重組膠原蛋白表達(dá)體系研究進(jìn)展

潘家豪，潘煒?biāo)桑窠?，謝東玲，鄒奇，吳川

（1 中南大學(xué)冶金與環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410083； 2 湖南諾合新生物科技有限公司，湖南 長沙 410001； 3 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008； 4 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631）

膠原蛋白是人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)，在人體中含量豐富，占人體蛋白質(zhì)三分之一，占皮膚干重四分之三，對于骨骼、皮膚、關(guān)節(jié)起關(guān)鍵的連接作用［1?3］。除了結(jié)構(gòu)上的作用外，膠原蛋白還可以與各種大分子如整合素、裝飾蛋白、纖維連接蛋白、肝素和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）發(fā)生相互作用，在調(diào)節(jié)組織再生過程中十分重要［4］。

作為哺乳動物含量最豐富的蛋白質(zhì)，膠原蛋白為哺乳動物組織提供主要的結(jié)構(gòu)與機(jī)械支持，是一種結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣的蛋白質(zhì)，基于其開發(fā)的產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化妝品、皮革、生物科技等行業(yè)。比如，空氣干燥澆注形成厚度為0.01～0.015 mm 的膠原蛋白膜可以作為傷口愈合材料和屏蔽膜［5］。膠原蛋白作為一種生物聚合物，還可以與其他親水性聚合物混合形成高質(zhì)量水凝膠和可生物降解的支架，其中膠原蛋白與殼聚糖共混物的制備已經(jīng)成為科學(xué)界重點(diǎn)關(guān)注的課題［6］。膠原蛋白作為皮膚的重要組分，具有維護(hù)皮膚外觀和狀況的作用。雖然膠原蛋白本身具有水不溶性，但膠原蛋白水解后產(chǎn)生的小肽與短肽易溶于水，可更好地添加到化妝品中。膠原蛋白成膜特性使其成為一種有效的保濕劑［6?7］，能覆蓋皮膚保持水分，避免表面活性劑損失。目前，膠原蛋白最具有商業(yè)價(jià)值的用途是作為可溶性蛋白，皮下注射修復(fù)損傷性皮膚［8］。此外，通過鞣制等化學(xué)過程使生皮中的膠原蛋白交聯(lián)，可生產(chǎn)更堅(jiān)硬、更耐用和防腐蝕的皮革［9］。通過設(shè)計(jì)與天然細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境相似的膠原蛋白支架，能有效揭示細(xì)胞行為和相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制［10?13］。

現(xiàn)階段膠原蛋白大體分為動物源膠原蛋白和重組膠原蛋白。動物源膠原蛋白雖然是膠原蛋白主要來源，但大多來源于陸生動物與海洋動物，陸生動物膠原蛋白已交聯(lián)嵌入到原生組織上，對提取與純化技術(shù)要求比較嚴(yán)苛［14］。此外，病原體污染以及過敏性風(fēng)險(xiǎn)也成為陸生動物膠原蛋白不可回避的問題［15?16］。海洋膠原蛋白能有效避免陸生動物膠原蛋白病原體污染以及過敏性風(fēng)險(xiǎn)的問題，但具有提取難和純化成本較高等劣勢［17］。重組膠原蛋白是將人膠原蛋白基因克隆到選定的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到表達(dá)細(xì)胞內(nèi)，最后通過純化技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)。由于重組膠原蛋白分子單一、結(jié)構(gòu)清晰、易于控制，已成為生物醫(yī)學(xué)以及組織工程代替動物源膠原蛋白的最佳替代物［18］。此外，重組膠原蛋白技術(shù)還可用于其他動物（鳥類和海洋物種等）特異性膠原蛋白的生產(chǎn)。

根據(jù)2021 年3 月15 日國家藥監(jiān)局對外發(fā)布的《重組膠原蛋白生物材料命名指導(dǎo)原則》［19］，可將重組膠原蛋白分為3 類：①重組人膠原蛋白，由DNA 重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長氨基酸序列，為三螺旋結(jié)構(gòu)；②重組人源膠原蛋白，由DNA 重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合；③重組類膠原蛋白，由DNA 重組技術(shù)制備的經(jīng)設(shè)計(jì)、修飾后的特定基因編碼的氨基酸序列或其片段，或是這類功能性氨基酸序列片段的組合，這種基因編碼序列或氨基酸序列與人膠原蛋白的基因編碼序列或氨基酸序列同源性低。本文首先對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、分布、形成過程進(jìn)行闡述，再對重組膠原蛋白表達(dá)體系以及應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行詳細(xì)說明，最后對膠原蛋白前景進(jìn)行展望。

1 膠原蛋白

1.1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)

膠原蛋白是含有三螺旋結(jié)構(gòu)（圖1）的纖維狀膠原蛋白，約占蛋白總質(zhì)量的三分之一，其中哺乳動物中膠原蛋白含量最高的是肌腱（80%），其次是皮膚（70%）、骨骼（25%）以及主動脈（20%）［21?22］。膠原蛋白的基本組成單位是由3 條α鏈組成的原膠原。正是由于原膠原分子中3個(gè)平行α 鏈以一個(gè)接一個(gè)殘基交錯(cuò)形成的聚脯氨酸Ⅱ型（PPⅡ）左手螺旋構(gòu)象決定了膠原蛋白結(jié)構(gòu)［23］。擁有正確折疊的三螺旋結(jié)構(gòu)對于膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用至關(guān)重要［24］。在三螺旋結(jié)構(gòu)中每一個(gè)α 鏈都由重復(fù)肽三聯(lián)體（Gly?Xaa?Yaa）組成，其中Xaa 和Yaa 通常是脯氨酸和羥脯氨酸［25］。由于高度螺旋化，三聯(lián)體中的3 個(gè)氨基酸殘基在螺旋內(nèi)部占據(jù)不同的位置。其中，甘氨酸殘基埋藏在中心，溶劑不容易進(jìn)入；Xaa 位置的氨基酸殘基高度暴露于溶劑中；Yaa 位置由于靠近相鄰鏈，因此被溶劑接觸的可能性較低［26］。對Gly?Xaa?Yaa的大量研究揭示了影響膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多重因素［27］，這些因素包括3條鏈條的緊密包裝、鏈之間形成的氫鍵、廣泛的水合網(wǎng)絡(luò)以及高含量的脯氨酸和羥脯氨酸形成。由于三螺旋結(jié)構(gòu)在225 nm 與198 nm 附近具有典型的圓二色光譜，通過觀察膠原蛋白圓二色光譜在225 nm 處平均殘余橢圓率隨溫度升高的變化，可以測定其熱穩(wěn)定性，求出的熔融溫度是決定三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)［28］。

