基于CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制耐鹽香稻

李景芳 溫舒越 趙利君 陳庭木 周振玲 孫志廣 劉艷 陳海元 張?jiān)戚x 遲銘 邢運(yùn)高 徐波 徐大勇 王寶祥,*

基于CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制耐鹽香稻

李景芳1溫舒越2趙利君2陳庭木1周振玲1孫志廣1劉艷1陳海元3張?jiān)戚x3遲銘1邢運(yùn)高1徐波1徐大勇1王寶祥1,*

(1連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 江蘇 連云港 222000；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南京 210095；3江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所, 南京 210014；*通信聯(lián)系人，email：wbxrice@163.com)

【目的】為了促進(jìn)耐鹽香稻育種，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)粳稻品種連粳11的和基因進(jìn)行編輯，以期快速獲得一批不含有轉(zhuǎn)基因成分且具有耐鹽性和香味的純合水稻材料。【方法】根據(jù)和基因序列中編輯位點(diǎn)的敲除效率設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，構(gòu)建pH-Ubi-Cas9--敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入受體品種連粳11中。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行潮霉素和Cas9標(biāo)記PCR檢測以及靶基因測序，獲得無外源基因插入的-純合株系，并對(duì)后代種子性狀和苗期耐鹽性進(jìn)行分析。【結(jié)果】T2代成熟種子中2-AP含量較背景材料連粳11顯著增加，千粒重、粒長、粒寬無明顯變化；128 mmol/L氯化鈉處理14 d后株系21-30較連粳11苗高增加15.2%，苗鮮質(zhì)量增加45.2%，苗干質(zhì)量增加13.2%。【結(jié)論】利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)和基因編輯獲得能穩(wěn)定遺傳且無外源基因插入的耐鹽香稻材料，加快了水稻多性狀聚合的選育進(jìn)程。

水稻; CRISPR/Cas9; 耐鹽; 香味;;

土壤鹽堿化是制約水稻生產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一。我國鹽堿地面積廣，綜合利用潛力巨大。培育能夠利用沿海灘涂資源的耐鹽水稻品種是增加土地利用率、提高水稻種植面積和產(chǎn)量的重要途徑。

近年來，水稻中大量耐鹽相關(guān)基因被報(bào)道，如[1][2][3][4]、[5]、[6]等水稻耐鹽正調(diào)控基因以及[7]、[8]、[9]、[10]等水稻耐鹽負(fù)調(diào)控基因。其中，編碼一個(gè)包含696個(gè)氨基酸的B型反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，它的功能缺失顯著提高了耐鹽性。Zhang等[11]通過CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯基因顯著提高了水稻耐鹽性。研究者也通過RNAi[8, 12]、T-DNA插入[13]、基因編輯[14]等手段獲得一系列耐鹽水稻材料。

優(yōu)質(zhì)米已經(jīng)成為我國水稻生產(chǎn)的發(fā)展方向，米飯的香味是影響食味品質(zhì)的重要因素之一?？刂扑鞠阄兜膿]發(fā)性物質(zhì)種類有很多，而絕大多數(shù)香米與普通大米2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量存在顯著差異，2-AP的含量也常被用來評(píng)價(jià)稻米是否具有香味的重要參考指標(biāo)[15]。水稻香味調(diào)控基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，其突變使得BADH2蛋白功能喪失，導(dǎo)致γ-氨基丁醛積累，導(dǎo)致2-AP含量增加，使稻米具有香味[16-17]。目前已有很多報(bào)道通過TALEN[18]、CRISPR/Cas9[19]等技術(shù)對(duì)水稻基因進(jìn)行定向修飾，使BADH2蛋白功能缺失，成功創(chuàng)制具有香味的水稻。

對(duì)現(xiàn)有水稻品種性狀進(jìn)行改良或者研發(fā)出具有優(yōu)異性狀的品種是許多研究者一直努力的方向，目前選育優(yōu)質(zhì)抗逆品種主要是通過雜交和回交改良等常規(guī)育種手段，品種選育周期長，CRISPR/Cas9技術(shù)作為應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)，可以對(duì)內(nèi)源基因組進(jìn)行敲除、插入、堿基替換、點(diǎn)突變等修飾，快速改良品種關(guān)鍵性狀，克服基因連鎖效應(yīng)帶來的障礙，獲得具有優(yōu)良性狀的新品種，未來可能在水稻遺傳育種改良中發(fā)揮重要作用。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)連粳11水稻品種的耐鹽和香味基因同時(shí)進(jìn)行編輯，對(duì)轉(zhuǎn)基因分離后代進(jìn)行鑒定，篩選既耐鹽又具有香味且不含有外源基因插入的純合株系，以期為商業(yè)化育種技術(shù)的創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以連粳11為遺傳轉(zhuǎn)化受體，開展遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因研究

