免疫層析信號放大技術(shù)及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的研究進展

賈軼靜，唐毓婧，李曉敏，鄧瑩楠，周 隴，郭子芳

（中石化（北京）化工研究院有限公司 中國石化醫(yī)用衛(wèi)生材料研究與應(yīng)用重點實驗室，北京 100013）

免疫層析測定（ICA）是一種基于特異性抗原-抗體識別反應(yīng)檢測目標(biāo)分析物的方法，具有高特異性和準(zhǔn)確性，已經(jīng)成功實現(xiàn)了對復(fù)雜生物體中蛋白質(zhì)、激素、核酸、藥物等物質(zhì)的快速靈敏檢測[1-3]。與傳統(tǒng)的實驗室檢測方法相比，ICA具有成本低、操作簡單、分析時間短、特異性強和結(jié)果容易判讀等特點，是應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)，對于疾病的早期臨床診斷具有重要的應(yīng)用價值[4-6]。隨著體外免疫診斷技術(shù)的不斷更新，對ICA的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性提出了更高的要求[7]。然而，傳統(tǒng)的ICA將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合，檢測靈敏度相對較低，通常僅可實現(xiàn)定性和半定量的檢測，無法滿足實際生物分析應(yīng)用中低豐度物質(zhì)的檢測需要[8]。值得注意的是，微弱的輸出信號和基質(zhì)干擾是ICA實現(xiàn)精準(zhǔn)檢測面臨的主要挑戰(zhàn)[9]。因此，迫切需要開發(fā)信號放大策略以提高檢測靈敏度，進一步增強生物傳感能力，從而滿足當(dāng)前對生物醫(yī)藥、臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的檢測要求。

本文介紹了ICA的基本原理以及增強分析信號的方法，總結(jié)了免疫標(biāo)記材料的選擇及該技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進展，同時對未來的研究方向進行了展望，以期為免疫層析信號放大技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 ICA的原理

ICA主要借助免疫層析試紙條完成，是一種采用有色或發(fā)光納米顆粒等材料標(biāo)記抗體作為信號標(biāo)簽的膜基快速檢測平臺，也是即時診斷（POCT）領(lǐng)域最常采用的技術(shù)[10-11]。免疫層析試紙條的典型結(jié)構(gòu)見圖1，主體包括五部分：試樣墊、結(jié)合墊、檢測線、控制線和吸收墊。結(jié)合墊包含免疫標(biāo)記材料與特異性抗體共軛生成的免疫標(biāo)記試劑。將待測物滴到試樣墊上，通過毛細(xì)作用在層析試紙條上移動，到達結(jié)合墊后，待測物與免疫標(biāo)記試劑反應(yīng)形成免疫標(biāo)記結(jié)合物，然后移動至檢測線區(qū)域，與檢測線上包被的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測線上，通過肉眼或與熒光儀等儀器聯(lián)用可以判讀檢測結(jié)果。

圖1 免疫層析試紙條的典型結(jié)構(gòu)Fig.1 Typical structure of lateral flow immunochromatographic test strip.PVC：polyvinyl chloride.

根據(jù)待測分子的大小和結(jié)合方式的不同，ICA主要分為雙抗體夾心法和競爭法。雙抗體夾心法適用于較大分子量或具有多個結(jié)合位點的分析物，例如各種蛋白質(zhì)等大分子抗原；競爭法適用于小分子物質(zhì)，例如半抗原、激素以及藥物。雙抗體夾心法的原理是大分子抗原分別與兩種抗體結(jié)合，利用捕獲抗體（固定于結(jié)合墊）和檢測抗體（固定于檢測線）在試紙條上形成夾心復(fù)合物，通過標(biāo)記物產(chǎn)生的響應(yīng)信號進行測定[12]。以膠體金ICA為例，如果試樣中不含待測抗原，僅控制線顯色，結(jié)果為陰性；如果檢測線和控制線均顯色，結(jié)果為陽性，控制線的作用是用來驗證檢測結(jié)果是否有效。如果是具有單一抗原決定簇的小分子量分析物，不能同時與兩種抗體結(jié)合，則采用競爭法[13]。在競爭法測試中，檢測線用待測抗原或抗原類似物處理，小分子會阻斷檢測線上抗體的結(jié)合位點。以膠體金ICA為例，若樣本為陽性，則檢測線不顯色，控制線顯色；若樣本為陰性，則檢測線和控制線都顯色。檢測線顏色強度與待測物的含量成反比。