圖1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)［20］（膠原蛋白一級結(jié)構(gòu)展示了膠原蛋白主要由脯氨酸、甘氨酸以及羥脯氨酸等氨基酸構(gòu)成；二級結(jié)構(gòu)則展示了脯氨酸、甘氨酸以及羥脯氨酸等氨基酸通過α螺旋使膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定；三級結(jié)構(gòu)展示了3條α鏈經(jīng)過左手螺旋構(gòu)象形成原膠原）Fig. 1 Structure of collagen[20](The primary structure of collagen shows that collagen is mainly composed of amino acids such as proline, glycine and hydroxyproline. The secondary structure shows that amino acids such as proline, glycine and hydroxyproline stabilize the secondary structure of collagen through α?helix. The tertiary structure shows that three α?chains passing through the left?hand helical conformation form procollagen.)

1.2 膠原蛋白類別

膠原蛋白作為最豐富的動物蛋白，至今已發(fā)現(xiàn)28 種類型［23，29?30］（表1），而根據(jù)膠原蛋白所形成具有不同活性的形態(tài)結(jié)構(gòu)可將膠原蛋白類型大致分為纖維性膠原蛋白（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、ⅩⅪ、ⅩⅩⅦ型）與非纖維性膠原蛋白（Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅻ、ⅩⅢ、ⅩⅣ、ⅩⅤ、ⅩⅥ、ⅩⅦ、ⅩⅧ、ⅩⅨ、ⅩⅩ、ⅩⅪ、ⅩⅫ、ⅩⅩⅢ、ⅩⅩⅣ、ⅩⅩⅤ、ⅩⅩⅥ、ⅩⅩⅦ、ⅩⅩⅧ型）。其中非纖維性膠原蛋白可分為網(wǎng)狀膠原蛋白、珠狀絲狀膠原蛋白、錨定纖維蛋白、膜蛋白以及multiplexins 膠原蛋白［30?32］。纖維性膠原蛋白中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白占人體膠原蛋白的80%～90%［15，29］。Ⅰ型膠原蛋白作為人體中最常見的膠原蛋白，主要分布在皮膚、肌腱和骨骼中，Ⅱ型主要分布在軟骨中，Ⅲ型主要分布在皮膚和血管系統(tǒng)中［33］。同時(shí)，纖維性膠原蛋白（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等）中Gly?Xaa?Yaa 結(jié)構(gòu)不間斷重復(fù)形成穩(wěn)定而又緊密的結(jié)構(gòu)，而所有非纖維型膠原蛋白如Ⅳ型、Ⅶ型和Ⅸ型中Gly?Xaa?Yaa均含有一個(gè)或多個(gè)中斷［34］，在這些中斷的序列中常常形成靈活的鏈條，使非纖維性膠原蛋白完成特定功能［30］。雖然驅(qū)動膠原蛋白空間的組織機(jī)制可能涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組織機(jī)械架構(gòu)，但膠原蛋白鏈的氨基酸序列存儲了膠原蛋白組裝成原纖維和網(wǎng)絡(luò)的基本信息［35?38］。

表1 膠原蛋白類型、分布及功能［23，29?30］Table 1 Collagen type, distribution and function[23,29?30]

部分膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)是由3條相同的α鏈組成，稱為同源三聚體型，如Ⅱ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白均屬于同源三聚體型。而動物含量最豐富的Ⅰ型膠原蛋白是由兩條不同的α鏈形成異源三聚體（α1［Ⅰ］2α2［Ⅰ］）。膠原蛋白的合成總是伴隨著與三螺旋結(jié)構(gòu)密切聯(lián)系的非膠原蛋白結(jié)構(gòu)域，這可能對于膠原蛋白三聚體化、鏈配位或生物相互作用具有重要作用［39］。膠原蛋白合成過程中，這些非膠原蛋白結(jié)構(gòu)域一部分沉積保留在細(xì)胞外基質(zhì)中，另一部分則可能被水解切割并表達(dá)功能［40］。

1.3 膠原蛋白生物合成機(jī)制

膠原蛋白的形成始于膠原蛋白編碼基因通過轉(zhuǎn)錄、翻譯等作用形成新生膠原蛋白α鏈（稱為前α 鏈）（圖2）［26，41］，膠原蛋白前α 鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先后經(jīng)歷脯氨酸?4?羥化酶（P4H）與賴氨酸羥化酶（LH）的修飾作用，使Gly?Xaa?Yaa 中Yaa 位上的脯氨酸殘基與賴氨酸殘基分別羥基化，而一部分羥基化賴氨酸殘基則進(jìn)一步糖基化［1，41］。脯氨酸羥基化和賴氨酸羥基化分別是實(shí)現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和細(xì)胞外成熟膠原交聯(lián)的必需步驟。若新生膠原蛋白 α 鏈羥基化出現(xiàn)畸形，形成的不良膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)將在細(xì)胞內(nèi)堆積，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［42?45］。除了P4H 與LH 作用外，前膠原蛋白α 鏈還需要脯氨酸?3?羥化酶（P3H）進(jìn)行修飾。隨后，3 條膠原蛋白前α 鏈的C端前肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜凝集素樣分子伴侶、鈣聯(lián)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶PDI的協(xié)同作用下形成的二硫鍵［46?49］，并將膠原蛋白α 單鏈三聚體化，形成三螺旋構(gòu)象，這種構(gòu)象從C 端一直持續(xù)到N 端［43］。同時(shí)，膠原蛋白特異性分子伴侶HSP47 與三螺旋前膠原蛋白相互作用，防止前膠原蛋白局部展開和聚集［26］。經(jīng)膠原蛋白特異性分子伴侶HSP47 作用后，前膠原蛋白被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口TANGO1 識別，運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中。在高爾基體中，HSP47 從前膠原蛋白解離，并通過KDEL（REDL）受體返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。同時(shí)，高爾基體將前膠原蛋白運(yùn)送分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，通過N端酶與C端酶的共同作用將前膠原蛋白多余N端與C端前肽進(jìn)行切除，形成完整的膠原蛋白分子［50］。