通過NCBI網(wǎng)站獲得（Os08g0424500）和（Os06g0183100）基因組序列，登錄CRISPR-GE網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/）設(shè)計(jì)、基因靶位點(diǎn)，前引物為靶點(diǎn)序列5’端加上GGCA堿基，后引物為靶序列反向互補(bǔ)后5’端加上AAAC堿基（表1），通過酶切、連接分別構(gòu)建兩個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA入門載體，進(jìn)一步酶切、連接，將和基因靶標(biāo)sgRNA連接形成一個(gè)入門載體并與pH-Ubi-Cas9載體連接構(gòu)建水稻最終表達(dá)載體[20]。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因測序由南京擎科生物有限公司完成。測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105菌株中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染連粳11愈傷組織，并通過愈傷組織的篩選和分化等步驟獲取轉(zhuǎn)基因植株。

1.3 PCR鑒定及分析

1.3.1 T0代植株轉(zhuǎn)基因鑒定

分蘗前期取連粳11和轉(zhuǎn)基因植株葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，用潮霉素標(biāo)記進(jìn)行PCR鑒定，挑選T0代轉(zhuǎn)基因陽性株系種植。

1.3.2 T1代植株轉(zhuǎn)基因鑒定

分蘗前期取葉片，提取DNA，用潮霉素引物和Cas9標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，剔除含有外源片段的植株，將不含有載體片段的植株用含有靶位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序，測序結(jié)果使用DSDecodeM網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）和BioXM軟件分析，選取、編輯成功且純合的株系后代用于香味和耐鹽性鑒定。

1.4 耐鹽性鑒定

連粳11和基因編輯T1代純合種子用75%酒精消毒，室溫下浸種2ｄ，催芽1 d至種子露白，將露白種子播到底部剪開的96孔PCR板中進(jìn)行水培，2～3 d換一次水。待幼苗長至1葉１心時(shí)，換成IRRI營養(yǎng)液培養(yǎng)[21]，每2～3 d更換一次營養(yǎng)液。當(dāng)幼苗長至兩葉一心時(shí)，用含128 mmol/L NaCl的IRRI營養(yǎng)液培養(yǎng)[11, 22]，以標(biāo)準(zhǔn)IRRI營養(yǎng)液作為對(duì)照，每2～3 d更換一次營養(yǎng)液，處理2周后，拍照，測定苗高、苗鮮質(zhì)量、苗干質(zhì)量，并進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)。所有測定均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。耐鹽相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平測定，以作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)采用2?法進(jìn)行分析[23]。

1.5 基因編輯后代表型分析

將成熟的連粳11和基因編輯T2代種子置于烘箱中60℃下烘至恒重，考查千粒重，并對(duì)粒長、粒寬進(jìn)行測定。稻米香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀測定[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因編輯載體的構(gòu)建

基因包含15個(gè)外顯子，基因包含6個(gè)外顯子，利用CRISPR-GE在線設(shè)計(jì)和基因靶位點(diǎn)，選取兩個(gè)分別位于第6外顯子和第3外顯子上的靶位點(diǎn)，對(duì)和基因進(jìn)行編輯（圖1-A）。

A―Badh2和OsRR22基因結(jié)構(gòu)及靶位點(diǎn)位置信息，綠色堿基代表PAM序列；B―Badh2和OsRR22基因靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體構(gòu)建；C―表達(dá)載體中靶位點(diǎn)測序結(jié)果。

Fig. 1.andtarget sites and CRISPR/Cas9vector construction.

水稻pH-Ubi-Cas9終轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建完成后（圖1-B），進(jìn)行靶位點(diǎn)測序，載體測序結(jié)果表明設(shè)計(jì)靶點(diǎn)序列能夠完全比對(duì)（圖1-C），將測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中并開展后續(xù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。

表1 本研究中使用的引物

2.2 Badh2-OsRR22的編輯及無標(biāo)記后代的鑒定

將和基因編輯載體轉(zhuǎn)化到連粳11的愈傷組織中，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得T0代轉(zhuǎn)基因苗，利用潮霉素標(biāo)記篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行下一代繁殖。

