計(jì)引物（dxs?F 與dxs?R）通過PCR 得到dxs片段，與nudⅠ連接后將其分別插入EcoRⅠ和BsrGⅠ酶切后的質(zhì)粒P05和P07，構(gòu)建得到質(zhì)粒P09和P10。

以質(zhì)粒P09 為基礎(chǔ)，將由南京金斯瑞合成的crRNA 和tracrRNA 序列通過同源重組替換P09 質(zhì)粒中的sgRNA，構(gòu)建得到質(zhì)粒P11～P13。

提取化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）基因組，以此為模板，通過設(shè)計(jì)引物（dCas9?F 與dCas9?R）引入兩個(gè)突變位點(diǎn)（D10A和H840A）進(jìn)行PCR得到dCas9，設(shè)計(jì)引物（Pendo?F與Pendo?R）通過PCR 得到啟動(dòng)子Pendo；soxS（GenBank：NP_31307）、RNA 聚合酶ω?亞基rpoZ（GenBank：ABB57740.1）、α?亞基rpoA（UniProt/Swiss?Prot：Q31L30.1）、RpoA 的N 端結(jié)構(gòu)域（UniProt/Swiss?Prot：Q31L30.1 中第1～681 位堿基）、Sigma?70 因子rpoD（GenBank：D10973.1）、dxs（GenBank：CAD55646.1）均由南京金斯瑞公司合成。通過同源重組的方法分別與質(zhì)粒載體PCL1920?NSⅢ（以PLC1920質(zhì)粒為骨架，在SalI與SacI酶切位點(diǎn)處引入PCC 7942 中NSⅢ中性位點(diǎn)的同源臂序列）或PCL1920?RpoZ（以PLC1920 質(zhì)粒為骨架，在SalⅠ與SacⅠ酶切位點(diǎn)處引入PCC 7942中rpoZ的同源臂序列）進(jìn)行連接，構(gòu)建成含有不同轉(zhuǎn)錄激活蛋白的質(zhì)粒（P14?P25）。

dCas9 相關(guān)質(zhì)粒通過同源重組雙交換整合到PCC 7942 基因組上的NSⅢ和RpoZ 位點(diǎn)，抗性篩選標(biāo)記為卡那霉素（kanamycin， KmR）；sfgfp、nudⅠ、dxs相關(guān)質(zhì)粒通過同源重組雙交換整合到PCC 7942 基因組上的NSⅡ位點(diǎn)，抗性篩選標(biāo)記為壯觀霉素（spectinomycin， SpeR）。

1.3 菌株轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)方法

（1）藍(lán)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化方法 取OD730≈1～2 的菌液1 mL，5000 r/min 離心3 min，去上清；加入500 μL的NaCl溶液（10 mmol/L）重懸后5000 r/min離心3 min，去上清；加入10 μL 的BG11［31］培養(yǎng)基重懸菌體，再加入1 μg 質(zhì)粒，用移液器混勻后用錫箔紙包裹離心管，置于搖床，190 r/min 30 ℃過夜培養(yǎng)后涂于相應(yīng)抗性平板。培養(yǎng)5～7 d 后，挑取單克隆在相應(yīng)抗性的BG11 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代來純合基因組，使用驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR 來確認(rèn)目標(biāo)基因是否整合到基因組上。

（2）藍(lán)細(xì)菌搖瓶培養(yǎng)方法 將藍(lán)細(xì)菌接種到含有25 mL BG?11 培養(yǎng)基（含100 mmol/L NaHCO3）的三角瓶中，三角瓶用紗布封口，光照強(qiáng)度3000 lx，溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速190 r/min。對(duì)于異戊烯醇合成菌株的培養(yǎng)，紗布換成密封性更好的封口膜。

（3）BG?11培養(yǎng)基（含100 mmol/L NaHCO3）配制 1.5 g/L NaNO3，0.075 g/L MgSO4·7H2O，0.036 g/L CaCl2·2H2O，4.76 g/L HEPES，1 mL/L 溶液1，1 mL/L 溶液2，1 mL/L 溶液3；加入8.4 g/L 的NaHCO3，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，過濾除菌。

溶液1：6.567 g/L 一水檸檬酸C6H8O7·H2O，6 g/L 檸檬酸鐵銨C6H8FeNO7，1.107 g/L Na2EDTA·2H2O，過濾除菌。

溶液2：2.86 g/L H3BO3，1.545 g/L MnSO4·H2O，0.222 g/L ZnSO4·7H2O，0.391 g/L Na2MoO4·2H2O，0.0404 g/L CoCl2·6H2O，過濾除菌。