圖2 膠原蛋白合成機(jī)制圖［26，41］P-脯氨酸殘基；K-賴氨酸殘基；P4H-脯氨酰4?羥化酶；LH-賴氨酰羥化酶；P3H1-脯氨酰3?羥化酶；HSP47-熱休克蛋白47；PDI-二硫異構(gòu)酶；FKPB65-免疫親蛋白；PNP-原膠原N端酶；PCP-原膠原C端酶（首先膠原蛋白 α 鏈經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中P4H 酶以及LH 酶的作用下實(shí)現(xiàn)羥基化，隨后，3 條膠原蛋白α 單鏈的C 端前肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜凝集素樣分子伴侶、鈣聯(lián)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶PDI的協(xié)同作用下形成二硫鍵。HSP47能有效防止前膠原蛋白局部展開和聚集形成。最后，前膠原蛋白經(jīng)高爾基體運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)利用N端酶與C端酶將多余N端與C端進(jìn)行切除，形成完整的膠原蛋白結(jié)構(gòu)）Fig. 2 Mechanism of collagen synthesis[26,41]P-proline residue; K-lysine residue; P4H-prolyl 4?hydroxylase; LH-lysyl hydroxylase; P3H1-prolyl 3?hydroxylase; HSP47-heat shock protein 47; PDI-disulfide isomerase; FKPB65-immunophilic proteins; PNP-procollagen N protease; PCP-procollagen C protease(Firstly, collagen genes form collagen α?chains through transcription and translation, and secondly, under the action of P4H enzymes and LH enzymes in the endoplasmic reticulum, collagen α?chain is hydroxylated. Subsequently, three collagen α single?stranded C?terminal propeptides form disulfide bonds under the synergistic action of endoplasmic reticulum lectin?like chaperones, calcepiprotein, and endoplasmic reticulum oxidoreductase PDI. HSP47 effectively prevents the formation of local expansion and aggregation of pre?collagen. Finally, the cytoplasmic matrix of the procollagen is transported by the Golgi apparatus and the excess N?terminal and C?terminus of the precollagen are excised by N?terminal enzymes and C?terminal enzymes to form a complete collagen structure.)

2 重組膠原蛋白表達(dá)體系

隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，蛋白表達(dá)技術(shù)越來越成熟與規(guī)范，科學(xué)研究者逐漸將重心從研究動物源性膠原蛋白轉(zhuǎn)移到重組膠原蛋白表達(dá)上［51?52］。重組膠原蛋白的表達(dá)體系主要包括原核生物（主要為大腸桿菌）、酵母、植物、桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系［53?57］?，F(xiàn)階段表達(dá)體系中以大腸桿菌、酵母為主，但高效的大腸桿菌、酵母等表達(dá)體系缺乏動物細(xì)胞中膠原蛋白翻譯后修飾，需要添加相對應(yīng)的重組酶。而植物、桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系所產(chǎn)生膠原蛋白含量雖然遠(yuǎn)低于大腸桿菌、酵母體系，但具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)和較好的熱穩(wěn)定性（表2）。

表2 不同表達(dá)體系產(chǎn)生膠原蛋白含量及種類Table 2 Content and types of collagen produced by different expression systems

不同重組膠原蛋白表達(dá)體系表達(dá)膠原蛋白所需成本仍有比較大的區(qū)別（表3），植物表達(dá)體系因其具備光合作用自生產(chǎn)能力，其表達(dá)膠原蛋白成本相對較低；大腸桿菌以及酵母雖然具備一定發(fā)酵成本，但由于其表達(dá)產(chǎn)量較高，表達(dá)單位膠原蛋白所需成本也較低，但表達(dá)的膠原蛋白缺乏羥基化及相應(yīng)活性；昆蟲桿狀病毒表達(dá)體系由于其表達(dá)量少，生產(chǎn)周期長，因此其表達(dá)單位膠原蛋白成本較高；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系屬于高級重組表達(dá)體系，由于其表達(dá)體系復(fù)雜，培養(yǎng)要求高，因此其表達(dá)單位膠原蛋白的成本也較高。

表3 不同表達(dá)體系生產(chǎn)膠原蛋白成本及優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 Costs, advantages and disadvantages of collagen production in different expression systems

2.1 大腸桿菌表達(dá)體系

大腸桿菌表達(dá)體系由于其遺傳背景清晰、發(fā)酵成本較低、生產(chǎn)周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被用來大規(guī)模制造外源蛋白，但大腸桿菌表達(dá)體系同樣具有產(chǎn)生膠原蛋白缺乏羥基化過程的缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)體系具備細(xì)菌膠原蛋白的出現(xiàn)為利用大腸桿菌生產(chǎn)重組膠原蛋白提供了新的機(jī)遇。常見的載體主要包括pGE、pET 系列［79］。雖然大腸桿菌在表達(dá)重組膠原蛋白過程中通常缺少羥基化過程，但仍然能產(chǎn)生較為穩(wěn)定的三螺旋膠原蛋白結(jié)構(gòu)［80］。

