一株4 型副豬嗜血桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

栗衛(wèi)東

（濟(jì)源市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河南濟(jì)源 459000）

副豬嗜血桿菌病是一種由巴氏桿菌科的副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）感染豬引起的以多發(fā)性纖維素性心包炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和漿膜炎為病理特征的細(xì)菌性傳染病[1]。病豬多表現(xiàn)為發(fā)燒，呼吸困難，關(guān)節(jié)腫脹，皮膚及黏膜發(fā)紺，部分豬可見(jiàn)共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀。副豬嗜血桿菌病在世界各地的養(yǎng)豬場(chǎng)均有發(fā)生，我國(guó)豬群的病死率一般為30%～40%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%[2]，斷奶仔豬和保育豬多發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。HPS 通常存在于豬的上呼吸道，為條件致病菌，健康豬并不發(fā)病，多在受到應(yīng)激、感染免疫抑制性豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬瘟等多種疾病影響下，豬機(jī)體免疫力降低，繼發(fā)HPS 病，加重豬的病情。HPS血清型較多，目前已發(fā)現(xiàn)15 個(gè)血清型，其他20%以上的分離株血清型未能定型[3]。國(guó)內(nèi)流行較多血清型主要有4、5、13、14。同一地區(qū)甚至不同豬場(chǎng)流行菌株血清型存在差異，不同的血清型之間缺乏交叉保護(hù)率，目前國(guó)內(nèi)使用的二價(jià)菌苗（4、5 血清型）無(wú)法對(duì)其他血清型起到有效免疫效果[4]。防治HPS 臨床用藥多使用抗生素，然而長(zhǎng)期不合理地使用抗生素容易導(dǎo)致菌株耐藥性增強(qiáng)，給養(yǎng)豬場(chǎng)治療該病帶來(lái)困難。此外，通過(guò)藥敏試驗(yàn)可以監(jiān)測(cè)HPS 對(duì)抗生素的耐藥情況，為臨床合理用藥指明方向。本研究對(duì)河南省濟(jì)源市某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)疑似HPS 病豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，通過(guò)對(duì)分離菌株純化培養(yǎng)、PCR 擴(kuò)增和血清分型，鑒定分離菌株為4 型HPS，并對(duì)該菌株藥敏性分析，旨在為副豬嗜血桿菌病防治提供精準(zhǔn)的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 HPS 病料

采集河南省濟(jì)源市某規(guī)?；i場(chǎng)臨床疑似HPS 病死豬的肺臟、心臟、關(guān)節(jié)液、胸腹腔液等組織樣品。

1.2 HPS 標(biāo)準(zhǔn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清

1～15 型HPS 標(biāo)準(zhǔn)菌株，1～15 型HPS 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽(yáng)性血清，均來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要試劑和儀器

巧克力培養(yǎng)基、7%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆固體培養(yǎng)基（TSA）固體培養(yǎng)基等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管、24 種藥敏紙片購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA 基因抽提試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；dNTP Mix、10×Buffer、Taq 酶、DL-2 000 Marker，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；多功能梯度PCR 擴(kuò)增儀由Thermo Fisher 公司生產(chǎn)。

1.4 細(xì)菌分離鑒定

1.4.1 細(xì)菌純化培養(yǎng)與鏡檢

無(wú)菌采集病料接種于7%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，置入恒溫箱，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落接種于巧克力培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后挑取單個(gè)菌落分別接種于巧克力培養(yǎng)基和TSA 固體培養(yǎng)基上，挑取菌落在TSB 培養(yǎng)基純化生長(zhǎng)，7℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，制作涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 生化鑒定

分離菌株生化試驗(yàn)鑒定，按照細(xì)菌微量生化鑒定管說(shuō)明書(shū)操作，37℃培養(yǎng)24 h，觀察各生化鑒定管結(jié)果。

1.4.3 PCR 鑒定

根據(jù)Oystein 等[5]、Howell 等[6]研究方法，針對(duì)HPS vanY 基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)用于擴(kuò)增鑒定HPS 引物P1、P2，P1：5'-ACAACCTGCAAGTACTTATCGGGAT-3'，P2：5'-TAGCCTCCTGTCTGATATTCCCACG-3'，預(yù)期大小276 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分離菌株DNA 模板按照細(xì)菌DNA 基因抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，無(wú)菌接種病料于TSB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)菌液裝入1.5 mL 離心管，加20 μL ddH2O，沸水浴10 min，-20℃冰浴10 min，12 000 rpm，離心10 min，取上清液作為分離菌株DNA基因組模板。擴(kuò)增體系體積為25 μL：10×PBS 緩沖液2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DNA 模板1 μL，Taq 酶1 μL，10 μmol/L P1、P2 引物各1 μL，加入ddH2O 至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃5 min；94℃1 min，58℃1 min，72℃45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.5 血清型分型