溶液3：52 g/L K2HPO4·3H2O，20 g/L Na2CO3，過濾除菌。

本研究工作所用到的藍(lán)細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和引物見表1～表3。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

表3 本實(shí)驗(yàn)所用到的引物Table 3 Primers used in this study

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

將藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)至OD730為0.7～0.8，取5 mL 懸液，離心收集菌體，加入10 mg溶菌酶進(jìn)行細(xì)胞裂解。使用RNA 提取試劑盒（Macherey?Nagel）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）除去DNA 污染并進(jìn)行RNA 的反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 用實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio?Rad）進(jìn)行定量分析。

1.5 綠色熒光蛋白的檢測

菌株的初始OD730為0.1，培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 時(shí)分別取菌液100 μL，測定OD730以及菌體的熒光值。利用多功能微孔板檢測儀（TECAN Spark）進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為520 nm［32］。以O(shè)D730為橫坐標(biāo)、熒光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到OD730為1.0時(shí)的熒光值，扣除野生型菌株的熒光值后即為該菌株的熒光值。

1.6 顯色法檢測異戊烯醇

在酶標(biāo)板中依次加入20 μL 藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)液上清或3?甲基?3?丁烯?1?醇與3?甲基?2?丁烯?1?醇的標(biāo)準(zhǔn)品、50 μL 硫酸鐵銨與氨基磺酸的混合液、10 μL 3?甲基?2?苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物（3?methyl?2 benzothiazolinone hydrazine hydrochloride hydrate，MBTH）及120 μL 水，室溫反應(yīng)40 min 后測定620 nm 處的吸光度A620［33］。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y= 0.091 52x+ 0.014 06；y為A620值，x為異戊烯醇濃度（0～6 mg/L）。

1.7 氣相色譜法檢測異戊烯醇

用3?甲基?3?丁烯?1?醇和3?甲基?2?丁烯?1?醇的標(biāo)準(zhǔn)品分別配出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。菌株培養(yǎng)液離心后取上清。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品經(jīng)氣相色譜（gas chromatography；Agilent 7890A）連接火焰離子化檢測器（Agilent）進(jìn)行檢測和定量。使用的氣相色譜柱（Alltech EC?WAX）規(guī)格為30 m×0.32 mm。進(jìn)樣量1 μL，柱溫85 ℃ 3.5 min，150 ℃ 1.325 min，200 ℃ 6 min。

2 結(jié) 果

2.1 CRISPRa系統(tǒng)的構(gòu)建

CRISPR 激活系統(tǒng)由dCas9、轉(zhuǎn)錄激活因子以及具有向?qū)ё饔玫膕gRNA（single guide RNA）組成［圖1（a）］，形成的復(fù)合體招募或者穩(wěn)定RNA聚合酶于目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域。將來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）且經(jīng)過突變得到的dCas9與轉(zhuǎn)錄激活因子融合表達(dá)，兩者之間通過柔性連接肽（CAGGGGSGGGGS）連接，該基因模塊插入至PCC 7942 染色體的中性位點(diǎn)NSⅢ上，由化膿性鏈球菌CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的天然啟動(dòng)子Pendo 驅(qū)動(dòng)表達(dá)［圖1（b）］。sgRNA 和綠色熒光蛋白（sfGFP）基因插入至中性位點(diǎn)NSⅡ上，分別由集胞藻PCC 6803 藻藍(lán)素合成基因（sll1577）的啟動(dòng)子Pcpc 和集胞藻PCC 6803 50S 核糖體蛋白L10（Sll1745）基因的啟動(dòng)子P18082驅(qū)動(dòng)表達(dá)。

對(duì)于CRISPRa 系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活因子，我們分別測試了大腸桿菌來源的轉(zhuǎn)錄激活蛋白SoxS、PCC 7942來源的RNA聚合酶ω?亞基RpoZ、α?亞基RpoA、RpoA 的N 端結(jié)構(gòu)域（N?terminal domain，NTD）以及Sigma?70 因子RpoD，獲得其與 dCas9融合表達(dá)的菌株G09～G13。熒光檢測結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)錄激活因子都能對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)起到一定的激活作用，其中表達(dá)RpoZ 的菌株G09 的熒光信號(hào)值最高，是對(duì)照菌株G03（無dCas9 與轉(zhuǎn)錄激活因子模塊）的3.16倍［圖1（c）］。