起初，Yin等［58］研究了52個(gè)重復(fù)肽（GAPGAP GSQGAPGLQ）組成的膠原蛋白樣聚合物CLP3.1?his在大腸桿菌表達(dá)情況，同時(shí)比較了不同啟動子（熱誘導(dǎo)啟動子、T7 啟動子和T7lac 啟動子）和不同抑制強(qiáng)度基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的大腸桿菌菌株（BL21、BL21（DE3）和BL21（DE3）［pLysS］）對聚合物CLP3.1?his 產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，含T7 啟動子的BL21（DE3）［pLysS］菌株與含T7lac 啟動子的BL21（DE3）菌株產(chǎn)生的CLP3.1?his 含量大于細(xì)胞總蛋白的40%，表達(dá)量在100～200 mg/L。這項(xiàng)研究為后續(xù)重組膠原蛋白的大腸桿菌表達(dá)體系提供了寶貴的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)的這兩種菌株有望用于大規(guī)模的重組膠原蛋白生產(chǎn)。隨后，常海燕［59］通過將人源性Ⅱ型膠原蛋白cDNA 重組到大腸桿菌內(nèi)，考察發(fā)酵因素對分批?補(bǔ)料培養(yǎng)生產(chǎn)類人源性Ⅱ型膠原蛋白的影響，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)溫度為34 ℃、pH 為6.5、溶氧濃度為20%、比生長速率為0.20～0.25 h-1以及誘導(dǎo)時(shí)間控制在細(xì)胞對數(shù)生長中后期時(shí)，大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生類人膠原蛋白Ⅱ型含量最多，細(xì)胞密度最大，最高可產(chǎn)生13.2 g/L 類膠原蛋白Ⅱ型，重組類人膠原蛋Ⅱ型實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，為醫(yī)藥領(lǐng)域提供了更優(yōu)質(zhì)膠原蛋白產(chǎn)品。近幾年來，重組膠原蛋白已經(jīng)逐步應(yīng)用到化妝品行業(yè)，公眾對重組膠原蛋白生物安全性要求越來越高。楊晶等［60］構(gòu)建了重組類人Ⅰ型膠原蛋白基因的原核表達(dá)載體pET28a?rhC，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得分子量約為40 kDa、表達(dá)量為520 mg/L 的重組蛋白。DPPH 與MTT 試驗(yàn)表明該重組膠原蛋白具有一定抗氧化性，能有效促進(jìn)小鼠纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞的增殖。該重組蛋白雖然不具備完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，但可作為護(hù)膚品添加劑應(yīng)用于化妝品行業(yè)，也可作為促進(jìn)傷口愈合止血材料應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)。

由于大腸桿菌表達(dá)體系缺乏使膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的羥基化酶，因此膠原蛋白在大腸桿菌大規(guī)?；a(chǎn)遇到了挑戰(zhàn)［41］。此外，未羥基化膠原蛋白相較于天然羥基化膠原蛋白的Tm值低10 ℃，對于使用大腸桿菌等表達(dá)體系高效表達(dá)存在重大障礙［40］。這種挑戰(zhàn)可以通過添加P4H 基因以及相應(yīng)膠原蛋白基因來解決。Rutschman 等［61］利用人Ⅲ型部分膠原蛋白編碼基因（COL3A1）與病毒源的賴氨酰羥化酶L230 基因和脯氨酸羥化酶L593 基因在大腸桿菌中共表達(dá)，獲得了與人體膠原蛋白羥基化相似的膠原蛋白，該膠原蛋白具有一定的三螺旋結(jié)構(gòu)和較好的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，Liu等［62］利用炭疽桿菌P4H 基因與大腸桿菌中的膠原蛋白基因共表達(dá)，并對其在5L 發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，獲得了產(chǎn)量為0.8 g/L 的羥基化膠原蛋白，并提高了重組膠原蛋白的生物相容性，為生物材料工程應(yīng)用提供了一種富有前景的材料。

2.2 酵母表達(dá)體系

酵母作為真核生物，可對分泌重組蛋白進(jìn)行修飾。與動物表達(dá)體系不同的是，酵母產(chǎn)生重組蛋白不含病原體、病毒包涵體或者熱源，具有較高的安全性，發(fā)酵成本較低。同時(shí)以酵母為基礎(chǔ)的生產(chǎn)工藝能滿足重組蛋白質(zhì)高效批量生產(chǎn)的要求，產(chǎn)量多在克/升BMM 培養(yǎng)基范圍之內(nèi)［64，81］。但是利用酵母表達(dá)體系產(chǎn)生膠原蛋白大多為同源性膠原蛋白，生產(chǎn)異源性膠原蛋白較為困難。至今為止，研究者已開發(fā)了多種酵母為宿主的表達(dá)體系，如畢赤酵母、漢遜酵母以及啤酒酵母等［10］，其中畢赤酵母作為應(yīng)用最廣泛的酵母種類，與其他酵母相比，所翻譯加工的重組膠原蛋白具有二硫鍵、糖基化、蛋白水解過程等優(yōu)勢特征［82?84］。

起初，Vuorela等［63］研究了膠原蛋白脯氨酸?4?羥化酶在畢赤酵母表達(dá)載體PAO815 與PARG815中的表達(dá)，通過將膠原蛋白多肽鏈引入表達(dá)載體與脯氨酸?4?羥化酶共表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脯氨酸?4?羥化酶表達(dá)量增加，生產(chǎn)的羥基化Ⅲ型膠原蛋白含量高達(dá)2.15 g/kg，這表明穩(wěn)定的脯氨?；??羥化酶的產(chǎn)生需要膠原蛋白的表達(dá)，而穩(wěn)定的膠原蛋白的組裝也需要酶的表達(dá)，研究結(jié)果為畢赤酵母高產(chǎn)量表達(dá)提供了新的路徑。高力虎［64］從工藝優(yōu)化的角度出發(fā)，通過甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母菌株GS115高效表達(dá)了分子量為112 kDa 的重組類人膠原蛋白Ⅲ型，發(fā)現(xiàn)了最佳誘導(dǎo)酵母菌株GS115 表達(dá)的條件，即甲醇添加量為1.5%、初始菌濃度為3.0 OD6oo/mL、收獲時(shí)間為60 h、初始pH 為6.6 時(shí)，所獲得重組類人膠原蛋白Ⅲ型表達(dá)量可達(dá)60.1 mg/L。雖然重組類人膠原蛋白Ⅲ型不具備三螺旋結(jié)構(gòu)，活性較差，但該工藝為實(shí)現(xiàn)酵母工程發(fā)酵法制備類膠原蛋白作了有益的探索。隨后幾年，Wang 等［65］利用釀酒酵母α?交配因子prepro信號分泌表達(dá)了重組人全長成熟膠原蛋白α1［Ⅲ］（rhCOL3A1）鏈，其理論分子量可達(dá)95.344 kDa，發(fā)現(xiàn)當(dāng)混合碳在0.8（甘油/甲醇）比例下，誘導(dǎo)rhCOL3A1 達(dá)到最高產(chǎn)率（1.27 g/L）的時(shí)間可大幅縮短50%。該研究建立了一種有效的混合發(fā)酵策略，為大規(guī)模生產(chǎn)全長成熟rhCOL3A1 提供一種省時(shí)有效的新策略。到2017年，西北大學(xué)范代娣團(tuán)隊(duì)［66］通過對畢赤酵母生長階段的BMGY 培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母提取物為1.13%、蛋白胨為1.61%、甘油為0.86%比例時(shí)，在BMGY 培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)12 h，生長階段中畢赤酵母的菌重量增加26%，所得重組類Ⅲ型膠原蛋白含量增至4.7 g/L，該膠原蛋白對因乙酸灼傷的大鼠胃黏膜有較好的修復(fù)作用。