2 免疫層析信號放大技術(shù)

ICA可對靶標(biāo)分子實現(xiàn)可視化、現(xiàn)場快速篩選，靈敏度與免疫標(biāo)記材料的光學(xué)性能和免疫測定的信號輸出模式緊密相關(guān)[14]。新型光學(xué)材料的不斷涌現(xiàn)，不僅為ICA的發(fā)展提供了內(nèi)生動力，而且推動ICA向高特異性和高靈敏度的方向發(fā)展，實現(xiàn)從定性至定量檢測的轉(zhuǎn)變。

此外，免疫測定的模式影響信號輸出的形式和檢測靈敏度。通過合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計，將兩種或多種信號放大策略組合到一個ICA系統(tǒng)中，可以實現(xiàn)更低的檢測限和更高的靈敏度[15]。因此，基于ICA免疫測定模式設(shè)計的信號放大策略在高靈敏度、小型化的免疫傳感系統(tǒng)的開發(fā)中發(fā)揮著重要作用，特別是在疾病早期用于痕量的特定生物標(biāo)志物的檢測。免疫層析的信號放大策略主要基于免疫標(biāo)記材料以及免疫測定模式設(shè)計。

2.1 基于免疫標(biāo)記材料的信號放大策略

納米材料由于優(yōu)越的信號放大作用，可以克服傳統(tǒng)材料的不足，達到良好的靈敏度和特異性從而備受青睞[16-18]。膠體金具有合成簡單、比表面積高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和易被修飾等特性，是使用最廣泛的ICA標(biāo)記材料。目前，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物的免疫標(biāo)記技術(shù)在病毒、抗生素以及真菌毒素等檢測方面已得到廣泛應(yīng)用，但它的靈敏度偏低，可能會導(dǎo)致假陰性[8]。為了拓寬ICA的應(yīng)用范圍，需要選擇信號強度更高的納米標(biāo)記材料。到目前為止，已開發(fā)出多種納米材料，包括量子點、熒光碳點、上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）、時間分辨熒光微球、磁性納米顆粒、納米酶，并創(chuàng)新地應(yīng)用于ICA，以提高靈敏度。

2.1.1 量子點

作為納米級熒光標(biāo)記材料，量子點通常由ⅡB和ⅥA族元素組成，具有發(fā)射光譜窄、Stocks位移大、量子產(chǎn)率高、光化學(xué)穩(wěn)定性好、可以減弱甚至消除背景熒光干擾等優(yōu)點，被視為ICA中有前途的標(biāo)記物[16，19]。許多研究已經(jīng)將基于量子點的ICA用于醫(yī)學(xué)診斷和食品安全中分析物的超靈敏檢測，但是檢測時需采用紫外光作為激發(fā)光源，儀器設(shè)備要求較高，操作步驟稍顯復(fù)雜，檢測成本較高。李朝輝課題組[20]使用生態(tài)友好型Cu-Zn-In-S/ZnS量子點作為信號報告物，開發(fā)了一種基于量子點的環(huán)境友好型熒光免疫試紙條，用于簡單、快速、高靈敏地檢測破傷風(fēng)抗體。此外，熊勇華課題組[21]通過微乳液技術(shù)封裝CdSe/ZnS量子點合成了增強型熒光探針量子點珠（QB），克服了單量子點僅包含單個抗原-抗體相互作用的缺點。使用QB-ICA傳感器時黃曲霉毒素B1的檢測限比先前報道的基于金納米顆粒的ICA的檢測限高約2個數(shù)量級，檢測信號得到顯著放大。