1.5.1 瓊脂擴(kuò)散法分型

根據(jù)徐引弟等[7]的研究方法，將分離菌株接種于TSB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36 h，挑取菌落加入裝有pH 值為7.2、10 mL 緩沖液的滅菌管，8 000 rpm 離心3 min，棄去上清液，再加入體積為管內(nèi)沉淀物9 倍的PBS，混勻，120℃高壓2 h，取出后8 000 rpm 離心5 min，上清液即為用作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的分型抗原。將8.5 g 和1 g瓊脂糖放入100 mL PBS 緩沖液，加熱溶解，倒入平板，用打孔器在平板中央打1 個(gè)直徑3 mm 的孔，周圍打5個(gè)同樣孔，孔間距4 mm，分型抗原加入中央孔，周圍孔加入1～15 型HPS 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽(yáng)性血清，放入塑料濕盒，37℃36 h，觀察結(jié)果。

1.5.2 PCR 擴(kuò)增分型

根據(jù)王同兆等[8]的試驗(yàn)方法，針對(duì)HPS wciP 基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)用于擴(kuò)增鑒定4 型HPS 的特異性引物P3、P4，P3：5'-GGTTAAGAGGTAGAGCTAAGAATAGAG G3'，P4：5'-CTTTCCACAACAGCTCTAGAAACC-3'，預(yù)期大小349 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參照1.4.2 中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，用引物P3 和P4 進(jìn)行分離菌株P(guān)CR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，用BLAST 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的參考菌株同源性比對(duì)分析。

1.6 藥敏試驗(yàn)

挑取分離菌株HPS 放入滅菌生理鹽水，渦旋振蕩混勻，調(diào)整濃度至0.5 個(gè)麥?zhǔn)媳葷岫?。用棉拭子將菌懸液均勻涂布于TSA 培養(yǎng)基，自然晾干，藥敏紙片平貼培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36 h，測(cè)量藥物的抑菌圈直徑大小。按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI M100—S25，2015 版）標(biāo)準(zhǔn)判耐藥結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌純化培養(yǎng)和鏡檢

在7%綿羊血培養(yǎng)基上可見(jiàn)邊緣整齊、圓形、灰白色菌落；在TSA 培養(yǎng)基上可見(jiàn)光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、灰白色的菌落，直徑為1～2 mm；在巧克力培養(yǎng)基上可見(jiàn)表面隆起、圓形、光滑整齊、灰白半透明的菌落。鏡檢結(jié)果，菌體為細(xì)絲狀、球狀、短桿狀等多種形態(tài)。

2.2 生化鑒定結(jié)果

分離菌株接觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，氧化酶、脲酶、吲哚、鳥(niǎo)氨酸脫氫酶均呈陰性，不分解甘露醇，能分解蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和阿拉伯糖。生化特性符合副豬嗜血桿菌，初步鑒定分離菌株為副豬嗜血桿菌。

2.3 PCR 鑒定結(jié)果

細(xì)菌PCR 擴(kuò)增獲得1 條目的基因條帶，長(zhǎng)度為276 bp，符合預(yù)期大小，結(jié)果判定為副豬嗜血桿菌，見(jiàn)圖1。

圖1 分離菌PCR 鑒定結(jié)果

2.4 血清型分型

2.4.1 瓊脂擴(kuò)散法分型結(jié)果

中央孔內(nèi)的分型抗原和4 型HPS 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清之間有沉淀線出現(xiàn)，而其他型血清無(wú)沉淀線，證實(shí)分離菌株為4 型HPS。