為了證實(shí)CRISPRa 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活作用，以外源sgRNA 片段AGGACGCCTTTGGTAACCGC作為脫靶（off?target）RNA 構(gòu)建菌株G02 以及缺失sgRNA 的菌株G01。結(jié)果顯示G09 的熒光信號(hào)值顯著高于G01和G02菌株，而后兩者的熒光信號(hào)值沒有明顯差別［圖1（d）］。

2.2 CRISPRa系統(tǒng)的優(yōu)化

我們測試了CRISPRa 系統(tǒng)在目標(biāo)基因上游不同的靶向位點(diǎn)［圖2（a）］，即非模板鏈上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS 上游216 bp、236 bp、273 bp 的H1、H2和H3位點(diǎn)以及模板鏈上TSS上游327 bp、397bp的H4 和H5 位點(diǎn)［16］（表4）。結(jié)果顯示對(duì)于TSS 上游273～397 bp 范圍內(nèi)的靶點(diǎn)H3～H5，CRISPRa 系統(tǒng)都具有一定的激活作用，其中H4 是最佳的靶點(diǎn)；靶點(diǎn)H5距離TSS較遠(yuǎn)，與靶點(diǎn)H4相比轉(zhuǎn)錄激活效果降低；靶點(diǎn)H1 距離TSS 最近，目標(biāo)基因的表達(dá)受到抑制［圖2（b）］。這些結(jié)果表明該系統(tǒng)可以通過靶向啟動(dòng)子上游不同位點(diǎn)，達(dá)到激活或者抑制目標(biāo)基因表達(dá)的效果。

圖2 CRISPRa系統(tǒng)的優(yōu)化（a）目標(biāo)基因上游不同靶向位點(diǎn)的位置示意圖；（b）CRISPRa靶向不同位點(diǎn)的菌株的熒光信號(hào)值；（c）內(nèi)源rpoZ被敲除的G19菌株的熒光信號(hào)值；（d）dCas9 與RpoZ 融合表達(dá)順序的改變對(duì)于CRISPRa 激活效果的影響；（e）以強(qiáng)啟動(dòng)子PJ23108 替換弱啟動(dòng)子Pendo，構(gòu)建dCas9?RpoZ表達(dá)增強(qiáng)的菌株G45；（f）菌株G45的熒光信號(hào)值Fig. 2 Optimization of the CRISPRa system(a)Scheme of different targeting sites for CRISPRa. (b) The fluorescence intensities of strains G09, G14, G15,G16, and G17 with different targeting sites. (c) The fluorescence intensity of G19 strain with genetic knockout of endogenous rpoZ. (d) Effect of different orientations of the dCas9 and RpoZ fusion on CRISPRa performance. (e) Expression of dCas9?RpoZ was increased in G45 strain by replacing the promoter Pendo with PJ23108.(f) The fluorescence intensity of G45 strain.

表4 本研究用到的CRISPRa系統(tǒng)靶位點(diǎn)序列Table 4 Targeting sequences for the CRISPRa system used in this study

為了提高CRISPRa 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活效果，我們以dCas9?RpoZ 基因模塊替換PCC 7942 基因組上的rpoZ基因，即敲除內(nèi)源rpoZ基因，得到菌株G19，其熒光信號(hào)值顯著高于G09 菌株，達(dá)到對(duì)照菌株G03 的4.19 倍［圖2（c）］。因此，敲除內(nèi)源rpoZ基因有效提高了CRISPRa系統(tǒng)的激活效果。

我們測試了dCas9 與RpoZ 融合表達(dá)順序的改變對(duì)于CRISPRa 激活效果的影響。除了RpoZ 融合在dCas9 的C 端（dCas9?RpoZ），我們還構(gòu)建了RpoZ 融合在dCas9 的N 端（RpoZ?dCas9）以及N端和C 端（RpoZ?dCas9?RpoZ）。對(duì)于每一種構(gòu)建方式，我們測試了不同的靶向位點(diǎn)。熒光檢測結(jié)果表明這三種融合表達(dá)順序均在靶點(diǎn)H4 達(dá)到最優(yōu)的激活效果，其中激活效果最佳的構(gòu)建方式是dCas9?RpoZ［圖2（d）］。