2.1.2 熒光碳點

熒光碳點是一類新型的無機碳發(fā)光材料，憑借合成簡易、發(fā)光性能優(yōu)異、生物相容性好、尺寸小、化學(xué)惰性強、易于表面修飾等優(yōu)點，成為生化傳感、光學(xué)成像及疾病診療的理想平臺[22]。然而，作為ICA標(biāo)記探針，小尺寸的碳點主要面臨兩個挑戰(zhàn)：一是表面生物修飾位點有限，且生物偶聯(lián)時會存在單個抗體同時偶聯(lián)多個碳點而導(dǎo)致熒光淬滅；二是單個碳點的熒光強度整體偏弱。針對上述問題，鄭建萍課題組[23]開發(fā)了一種一步碳化與高分子交聯(lián)制備熒光碳點的合成技術(shù)，制備出單分散、尺寸均一、量子效率高的熒光碳點，并證實了它在高靈敏免疫層析生物標(biāo)記平臺的構(gòu)建及食源性污染物快速篩選中的重要應(yīng)用潛力。

2.1.3 UCNPs

UCNPs通常由無機基質(zhì)和稀土摻雜離子組成，具有低自體熒光、高抗光漂白性、反Stocks光致發(fā)光特性，并且可以消除生物試樣中的背景熒光，從而提供優(yōu)異的信噪比，已被用作ICA標(biāo)記探針[24]。然而，它的光致發(fā)光效率低、親水性修飾效果弱以及與抗體結(jié)合性能較差，這是它用于ICA的重大挑戰(zhàn)。段宏偉課題組[25]研究了UCNPs的合成、表面修飾以及與抗體偶聯(lián)策略，通過親水改性方法制備出高親和力的核殼型探針，不僅保留了UCNPs在生物試樣檢測中的優(yōu)良基質(zhì)耐受性，而且在靈敏度、定量檢測范圍和成本方面均有所提高。

2.1.4 時間分辨熒光微球

時間分辨熒光微球作為一種特殊的功能微球，內(nèi)部包埋稀土-鑭系元素（如Eu3+，Tb3+，Sm3+，Dy3+）[26]。與普通熒光相比，時間分辨熒光具有更長的熒光壽命，Stocks位移大，可以消除背景干擾，實現(xiàn)更靈敏及特異性的測定[27]。將時間分辨熒光微球用于ICA的瓶頸是如何在熒光微球表面修飾合適密度的功能基團，用于與蛋白質(zhì)或抗體的共價偶聯(lián)，從而提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性。時間分辨熒光ICA對儀器設(shè)備要求較高，分析成本相對較高。李培武院士課題組[28]制備了具有增強熒光的新型Eu/Tb（Ⅲ）納米球，作為標(biāo)記物與抗獨特型納米抗體、單克隆抗體偶聯(lián)并用于時間分辨熒光ICA，首次實現(xiàn)玉米中雙真菌毒素的快速、定量和同時檢測，具有較高創(chuàng)新性。

2.1.5 磁性納米顆粒

磁性納米顆粒通常由鐵、鈷、鎳等金屬氧化物組成，具有穩(wěn)定、無毒、不易褪色、良好的磁導(dǎo)向性等特點[29]。作為免疫磁性分離劑，通過從多組分溶液中快速地富集和純化分析物，可以顯著降低基質(zhì)效應(yīng)。由于生物試樣中的磁性背景可忽略不計，信噪比極高，磁性納米顆粒也可作為免疫分析中的標(biāo)記探針。但是利用磁性納米顆粒標(biāo)記建立的ICA快速檢測技術(shù)需要借助外界磁場，實現(xiàn)信號富集。Bragina等[30]提出了結(jié)合磁性納米顆粒不同功能的ICA平臺，不僅避免了耗時的試樣制備，可有效進行預(yù)濃縮和磁富集，還可作為免疫復(fù)合物載體沿測試條遷移，成功用于食物中病原體的檢測。