2.4.2 PCR 血清型鑒定結(jié)果

用4 型HPS 特異性引物P3、P4 對(duì)分離菌的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得1 條目的條帶，長(zhǎng)度為349 bp。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用BLAST 生物軟件，與GenBank 中4 型HPS 參考菌株SW124（登錄號(hào)：KC795356）基因序列同源性比對(duì)，同源性為100%，證實(shí)該分離菌株為4 型HPS。見(jiàn)圖2。

圖2 分離菌PCR 分型鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可知，分離的4 型副豬嗜血桿菌菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、氨芐西林、阿莫西林敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、阿米卡星、鏈霉素、多西環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素等產(chǎn)生耐藥性。

表1 副豬嗜血桿菌耐藥性分析結(jié)果

3 討論

豬的副豬嗜血桿菌廣泛存在于我國(guó)各地養(yǎng)豬場(chǎng)中，成為重要的細(xì)菌性疫病，其防控仍具有挑戰(zhàn)性。HPS 是一種非溶血性、多形態(tài)、無(wú)芽孢、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性菌，兼性厭氧和依賴V 因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）生長(zhǎng)[9]。由于其生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境條件要求高，在采集病料和分離純化培養(yǎng)中應(yīng)注意采集部位、抗生素使用、培養(yǎng)基選擇等因素對(duì)該細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。有報(bào)道，HPS 主要侵染上呼吸道和肺部，且長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素的豬難以分離出病原菌，因此，病料采集重點(diǎn)在鼻腔、呼吸道和肺部，并結(jié)合豬的臨床表現(xiàn)采集相應(yīng)的組織器官，以提高檢出率[10]。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)比較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且準(zhǔn)確率不高，采用分子生物技術(shù)PCR 可以提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，并能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步血清分型[11]。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化試驗(yàn)的同時(shí)，利用PCR 擴(kuò)增技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)和血清分型，找到本次疫情的致病菌HPS 的主要血清型，為下一步有效防控提供了明確方向。

在HPS 標(biāo)準(zhǔn)血清型中，1、5、10、12、13 和14 被認(rèn)為是強(qiáng)毒性毒株，2、4、15 和8 被認(rèn)為是弱毒性毒株，血清型3、6、7、9 和11 被認(rèn)為是無(wú)毒性毒株。血清型4 和5 在我國(guó)最流行，其次是血清型7、12、13 和14[12]。HPS 血清型的存在具有地區(qū)差異性，不同地區(qū)甚至不同豬場(chǎng)由于用藥習(xí)慣、飼養(yǎng)管理等不同，其血清型也不同[13]。其流行特點(diǎn)與不同血清型菌株毒力、豬群免疫、抗生素使用、應(yīng)激和疫苗接種程序等有直接關(guān)系[14,15]。本研究分離菌株為4 型HPS，屬于弱毒性菌株，也是我國(guó)流行菌株，本次樣本來(lái)源于一個(gè)豬場(chǎng)，對(duì)于濟(jì)源市其他養(yǎng)豬場(chǎng)中存在的HPS 血清型是否為4-HPS，需要進(jìn)一步檢測(cè)?？股匾廊皇怯行Х揽睾椭委熢摬〉氖走x藥物，但由于耐藥性成為阻礙抗生素發(fā)揮治療效果的棘手難題，使得開(kāi)展耐藥性監(jiān)測(cè)成為必要。通過(guò)藥敏試驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)榕R床用藥提供參考，避免盲目濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性擴(kuò)大。

本次藥敏結(jié)果顯示，在10 種抗生素種，分離的副豬嗜血桿菌菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、氨芐西林、阿莫西林敏感，其他表現(xiàn)為耐藥。因此，臨床防治要選擇敏感藥物，并交叉輪換用藥，提高治療效果。

4 小結(jié)

綜上所述，副豬嗜血桿菌在豬場(chǎng)中都有存在，而有的豬場(chǎng)豬群會(huì)發(fā)病，有的豬群則不發(fā)病。且發(fā)現(xiàn)HPS 的致病機(jī)制尚不清楚，且存在多種血清型，各血清型之間缺乏免疫保護(hù)，發(fā)病菌血清型與疫苗血清型不同，造成疫苗免疫失敗。因此，針對(duì)本場(chǎng)疫情，應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷找到具體的血清型，或者應(yīng)用自家苗預(yù)防副豬嗜血桿菌感染。