我們還測試了增強(qiáng)dCas9?RpoZ 的表達(dá)對(duì)于CRISPRa 激活效果的影響。我們將低強(qiáng)度的啟動(dòng)子Pendo 替換為較高強(qiáng)度的啟動(dòng)子PJ23108，驅(qū)動(dòng)dCas9?RpoZ 基因模塊的表達(dá)，得到菌株G45［圖2（e）］。該菌株的熒光信號(hào)值顯著高于G19 菌株，達(dá)到對(duì)照菌株G03的5.31倍［圖2（f）］。

2.3 CRISPRa 系統(tǒng)應(yīng)用于異戊烯醇合成途徑的優(yōu)化

我們將構(gòu)建的CRISPRa 系統(tǒng)應(yīng)用于藍(lán)細(xì)菌代謝工程，選擇的對(duì)象是異戊烯醇（isopentenol）在PCC 7942中的異源合成。異戊烯醇包括3?甲基?3?丁烯?1?醇（isoprenol）和3?甲基?2?丁烯?1?醇（prenol），這兩者可以在Nudix水解酶家族的作用下由甲基赤蘚糖醇?4?磷酸途徑（methylerythritol phosphate，MEP 途徑） 上的異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP） 和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）分別生成［30］。PCC 7942 中有MEP 途徑，但是不能合成異戊烯醇。

2.3.1 異戊烯醇合成基因的表達(dá)

我們?cè)赑CC 7942 中引入大腸桿菌來源編碼核苷三磷酸酶（nucleoside triphosphatase）的nudⅠ基因。CRISPRa 靶向位點(diǎn)為nudⅠ上游H4 位點(diǎn)。sgRNA和nudⅠ插入至PCC 7942染色體的中性位點(diǎn)NSⅡ上，分別由Pcpc 和P18082 驅(qū)動(dòng)表達(dá)。dCas9?RpoZ基因模塊替換基因組上的rpoZ基因或者插入至中性位點(diǎn)NSⅢ，分別得到菌株S03和S04［圖3（a）］。將菌株在含有NaHCO3的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)96 h，利用qRT?PCR 檢測菌株中nudⅠ的轉(zhuǎn)錄水平，利用顯色反應(yīng)檢測培養(yǎng)液上清中異戊烯醇的含量（A620）。結(jié)果顯示與對(duì)照菌株S01（無dCas9?RpoZ模塊）相比，菌株S03和S04中nudⅠ表達(dá)水平分別提高12.7 倍和13.4 倍，異戊烯醇的生成明顯增加［圖3（b）、（c）］。

2.3.2 激活合成途徑上兩個(gè)基因

由dxs基因編碼的脫氧木酮糖?5?磷酸合成酶（1?deoxy?D?xylulose 5?phosphate synthase）是MEP途徑的限速步驟［圖4（a）］。我們利用CRISPRa 對(duì)nudⅠ和dxs進(jìn)行同時(shí)激活，得到菌株S05 和S06，其中S06 缺失rpoZ基因，另外用脫靶RNA 構(gòu)建了菌株S07［圖4（b）］。我們檢測了這些菌株中nudⅠ和dxs的轉(zhuǎn)錄水平以及異戊烯醇的生成。結(jié)果顯示與對(duì)照菌株S02（無dCas9?RpoZ模塊）相比，菌株S05和S06的異戊烯醇產(chǎn)量顯著提高，其中S06的產(chǎn)量更高，而菌株S07的產(chǎn)量無明顯變化［圖4（c）］。菌株S05 和S06 的nudⅠ和dxs的表達(dá)被明顯激活。與S02 相比，菌株S05 中nudI和dxs的轉(zhuǎn)錄水平分別提升了5.96 倍和2.14 倍，菌株S06 中nudⅠ和dxs的轉(zhuǎn)錄水平分別提升了7.66 倍和2.80 倍；而菌株S07 中基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變［圖4（d）］。因此，該CRISPRa 系統(tǒng)不僅能夠高效激活單個(gè)基因的表達(dá)，而且能同時(shí)激活兩個(gè)基因的表達(dá)。