2.1.6 納米酶

納米酶由特殊結(jié)構(gòu)的無機或有機納米材料組成，能夠模擬天然酶的生物催化功能，具有催化穩(wěn)定性高、制造成本低、易于調(diào)控、耐pH/溫度等特點[6，7，31]。采用納米酶作為信號標(biāo)簽，能夠整合由原始顏色產(chǎn)生的視覺比色信號和由過氧化物模擬酶活性產(chǎn)生的催化信號。此外，納米酶催化產(chǎn)生的信號通常較比色信號更敏感，不僅顯著提高了靈敏度，而且拓寬了檢測范圍[32]。將納米酶作為信號供體集成到ICA系統(tǒng)中，提供按需定量分析模式，可以滿足不同場景的檢測要求，有效提高ICA檢測的分析靈敏度。王建龍課題組[33]建立了具有良好生物相容性、易于功能化修飾的磁性納米酶介導(dǎo)的雙讀數(shù)按需免疫分析平臺，具有較好的重復(fù)性和可靠性，可滿足對同一目標(biāo)的不同檢測限要求。

2.2 基于免疫測定模式設(shè)計的信號放大策略

免疫層析試紙條的檢測性能與測定模式有關(guān)。為了滿足快速和超敏生物測定的要求，可以通過納米材料表面修飾、優(yōu)化信號輸出方式、改變檢測線上固定抗原或抗體的種類以及增加試樣預(yù)處理過程降低基質(zhì)效應(yīng)，從而提高ICA測定的靈敏度。

2.2.1 納米材料修飾蛋白酶標(biāo)記策略

在ICA中，除量子點、UCNPs、納米酶等標(biāo)記材料外，最有前途的信號增強工具之一是蛋白酶，特別是辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶。納米材料修飾蛋白酶標(biāo)記策略是將納米材料同時標(biāo)記單克隆抗體和蛋白酶得到雙標(biāo)記探針，結(jié)合蛋白酶高效的催化作用，使檢測線顏色加深，顯著增強檢測效果[9，12-13，34]。張學(xué)記課題組[35]采用HRP作為擴增工具，設(shè)計了一種基于雙標(biāo)記納米探針的酶擴增ICA生物傳感器，用于miRNA-224可視化檢測。將DNA識別探針和HRP信號放大酶同時固定在金納米顆粒表面構(gòu)建酶基雙標(biāo)記納米探針，通過靶標(biāo)miRNA-224與DNA識別探針在檢測線區(qū)域形成“夾心結(jié)構(gòu)”。HRP與酶底物之間的酶促反應(yīng)會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，這些產(chǎn)物沉積在納米探針表面，以增強檢測線的視覺效果和響應(yīng)強度，檢測限比單標(biāo)記ICA提高了10倍。

2.2.2 雙信號讀數(shù)比率測定策略

雙信號讀數(shù)的自校準(zhǔn)能力已被廣泛認(rèn)為可以顯著提高免疫測定的準(zhǔn)確性、靈敏度和抗干擾能力[15，31-32，36]。產(chǎn)生比率信號的傳統(tǒng)方法是熒光/生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET/BRET）。由于供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜重疊，能量轉(zhuǎn)移效率會受到供體與受體距離的嚴(yán)格限制。因此，F(xiàn)RET/BRET用于ICA存在限制。基于三原色理論產(chǎn)生比率信號的新方法不需要激發(fā)光，對檢測條件的要求較低，不需考慮示蹤物之間的距離和光譜的限制，同時可在復(fù)雜的光環(huán)境下保持檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。華修德課題組[37]以苯噻菌酯為典型對象，將競爭和非競爭免疫分析集成在同一免疫層析試紙條上，檢測線顏色隨分析物濃度的變化呈現(xiàn)不同的變化，比率信號使其在定量檢測時表現(xiàn)出更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。