雖然酵母工程菌能實(shí)現(xiàn)重組膠原蛋白羥基化的過程，但產(chǎn)生的重組膠原蛋白多為同源三聚體（Ⅱ、Ⅲ型），對于異源三聚體（如Ⅰ型）的生產(chǎn)較為困難。而Ⅰ型膠原蛋白作為身體中分布最廣的膠原蛋白，其生產(chǎn)具有重要意義。因此，實(shí)現(xiàn)異源型膠原蛋白在酵母工程菌中的表達(dá)成為一項(xiàng)重要技術(shù)。2019 年，侯增淼等［67］成功利用人Ⅰ型膠原蛋白Gly?Xaa?Yaa 序列搭建了pPIC9K?COL 表達(dá)載體，并通過畢赤酵母工程菌發(fā)酵，最終獲得純度大于95%、表達(dá)量高達(dá)4.5 g/L 的重組人Ⅰ型膠原蛋白，掃描電鏡和小鼠成纖維細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明確定，該蛋白具有良好的多孔纖維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞相容性。同時(shí)，該重組人Ⅰ型膠原蛋白的高發(fā)酵產(chǎn)量表達(dá)說明酵母工程菌具備生產(chǎn)異源三聚體的條件，這為實(shí)現(xiàn)重組人Ⅰ型膠原蛋白工業(yè)化以及膠原蛋白生物醫(yī)藥材料產(chǎn)業(yè)化提供了可能。

2.3 植物表達(dá)體系

植物表達(dá)體系已經(jīng)成為分子醫(yī)藥的核心部分，由于所生產(chǎn)的抗體、疫苗可規(guī)模化、生產(chǎn)周期短、成本低、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，植物表達(dá)體系越來越受到大眾的喜愛［85］。植物表達(dá)體系在蛋白提取和純化技術(shù)及工藝的持續(xù)進(jìn)步，下游加工成本大幅度降低的背景下，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量與微生物和動物表達(dá)體系所產(chǎn)生的蛋白相比不再呈現(xiàn)數(shù)量級的差異［83］。但是，利用植物表達(dá)體系生產(chǎn)膠原蛋白與其他體系相比，仍具有產(chǎn)量較低、產(chǎn)能不足的缺點(diǎn)。

起初，Ruggiero 等［68］在2000 年利用煙草植物作為一種新的表達(dá)方式生產(chǎn)人類同型三聚體Ⅰ型膠原蛋白，通過將編碼人Ⅰ型膠原蛋白proα1［Ⅰ］鏈連接到二元質(zhì)粒pBIOC21，使煙草中重組人Ⅰ型膠原蛋白鏈以二硫鍵合的形式表達(dá)，表達(dá)量最高可達(dá)100 mg/kg 鮮葉，并具有穩(wěn)定的同型三聚體三螺旋結(jié)構(gòu)。該研究雖然沒有實(shí)現(xiàn)膠原蛋白羥基化，但為實(shí)現(xiàn)重組膠原蛋白在煙草中的表達(dá)提供了可能性，也為該團(tuán)隊(duì)后續(xù)研究提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。隨后兩年，團(tuán)隊(duì)人員Merle 等［69］在此基礎(chǔ)上，改進(jìn)了煙草表達(dá)系統(tǒng)，利用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)成功將煙草植物與人Ⅰ型膠原蛋白和P4H 酶共同轉(zhuǎn)化，成功生產(chǎn)了重組羥基化同型三聚體膠原蛋白，表達(dá)量穩(wěn)定在50～100 mg/kg 鮮葉。該研究證明了通過向煙草嵌合動物外源P4H 酶，能使生產(chǎn)的重組人Ⅰ型膠原蛋白熱穩(wěn)定性提高到37 ℃，提高產(chǎn)生膠原蛋白的質(zhì)量。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)首次在煙草中實(shí)現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)體系，為植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

此后，重組膠原蛋白生產(chǎn)的植物表達(dá)體系發(fā)展迅速，2009 年以色列再生醫(yī)學(xué)公司CollPlant［70］成功將編碼人Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈、α2 鏈基因、P4H 基因、LH 基因以及靶向液泡蛋白基因在煙草體內(nèi)實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，生成的重組人Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量高達(dá)200 mg/kg 鮮葉，占煙草植物總可溶性蛋白的2%。與植物細(xì)胞核中靶向蛋白質(zhì)表達(dá)占總可溶性蛋白的0.1%～1%相比，產(chǎn)量得到顯著提高，該公司也成為第一家成功開發(fā)出有效表達(dá)人體膠原蛋白植物平臺的公司，拓寬了重組人膠原蛋白在再生醫(yī)藥中的潛在應(yīng)用。與此同時(shí)，Xu等［71］研發(fā)了單獨(dú)表達(dá)人Ⅰ型膠原蛋白基因的玉米種子與同時(shí)表達(dá)人Ⅰ型膠原蛋白基因和P4H 基因的玉米種子，雖然同時(shí)表達(dá)人Ⅰ型膠原蛋白基因和P4H基因玉米種子中重組膠原蛋白含量（4 mg/kg）比單獨(dú)表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白基因的玉米種子重組膠原蛋白含量（12 mg/kg）低，但高分辨率質(zhì)譜（HRMS）分析表明，同時(shí)表達(dá)玉米源性重組Ⅰ型膠原蛋白的羥脯氨酸含量為18.11%，與酵母性重組Ⅰ型膠原蛋白的羥脯氨酸含量的17.47%和人類原生Ⅰ型膠原蛋白的羥脯氨酸含量14.59%相當(dāng)。與單獨(dú)表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白基因的玉米種子與相比，同時(shí)表達(dá)人Ⅰ型膠原蛋白基因和P4H 基因玉米種子熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，充分顯示了玉米具有生產(chǎn)充分修飾的外源蛋白的潛力。