圖4 CRISPRa同時(shí)激活nuⅠd與dxs（a）dxs 編碼的脫氧木酮糖?5?磷酸合成酶催化MEP 途徑的第一步反應(yīng)；（b）sgRNA（靶位點(diǎn)H4）、nudⅠ及dxs 整合至PCC 7942 中性位點(diǎn)NSⅡ，dCas9?RpoZ基因模塊整合至PCC 7942中性位點(diǎn)NSⅢ或替換內(nèi)源rpoZ基因，分別得到菌株S05和S06，S02為沒有dCas9?RpoZ模塊的對(duì)照菌株，S07為整合了脫靶RNA（off target）的菌株；（c）菌株S02、S05、S06、S07培養(yǎng)96 h后利用顯色反應(yīng)檢測的上清液中異戊烯醇含量；（d）菌株S02、S05、S06、S07培養(yǎng)72 h后nudⅠ與dxs的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 4 Simultaneous activation of nudⅠ and dxs by CRISPRa(a) 1?Deoxy?D?xylulose 5?phosphate synthase encoded by dxs catalyzes the first reaction of the MEP pathway. (b)Scheme of nudⅠ and dxs activation by CRISPRa. The sgRNA H4, nudⅠ, and dxs were inserted into the NSⅡ site. The DNA fragment encoding dCas9?RpoZ was inserted into the NSⅢsite or to replace endogenous rpoZ, generating strains S05 and S06, respectively. S02 (without dCas9?RpoZ) and S07 (with an off target sgRNA 106)are the control strains. (c) Isopentenol production by strains S02, S05, S06, and S07.Cells were cultivated for 96 h, and isopentenol in the culture supernatant was detected by a colorimetric assay. (f) Transcriptional levels of nudI and dxs in strains S02, S05, S06, and S07. RNA was isolated from cells cultivated for 72 h.

2.3.3 激活合成途徑基因及抑制競爭途徑基因

異戊烯醇合成的前體代謝物IPP 和DMAPP 在香葉基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GPPS）的作用下生成GPP，進(jìn)而合成類胡蘿卜素和葉綠素等復(fù)雜萜類化合物［34］，因此GPPS 是影響異戊烯醇合成的競爭途徑上的關(guān)鍵酶［圖5（a）］。我們利用建立的CRISPR 系統(tǒng)對(duì)nudⅠ和dxs進(jìn)行激活，同時(shí)也對(duì)gpps基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制。在PCC7942 的基因組上gpps（Synpcc7942_0776）位于一個(gè)操縱子的中間［圖5（b）］。我們?cè)谠摬倏v子的TSS 以及gpps基因的起始密碼子附近各選了一個(gè)靶向位點(diǎn)（g1 與g2，見表2），nudⅠ和dxs的上游靶向位點(diǎn)為H4 位點(diǎn)，這樣得到菌株S12和S13，另外用脫靶RNA 構(gòu)建了菌株S14，S12～S14都缺失rpoZ基因［圖5（c）］。

圖5 CRISPRa 同時(shí)激活nudI與dxs并抑制gpps（a）gpps編碼的香葉基焦磷酸合成酶是影響異戊烯醇合成的競爭途徑上的關(guān)鍵酶；（b）gpps（Synpcc7942_0776）基因在PCC 7942 基因組上的位置示意圖；（c）在S06菌株gpps所在操縱子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及gpps基因起始密碼子附近各選了一個(gè)靶向位點(diǎn)（g1與g2），分別得到菌株S12 和S13，S14 為整合了脫靶RNA 的對(duì)照菌株；（d）菌株S12、S13、S14 及S02、S06 在OD730約為0.7 時(shí)gpps、nudⅠ和dxs的轉(zhuǎn)錄水平；（e）菌株S06、S12、S13與S14培養(yǎng)4～8天時(shí)利用顯色反應(yīng)檢測的上清液中異戊烯醇含量；（f）野生型菌株WT與S02、S06、S12、S13、S14菌株的生長曲線；（g）菌株S02、S06與S13在OD730約為2.0時(shí)利用氣相色譜檢測的培養(yǎng)上清液中異戊烯醇的含量Fig. 5 Simultaneous activation of nudⅠ and dxs and repression of gpps by CRISPRa(a) gpps catalyzes a key competing reaction for isopentenol biosynthesis; (b) Location of the gpps gene and the targeting sites g1 and g2 on the PCC 7942 genome; (c) The g1 and g2 sites of gpps in strain S06 were targeted, generating strains S12 and S13, respectively. S14 (with an off target sgRNA 106) is a control strain. (d) Transcriptional levels of gpps, nudⅠ and dxs in strains S02, S06, S12, S13, and S14. RNA was isolated from cells grown to OD730 of about 0.7. (e) Isopentenol production by strains S02, S06, S13, and S14. Isopentenol in the culture supernatant was detected by a colorimetric assay. (f) Isopentenol production by strains S02, S06, and S13. Culture supernatants were collected at OD730 of about 2.0, and isopentenol was detected by gas chromatography.