2.2.3 降低基質(zhì)效應(yīng)信號放大策略

在傳統(tǒng)的免疫色譜法中，ICA條帶中檢測線都是靶向特異性的，其中特異性抗原或抗體被固定在檢測線上。由于空間位阻，檢測線上的抗原或抗體固定可能會減少有效識別位點的數(shù)量，因此限制了它的靈敏度。檢測線上的免疫識別反應(yīng)的時間間隔有限且不可控，也會對靈敏度產(chǎn)生負(fù)面影響。增加試樣前處理過程，有效降低基質(zhì)效應(yīng)，或?qū)CA測試與免疫反應(yīng)分開，可以實現(xiàn)信號放大[4，29-30]。王升啟課題組[38]設(shè)計了一種通用結(jié)構(gòu)作為ICA傳感器，在檢測線中使用抗原作為雙功能元件和抗白蛋白抗體建立了通用的超靈敏QB-ICA傳感器。該研究建立了基于三氯乙酸的快速預(yù)處理方法，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)；引入預(yù)孵育用于競爭性識別，充足的競爭識別時間有效提高了靈敏度。在檢測線上固定抗白蛋白抗體可以使ICA條帶具有非特異性，可用作所有小分子分析物的快速、靈敏和定量檢測。

3 ICA在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

ICA因其用戶體驗友好、檢測時間短、成本低、操作簡便等優(yōu)點成為一種新興的生物分析技術(shù)。目前ICA在病毒、致病菌、生物標(biāo)志物、真菌毒素以及藥物殘留檢測方面已得到廣泛應(yīng)用，更好地發(fā)揮了即時檢測技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的作用。

3.1 病毒檢測

隨著對COVID-19臨床特征和SARS-CoV-2傳播途徑的研究，了解到新型冠狀病毒的潛伏期可長達24 d，且具有很高的基本生殖數(shù)[39-41]。早期和快速地檢測SARS-CoV-2對控制病毒傳播至關(guān)重要。新型冠狀病毒抗原檢測不僅可以有效提高快速診斷的準(zhǔn)確性，為治療方法提供指導(dǎo)，而且有助于揭示感染機制，便于病毒的溯源。閻錫蘊院士課題組[42]將納米酶和化學(xué)發(fā)光免疫分析相結(jié)合，開發(fā)了一種基于納米酶的新型化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，為SARS-CoV-2抗原檢測提供了一種高靈敏度的即時檢測方法，這將大大促進SARS-CoV-2感染的早期篩查。

3.2 致病菌檢測

細(xì)菌感染性疾病是一種由病原菌感染引起的臨床常見疾病，在環(huán)境衛(wèi)生惡劣或經(jīng)濟不發(fā)達的國家和地區(qū)尤為普遍，引發(fā)的系列并發(fā)癥嚴(yán)重危及患者生命[5]。金黃色葡萄球菌是一種常見的致病菌，可引起人和多種動物發(fā)生胃腸道或尿道等多種局部組織器官感染[43]。程楠課題組[44]合成了介孔核殼結(jié)構(gòu)Pd@Pt納米酶，Pt與Pd摻雜形成的雙金屬納米顆粒作為過氧化物酶模擬物，可以增強與顯色底物的反應(yīng)接觸面積，并將其作為信號放大器用于金黃色葡萄球菌比色免疫檢測。該研究巧妙地使用色度計實現(xiàn)了便攜式信號輸出，有望在食品安全監(jiān)管和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

3.3 生物標(biāo)志物檢測

生物標(biāo)志物能夠反映正常生理過程或病理過程的生物特征，具有良好的靶向性，廣泛用于疾病診斷、治療和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域[11，27]。血清中的S-100β蛋白質(zhì)被認(rèn)為是一種客觀定量生物標(biāo)志物，可用于創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的早期診斷以及嚴(yán)重顱腦損傷的預(yù)后判斷。吳年強課題組[45]利用表面增強拉曼散射技術(shù)開發(fā)了一種具有等離子體“熱點”增強作用的免疫層析試紙條，提供了一種能快速檢測血清S-100β蛋白的便攜式設(shè)備，可突破當(dāng)前檢測方法的限制，用于急診室中TBI的快速篩查。此外，通過改變抗體種類，該方法還可用于血清中其他微量蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的直接檢測。