分別提取T1代轉(zhuǎn)基因單株DNA，通過Cas9載體引物篩選無外源標(biāo)記的株系（圖2），并對(duì)篩選到的無外源標(biāo)記的株系進(jìn)行靶位點(diǎn)突變信息檢測，共檢測到6種不同的純合雙突變植株，其中，基因有4種突變類型，分別為插入A、缺失TA、缺失AGTCCTATA和缺失TAT。插入A導(dǎo)致蛋白翻譯過程中第267I→N、268V→S、269V→G、270F→V位氨基酸的替換，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止；缺失TA導(dǎo)致第267I→S、268V→G位氨基酸的替換，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止；缺失AGTCCTATA，導(dǎo)致第265S、266P、267I位這3個(gè)氨基酸的缺失；缺失TAT導(dǎo)致第267I位氨基酸缺失?；蛴胁迦隩、插入G和34 bp缺失等3種突變類型，分別導(dǎo)致出現(xiàn)一段氨基酸的替換后終止翻譯（圖3）。

M―DNA標(biāo)記；“+”―陽性對(duì)照；“?”―陰性對(duì)照；1～9為T1代部分植株。Cas9標(biāo)記目標(biāo)片段大小為906 bp。

Fig. 2. Identification of Cas9 markers in some T1plants.

紅色箭頭表示突變位置?！?”代表插入；“-”代表缺失。黑色箭頭表示氨基酸位置。

Fig. 3. Mutation types at theandloci of the homozygous lines in T1

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*和**分別表示在5%和1%水平上差異顯著(t檢驗(yàn))。

Fig. 4. Salt tolerance identification of T2homozygous lines 21-30, 21-31 at the seedling stage.

2.3 基因編輯水稻耐鹽性鑒定

為了對(duì)基因編輯后代進(jìn)行耐鹽性鑒定，我們挑選了T2代兩個(gè)純合株系21-30、21-31進(jìn)行溫室苗期耐鹽性鑒定。分別使用水稻營養(yǎng)液和含有128 mmol/L氯化鈉的營養(yǎng)液處理，數(shù)據(jù)分析表明鹽處理?xiàng)l件下21-30和21-31株系苗高、苗鮮質(zhì)量和苗干質(zhì)量均顯著高于連粳11。21-30苗高較連粳11增加15.2%，苗鮮質(zhì)量增加45.2%，苗干質(zhì)量增加13.2%（圖4）。因此，與連粳11相比，基因編輯后代的耐鹽性增強(qiáng)。

對(duì)水稻耐鹽相關(guān)基因、、、、的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，定量結(jié)果顯示與連粳11相比，5個(gè)耐鹽調(diào)控基因均上調(diào)表達(dá)，其中、和在基因編輯后代中表達(dá)量顯著升高（圖5），表明基因編輯引起了耐鹽相關(guān)基因表達(dá)的改變。

數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示在5%水平上差異顯著(t檢驗(yàn))。

Fig. 5. Relative expression levels of salt resistance related genes in the wild-type and its T2line 21-30.

2.4 T2代植株農(nóng)藝性狀和2-AP含量測定

將野生型連粳11與T2代21-30、21-31株系成熟種子進(jìn)行比較，與野生型相比，21-30、21-31后代千粒重、粒長、粒寬均無明顯差異。利用GC-MS對(duì)連粳11、21-30和21-31株系種子中2-AP物質(zhì)含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)21-30和21-31種子中2-AP含量分別為0.277 mg/kg、0.294 mg/kg，而在連粳11種子中未檢測到2-AP（圖6）。

數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。**表示在1%水平上差異顯著 (t檢驗(yàn))。

Fig. 6. Performance of rice yield and fragrance related traits in the wild-type and its positive transgenic lines.

3 討論

連云港屬于沿海城市，大面積沿海灘涂地不適合種植水稻等農(nóng)作物，目前選育的適宜該地區(qū)種植的耐鹽水稻品種相對(duì)匱乏，選育高耐鹽水稻品種可以增加土地利用率，提高水稻種植面積和產(chǎn)量。香味是一種特色的水稻品質(zhì)，也是稻米重要的品質(zhì)指標(biāo)。選育耐逆的優(yōu)質(zhì)稻米品種是近年來育種的主要目標(biāo)，雜交育種技術(shù)是水稻傳統(tǒng)育種的主要方法。與傳統(tǒng)育種方法相比，基因編輯技術(shù)具有編輯效率高、不攜帶外源基因等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)使基因定向修飾更為簡便，是水稻種質(zhì)改良技術(shù)中的重大突破，加快了水稻育種進(jìn)程。本研究針對(duì)連云港地區(qū)水稻品種種植需求，利用基因編輯技術(shù)以耐鹽負(fù)調(diào)控基因和香味調(diào)控基因?yàn)榘袠?biāo)基因，構(gòu)建雙基因串聯(lián)的CRISPR/Cas9基因敲除載體，轉(zhuǎn)入到連粳11愈傷組織中，對(duì)兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，通過轉(zhuǎn)基因后代鑒定，獲得無外源標(biāo)記且穩(wěn)定遺傳的耐鹽香味水稻株系。