我們檢測了上述菌株中nudⅠ、dxs及gpps的轉(zhuǎn)錄水平以及菌株的生長與異戊烯醇的生成。結(jié)果顯示與菌株S06相比，菌株S13中g(shù)pps的轉(zhuǎn)錄水平降低了85%，而菌株S12 和S14 中g(shù)pps的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變；菌株S13 中nudI與dxs的轉(zhuǎn)錄水平與菌株S06 相比降低了25%～30%，但是與對(duì)照菌株S02相比仍然提高了5.33倍和2.09倍［圖5（d）］。菌株S13 的異戊烯醇產(chǎn)量明顯高于菌株S06，在光照培養(yǎng)第8 天達(dá)到最高值［圖5（e）］。菌株S13 的生長明顯變慢［圖5（f）］，可能是由于gpps基因受到強(qiáng)烈抑制而導(dǎo)致光合作用相關(guān)的葉綠素和類胡蘿卜素合成下降。除了顯色法以外，我們還利用氣相色譜檢測了菌株的異戊烯醇生成。結(jié)果顯示菌株S13 的異戊烯醇產(chǎn)量達(dá)到22.1 mg/L，相比菌株S06 和S02 分別提高了2 倍和17 倍［圖5（g）］。因此，該CRISPRa 系統(tǒng)能夠激活nudⅠ與dxs的轉(zhuǎn)錄并同時(shí)抑制gpps基因的轉(zhuǎn)錄，大幅提高了藍(lán)細(xì)菌中異戊烯醇的合成。

3 總結(jié)與討論

本研究以光合作用模式生物、光能自養(yǎng)細(xì)胞工廠底盤--藍(lán)細(xì)菌為研究對(duì)象，開發(fā)了CRISPR激活系統(tǒng)。利用高強(qiáng)度啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA，將dCas9 與多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄激活因子融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RpoZ 是較好的轉(zhuǎn)錄激活因子。進(jìn)而通過內(nèi)源rpoZ基因敲除以及dCas9?RpoZ 靶向位點(diǎn)優(yōu)化與表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)該CRISPRa 系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。利用建立的CRISPRa 系統(tǒng)對(duì)重要生物燃料--異戊烯醇的合成途徑進(jìn)行了工程改造，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)單基因的高表達(dá)、多基因的同時(shí)激活以及不同基因的同時(shí)激活和抑制，大幅提高了藍(lán)細(xì)菌中異戊烯醇的合成，展示了該系統(tǒng)能夠有效地用于多基因代謝途徑的優(yōu)化改造，有望成為光能自養(yǎng)細(xì)胞工廠構(gòu)建的有力工具。

除了代謝工程應(yīng)用以外，該CRISPRa系統(tǒng)的另一個(gè)潛在應(yīng)用是通過建立gRNA文庫，構(gòu)建藍(lán)細(xì)菌基因組規(guī)模的基因表達(dá)擾動(dòng)文庫，進(jìn)行功能獲得性的遺傳篩選（gain?of?function screening），用于挖掘能夠賦予特定細(xì)胞表型的基因，比如促進(jìn)生長、增強(qiáng)耐受性和化學(xué)品生產(chǎn)相關(guān)的基因等。在此之前，需要測試該CRISPRa系統(tǒng)在基因組原位調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。建立CRISPRa文庫，高通量地進(jìn)行功能基因組學(xué)研究和功能元件挖掘，這是CRISPRa技術(shù)與非CRISPR 的基因調(diào)控技術(shù)相比較的一大優(yōu)勢。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的CRISPRa文庫已有報(bào)道［35?41］，被用于功能獲得型篩選，如耐藥機(jī)制研究。然而，細(xì)菌中的CRISPRa文庫尚未被報(bào)道。

目前只有在大腸桿菌等少數(shù)幾種模式細(xì)菌中建立了CRISPRa技術(shù)，本研究可以為其他非模式菌株中CRISPRa系統(tǒng)的開發(fā)提供思路。對(duì)于系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活因子，本研究主要測試了藍(lán)細(xì)菌的RNA聚合酶亞基等。為了提高該CRISPRa 系統(tǒng)的激活效果，需要測試更多的藍(lán)細(xì)菌內(nèi)源或外源的轉(zhuǎn)錄激活因子，dCas9 以外的其他CRISPR 蛋白（比如dCpf1），還需要測試目標(biāo)基因上游更多的靶向位點(diǎn)，結(jié)合生物信息學(xué)分析等實(shí)現(xiàn)最優(yōu)靶點(diǎn)的預(yù)測。