2.4 昆蟲桿狀病毒表達(dá)體系

桿狀病毒表達(dá)體系通常由桿狀病毒作為表達(dá)載體感染昆蟲、幼蟲來獲得重組真核蛋白，已經(jīng)被證實(shí)可用于重組糖蛋白的生產(chǎn)［75］。桿狀病毒表達(dá)體系與酵母表達(dá)體系相比，其背景干擾更低，進(jìn)行翻譯后處理能力更強(qiáng)，生產(chǎn)的外源蛋白具有較好的三螺旋結(jié)構(gòu)［86?87］。同時(shí)，蠶后腺細(xì)胞合成的特定蛋白質(zhì)具有顯著活性：每個(gè)腺體中的大約1000 個(gè)細(xì)胞在4 d 內(nèi)可生產(chǎn)高達(dá)300 mg 的蛋白質(zhì)［88］，相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞約80 μg/d 的蛋白質(zhì)特定生產(chǎn)力。但是，利用昆蟲桿狀病毒產(chǎn)生膠原蛋白仍具有周期較長、產(chǎn)量較低的缺點(diǎn)。

Lambeig 等［72］通過構(gòu)建桿狀病毒載體并生成重組蛋白病毒，利用BaculoGold 轉(zhuǎn)染試劑盒（Pharmingen）將重組pVL 構(gòu)建物與改良的加州蜂核多角體病毒DNA 共轉(zhuǎn)染到Sf9 昆蟲細(xì)胞中，使Sf9 昆蟲細(xì)胞表達(dá)包含大量4?羥脯氨酸的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的人Ⅲ型前膠原蛋白α1 鏈。此外，在培養(yǎng)基加入抗壞血酸，將人Ⅲ型前膠原蛋白α1 鏈與人脯氨酰4?羥化酶的α 和β 亞基共表達(dá)，可使膠原蛋白熱穩(wěn)定性從原先的32～34 ℃提高到40 ℃，并且在昆蟲細(xì)胞體內(nèi)可表達(dá)出具有三螺旋結(jié)構(gòu)Ⅲ型前膠原蛋白（60 mg/L）和Ⅲ型膠原蛋白（40 mg/L）。該研究為表達(dá)不同用途與結(jié)構(gòu)的膠原蛋白提供了一種可行的方法。1997年，Myllyharju等［89］研究結(jié)果表明，無論是野生型還是重組型飛蛾細(xì)胞，人Ⅰ型前膠原蛋白α鏈的表達(dá)均以穩(wěn)定的α1［Ⅰ］2α2［Ⅰ］前膠原異型三聚體和α1［Ⅰ］3同型三聚體存在，其表達(dá)量大約在10～20 mg/L，熱穩(wěn)定性溫度在42～43 ℃之間，但不能形成α2［Ⅰ］3同型三聚體。同時(shí)，若將proa1［Ⅰ］鏈的信號肽和N 端前肽的編碼序列替換為前膠原蛋白α1［Ⅲ］鏈的編碼序列，可以提高前膠原蛋白α1［Ⅰ］鏈的表達(dá)水平；若將前膠原蛋白α2［Ⅰ］鏈上的C 端前肽替換為前膠原蛋白α1［Ⅰ］鏈或Ⅲ型前膠原的α1［Ⅰ］鏈，可形成同型三聚體，但該分子中的α2［Ⅰ］鏈在22 ℃下1 h后被胃蛋白酶完全消化。

2003 年，Tomita 等［74］嘗試通過轉(zhuǎn)基因蠶來實(shí)現(xiàn)重組膠原蛋白的表達(dá)。首先，通過構(gòu)建包含刪除了C端前肽的人Ⅲ型前膠原蛋白迷你鏈、絲素輕鏈（L?chain）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的融合蛋白cDNA，并將該cDNA 整合到piggyBac 載體中，隨后利用粒子槍將其轉(zhuǎn)染蠶絲腺，使Ⅲ型前膠原蛋白分泌表達(dá)，每個(gè)蠶可以表達(dá)約70 mg融合蛋白質(zhì)（純度達(dá)95%），蛋白組分簡單，便于后續(xù)重組膠原蛋白的純化。該實(shí)驗(yàn)證明了蠶在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)重組人膠原蛋白方面的可能性，證實(shí)轉(zhuǎn)基因蠶是生產(chǎn)重組人膠原蛋白的可靠工具。隨后經(jīng)過13 年的努力，以蠶為宿主的重組膠原蛋白表達(dá)體系有了實(shí)質(zhì)性發(fā)展。Qi 等［75］通過將含有人類Ⅱ型膠原蛋白cDNA 全部基因（4257 bp）的BmNPV?pFBDM?IM?colII桿狀病毒以注射的方式轉(zhuǎn)染到五齡蠶幼蟲背側(cè)血腔。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶所表達(dá)出來的Ⅱ型膠原蛋白存在著單螺旋α 鏈與三螺旋α鏈結(jié)構(gòu)，蛋白分子量分別為130 kDa 和300 kDa。每個(gè)幼蟲蠶皮經(jīng)鎳柱色譜純化可獲得大約1 mg 的具有一定活性的人Ⅱ型膠原蛋白，顯示出桿狀病毒?家蠶多基因表達(dá)系統(tǒng)可作為大規(guī)模生產(chǎn)表達(dá)活性人Ⅱ型膠原蛋白和其他復(fù)雜真核蛋白的方法。