利用基因編輯技術(shù)改良水稻的報(bào)道已有很多，如抽穗期、抗稻瘟病、香味、直鏈淀粉含量、粒型等性狀的改良，但同時(shí)對(duì)耐鹽和香味基因進(jìn)行編輯的報(bào)道較少。Xu等[24]利用堿基精準(zhǔn)編輯技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行三個(gè)靶位點(diǎn)的編輯，獲得了直鏈淀粉含量為1.4%～11.9%的一系列水稻突變體，一方面為水稻品質(zhì)改良育種創(chuàng)制了新資源，另一方面也為水稻品質(zhì)精準(zhǔn)育種和快速改良提供了新思路。Liu等[25]利用基因編輯技術(shù)對(duì)的上游開放閱讀框(uORF)進(jìn)行編輯，可以使水稻實(shí)現(xiàn)不同程度延遲開花（4.6～11.2 d）的目的，對(duì)未來微效改變水稻開花性狀的研究提供重要依據(jù)。徐善斌等[26]以、和為靶基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體，轉(zhuǎn)入到龍粳11中，獲得無T-DNA元件的純合長粒香型水稻。

和分別為水稻耐鹽性和香味的負(fù)調(diào)控基因。本研究構(gòu)建了和的雙基因敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)到連粳11中，對(duì)這2個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，獲得了耐鹽香型水稻材料。通過對(duì)后代轉(zhuǎn)基因株系的篩選，獲得6個(gè)不含有外源基因的純合基因編輯株系，對(duì)其中21-30和21-31株系種子中2-AP含量測定結(jié)果表明香味物質(zhì)含量增加至0.277和0.2294 mg/kg，苗期耐鹽性較連粳11顯著增強(qiáng)，且轉(zhuǎn)基因株系千粒重、粒長、粒寬等性狀無明顯差異，以上純合株系的獲得為耐鹽香型水稻的培育提供技術(shù)支撐和育種材料。

謝辭：北京大學(xué)瞿禮嘉教授課題組提供了本研究所用的CRISPR載體，在此深表謝意。

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Development of Aromatic Salt-tolerant Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology

LI Jingfang1, WEN Shuyue2, ZHAO Lijun2, CHEN Tingmu1, ZHOU Zhenling1, SUN Zhiguang1, LIU Yan1, CHEN Haiyuan3, ZHANG Yunhui3, CHI Ming1, XING Yungao1, XU Bo1, XU Dayong1, WANG Baoxiang1,*

(1Lianyungang Academy of Agricultural Science, Lianyungang 222000, China;2Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;3Institute of Germplasm Resources and Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, email: wbxrice@163.com)

【Objective】It is of importance to promotesalt-tolerant and fragrant rice breeding. We obtainedtransgene free homozygous rice materials with salt-tolerance and fragrance by CRISPR/Cas9-mediated editing ofandinvariety Lianjing 11. 【Method】Targetsites were designed according to knockout efficiency of editing sites inandgene sequence. The pH-Ubi--knockout vector was constructed and transferred into the recipient variety Lianjing 11 by the-mediated technology. PCR detection for hygromycin, Cas9 marker and target gene sequencing were performed in thetransgenic progenies to obtain-homozygous lines without exogenous gene insertion. The seed traits and salt tolerance at seedling stage were analyzed. 【Result】Compared with the background material Lianjing 11, the 2-AP content ofT2significantly increased. After treated with 128 mmol/L NaCl solution for 14 days, the seedling height, the fresh and the dry weight of T2line 21-30 increased by 15.2%,45.2% and 13.2%, respectively. 【Conclusion】The successfulediting ofandby CRISPR/Cas9 technology developed aromatic salt-tolerant homozygous lines without exogenous gene insertion, speeding up the breeding process of pyramiding multiple traitsin rice.

rice; CRISPR/Cas9; salt-tolerant; fragrance;;

10.16819/j.1001-7216.2023.220907

2022-09-28;

2022-12-19。

連云港市財(cái)政專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（QNJJ2102; QNJJ2211; QNJJ1803）；江蘇省農(nóng)業(yè)重大品種創(chuàng)制計(jì)劃資助項(xiàng)目（PZCZ201704）；江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃（蘇北科技專項(xiàng)）資助項(xiàng)目（LYG-SZ202040）。