3.4 真菌毒素檢測

真菌毒素通常是由污染谷類作物、動物飼料或食品中的真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可引發(fā)嚴(yán)重的健康問題[21，28]。黃曲霉毒素B1作為最常見的霉菌毒素，具有免疫毒性、誘變性和致癌性，可能導(dǎo)致整個食物鏈被污染，從而造成重大經(jīng)濟損失[46]。靈敏、低成本、快速和現(xiàn)場分析檢測真菌毒素是減少糧食損失、保護人類健康和環(huán)境安全的重要預(yù)警工具。李培武院士課題組[47]制備了一種具有高效催化性能的Fe-N-C單原子納米酶，并成功地將其作為霉菌毒素橫向流動免疫檢測的標(biāo)記物和催化劑。利用催化擴增系統(tǒng)，通過肉眼或智能手機觀察檢測線顏色變化，可以輕松靈活地定性和定量檢測黃曲霉毒素B1。

3.5 藥物殘留檢測

藥物的過量使用可能會使其在動物源性食品中殘留，并通過食物鏈在人體蓄積，從而導(dǎo)致抗生素耐藥性、過敏反應(yīng)和致畸性[9，15]。磺胺嘧啶是一種合成的小分子磺胺抗生素，被廣泛用于獸醫(yī)臨床治療。為保證食品安全，需要簡單、快速的現(xiàn)場檢測技術(shù)來監(jiān)測磺胺嘧啶殘留量，以避免對人體健康造成潛在的危害。賴衛(wèi)華課題組[48]提出了一種基于內(nèi)濾效應(yīng)引起的聚多巴胺納米球雙光譜重疊熒光猝滅的橫向流動免疫分析法，該方法對目標(biāo)分析物濃度的變化更為敏感，可以同時提供包括熒光信號、灰度信號和比色信號在內(nèi)的三種模式信號輸出，可以在不同條件下靈活地應(yīng)用于磺胺嘧啶的檢測。

4 結(jié)語

ICA具有便攜、低成本、易于操作等特點，非常適用于現(xiàn)場檢測和即時檢測，被廣泛用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域中致病菌、真菌毒素、藥物殘留等現(xiàn)場緊急檢查以及疾病的快速診斷等。ICA的檢測限與所用的標(biāo)記探針、免疫測定模式密切相關(guān)。隨著新型標(biāo)記材料和創(chuàng)新性免疫測定模式等信號放大策略的引入，ICA檢測靈敏度得到有效提升，從而在POCT方面發(fā)揮更重要的作用。因此，深入了解免疫層析信號放大技術(shù)有利于先進ICA傳感器的設(shè)計。

盡管ICA已取得了實質(zhì)性進展，但仍然存在若干問題需要進一步詳細(xì)研究，以滿足在實際的傳感應(yīng)用中定量、高靈敏度、多聯(lián)檢測的需求：1）研究制備簡單，具有高穩(wěn)定性、優(yōu)異水溶性和足夠結(jié)合位點的新型標(biāo)記材料。例如，具有廣譜吸收和特定表面積的復(fù)合材料、具有高穩(wěn)定性并易于化學(xué)修飾的脂質(zhì)體。2）研究具有高通量和高靈敏度測定模式的新型信號放大策略，是檢測低豐度生物分子的迫切需求。例如，DNA擴增和納米擴增策略的整合將是解決瓶頸的有效途徑。3）研究數(shù)字化檢測技術(shù)，構(gòu)建滿足多項目同時快速檢測的便攜式ICA傳感平臺。例如，與手持式儀器和微型設(shè)備集成（如pH計、血糖儀、磁閱讀器、智能手機、多通道測量的電極陣列和芯片），產(chǎn)生實時信號，制造便攜式POCT傳感器，促進設(shè)備的商業(yè)化。

綜上，隨著標(biāo)記材料和分析技術(shù)的發(fā)展，ICA有望在細(xì)胞分析和生物診斷中達到更高效、靈敏、精準(zhǔn)的水平，從而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。