2.5 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系是利用哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)，或?qū)⒅亟M蛋白基因整合到寄主基因組中構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器［18］。應(yīng)用最廣的細(xì)胞包括小鼠乳腺細(xì)胞、纖細(xì)肉瘤細(xì)胞和胚胎腎細(xì)胞［51，90?91］。而轉(zhuǎn)基因被譽(yù)為最有前途的動物細(xì)胞表達(dá)體系方法，該體系通過將cDNA轉(zhuǎn)基因序列與乳腺特異性啟動子結(jié)合，驅(qū)動牛乳腺中膠原蛋白的表達(dá)，重組膠原蛋白產(chǎn)量高達(dá)1 mg/mL［92］。轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞表達(dá)出的重組膠原蛋白或許能通過轉(zhuǎn)換等手段，彌補(bǔ)細(xì)胞表達(dá)體系產(chǎn)生的膠原蛋白不足的缺點(diǎn)，提高膠原蛋白產(chǎn)量。但哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系利用動物細(xì)胞直接產(chǎn)生蛋白質(zhì)，對培養(yǎng)體系要求高，易受病毒感染。

Frischholz 等［76］通過人胚腎細(xì)胞系HEK293 和纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080 穩(wěn)定表達(dá)人α1［Ⅹ］全長cDNA，獲得表觀分子量為75 kDa、表達(dá)量為50 g/L的重組人Ⅹ型膠原蛋白，圓二色譜和胰蛋白酶/糜凝蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)表明，重組人Ⅹ型膠原蛋白存在部分羥基化，熱穩(wěn)定性溫度低至32 ℃，證明了該表達(dá)體系具有產(chǎn)生三螺旋結(jié)構(gòu)重組Ⅹ型膠原的潛力。隨后，Toman 等［77］構(gòu)建了α s1 酪蛋白乳腺特異性啟動子的轉(zhuǎn)基因小鼠，該啟動子與37 kb 的人α1［Ⅰ］前膠原結(jié)構(gòu)基因，在乳汁中檢測到高水平可溶性三聚體（高達(dá)8 g/L），并具有三螺旋結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠乳腺能表達(dá)出較大分子的前膠原蛋白結(jié)構(gòu)，能作為重組膠原蛋白大規(guī)模生產(chǎn)的高效表達(dá)體系。HEK293 作為良好的瞬時(shí)表達(dá)體系，近年來由于重組蛋白藥物以及病毒的需要被研究學(xué)者廣泛應(yīng)用。曾斐鴻［78］通過研究重組Ⅳ?α膠原蛋白在HEK293 細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞能通過瞬時(shí)表達(dá)體系穩(wěn)定表達(dá)重組Ⅳ?α 膠原蛋白，產(chǎn)量可高達(dá)6.28 mg/L。此外，HEK293 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中存在銅離子效應(yīng)與乳酸代謝因素影響，這為工藝優(yōu)化提供了依據(jù)。

3 膠原蛋白應(yīng)用及研究展望

在國際上通常以專利數(shù)來衡量國家或企業(yè)的創(chuàng)新程度，截至2021 年，美國已公開的膠原蛋白相關(guān)專利擁有量為24 846件，授權(quán)專利量6452件，全球排名第一；歐洲與日本分別以專利量9317 件和5046 件分列全球膠原蛋白專利數(shù)二、三位。由此可知，各國膠原蛋白市場競爭激烈，美國具備巨大的專利優(yōu)勢［93］。此外，膠原蛋白在國外已應(yīng)用到人們生活的各個(gè)方面，如日本DHC、FANCL、UTU 等將膠原蛋白多肽應(yīng)用到營養(yǎng)保健品以及美容上，其中光膠原營養(yǎng)保健品營業(yè)額可達(dá)15 億美元［93］。法國羅賽洛公司在歐洲、南美、北美以及亞洲開設(shè)了膠原蛋白生產(chǎn)和研發(fā)中心，先后開發(fā)了糖果、口服液、膠囊劑、粉末沖劑等一系列高端產(chǎn)品。在國內(nèi)以“創(chuàng)新”為國家戰(zhàn)略，大力支持發(fā)展“生物基新材料”的大背景下，膠原蛋白吸引了越來越多參與者。國家食品藥物監(jiān)管總局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，膠原蛋白相關(guān)的保健品已發(fā)展到191種，主要以膠囊、蛋白粉、片劑為主，含膠原蛋白的保健產(chǎn)品越來越受到大眾的喜愛與歡迎。同時(shí)，膠原蛋白相關(guān)產(chǎn)品也將在醫(yī)療、護(hù)膚等領(lǐng)域迎來巨大的發(fā)展，預(yù)計(jì)未來市場規(guī)模將達(dá)到5000億元。近幾年我國膠原蛋白尤其是重組膠原蛋白產(chǎn)業(yè)得到飛速發(fā)展，2022 年更是被譽(yù)為重組膠原蛋白爆發(fā)元年。重組膠原蛋白在我國不僅得到國家政策的支持與相關(guān)資金的幫助，還有強(qiáng)大的技術(shù)支撐。我國在重組膠原蛋白技術(shù)方面，已經(jīng)在世界上處于非常領(lǐng)先的地位。我國膠原蛋白產(chǎn)品種類豐富，但與此同時(shí)，我國膠原蛋白技術(shù)研發(fā)領(lǐng)域仍然存在安全風(fēng)險(xiǎn)高和生物活性低等問題。我國市場監(jiān)督體系仍然需要進(jìn)一步完善，以避免宣傳效果與實(shí)際效果不符等現(xiàn)象。

重組膠原蛋白相較于傳統(tǒng)動物提取膠原蛋白，具有更高親水性、更高生物活性區(qū)域、更優(yōu)異的抗氧化性能以及止血與促傷口愈合能力［18］。重組膠原蛋白自研發(fā)以來，在生物醫(yī)藥工程中得到廣泛的應(yīng)用［52，94?96］。但是，由于機(jī)械強(qiáng)度有限，重組膠原蛋白主要應(yīng)用于皮膚、眼科修復(fù)與心軟骨工程修復(fù)等方面［97?101］。

在皮膚治療上，Zhao 等［102］發(fā)明的MTGase 交聯(lián)重組類人膠原蛋白水凝膠具有良好的生物相容性，在動物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)該材料具備較低的毒性，有望作為水凝膠注射材料修復(fù)皮膚損傷。Pan等［103］通過反復(fù)凍融聚乙烯醇、重組人類膠原蛋白與羧甲基殼聚糖的混合液得到水凝膠敷料，該敷料與商業(yè)敷料相比，能顯著促進(jìn)全層皮膚傷口愈合，顯示了其作為皮膚創(chuàng)面愈合創(chuàng)面敷料的巨大潛力。Woodly 等［98］通過獲得重組人Ⅶ型膠原蛋白，將其遷移到隱性營養(yǎng)不良大皰性表皮松解癥患者的真皮?表皮交界處，有效預(yù)防皮膚起泡與糜爛的形成；Dong 等［104］在近年來證實(shí)將重組類人膠原蛋白與重組類人纖連蛋白聯(lián)合治療C57BL/6小鼠的急性傷口的效果高于兩者單獨(dú)治療效果，為重組膠原在皮膚治療修復(fù)方面開辟了嶄新道路。McLaughlin等［105］通過將重組人Ⅰ型膠原蛋白與重組人Ⅲ型膠原蛋白制成可注射生物材料，將二者注入到心肌梗死增殖后期的小鼠身上，發(fā)現(xiàn)使用重組人Ⅰ型膠原蛋作為注射材料可以有效促進(jìn)愈合環(huán)境、心肌細(xì)胞存活以及減少心肌病理性重塑，有利于實(shí)現(xiàn)心肌梗死后重塑。

在眼科治療上，F(xiàn)agerholm 等［106］利用重組膠原蛋白植入10 名圓錐角膜或角膜瘢痕患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有患者淚膜得到恢復(fù)，基質(zhì)細(xì)胞被招募到植入物中。還觀察到患者神經(jīng)再生和觸摸敏感性恢復(fù)，與人類供體組織相比，兩者都達(dá)到更高的程度。通過進(jìn)一步優(yōu)化，生物合成角膜植入物可以提供一種安全有效的替代人體組織植入的方法，幫助解決目前供體角膜短缺的問題。隨后兩年，F(xiàn)agerholm 團(tuán)隊(duì)［107］開發(fā)了一種由碳二亞胺交聯(lián)重組人膠原蛋白組成的無細(xì)胞植入物，通過植入眼角膜細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了角膜再生，在4 年多的時(shí)間里，再生的新角膜穩(wěn)定整合在一起，無排斥反應(yīng)，也沒有發(fā)生供體角膜患者所需的長期免疫抑制機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明，由碳二亞胺交聯(lián)重組人膠原蛋白組成的無細(xì)胞植入物可以實(shí)現(xiàn)角膜的再生。因此，重組人膠原蛋白可作為良好的角膜修復(fù)植入物。

重組膠原蛋白與天然材料、合成材料、納米材料相結(jié)合的方式，能有效增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度，控制生物降解，有利于骨修復(fù)。Song等［108］基于類人膠原蛋白制備海綿狀多孔水凝膠支架，該水凝膠可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖與黏附，增強(qiáng)軟骨的修復(fù)，可作為軟骨組織工程的支架；Li 等［73］將重組類人膠原蛋白與納米羥基磷灰石相結(jié)合制備三維可降解多孔支架，可以承受（2.67±0.37）MPa 的壓縮應(yīng)力，該支架能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、均勻分布和豐富的GAG 合成，并保持天然軟骨細(xì)胞形態(tài)。Chen等［109］利用重組類人膠原蛋白與骨誘導(dǎo)劑（BMP）的結(jié)合，能有效促進(jìn)大面積骨缺損后大鼠的全面康復(fù)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)重組類膠原蛋白能有效維持成骨誘導(dǎo)和骨形成的骨誘導(dǎo)劑劑量的微小變化。同時(shí)，F(xiàn)an 等［110］制備了重組類人膠原蛋白與納米羥基磷灰石相結(jié)合的多孔復(fù)合支架，能有效提高骨組織工程的抗壓程度，該支架的抗壓強(qiáng)度和楊氏模量最大值分別為（2.97±0.19）MPa 和（43.03±6.17）MPa。

目前，重組膠原蛋白由于具有較好的生物相容性、更高的安全性以及對皮膚保濕修復(fù)明顯的特點(diǎn)，在膠原蛋白家族中占有重要地位。但目前重組膠原蛋白發(fā)展仍存在一些問題。為此，本文對重組膠原蛋白未來的發(fā)展有幾點(diǎn)展望：①現(xiàn)階段重組膠原蛋白的表達(dá)體系主要以大腸桿菌和酵母為主，利用大腸桿菌以及酵母所產(chǎn)生重組膠原蛋白雖然產(chǎn)量高，但大多數(shù)不具備三螺旋結(jié)構(gòu)，研究高等動植物的重組膠原蛋白表達(dá)體系的相關(guān)報(bào)道較少，未來可以考慮利用動植物等生產(chǎn)高產(chǎn)的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組人源性膠原蛋白；②國內(nèi)研究重組膠原蛋白大多數(shù)以工業(yè)生產(chǎn)為主，表達(dá)機(jī)制基礎(chǔ)研究較少，未來可深入研究重組膠原蛋白的不同表達(dá)機(jī)制，以期優(yōu)化表達(dá)體系，提高表達(dá)產(chǎn)量和質(zhì)量；③當(dāng)前重組膠原蛋白純化工藝與技術(shù)仍有較大的提升空間。隨著分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程等的學(xué)科發(fā)展，重組膠原蛋白的研究將進(jìn)一步深入，最終為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供更優(yōu)質(zhì)、更安全、更廉價(jià)的重組膠原蛋白原料。