芍藥甘草湯對急性肺損傷大鼠腸道菌群的影響Δ

張甘純 ，劉 文 ，宋信莉 ，劉興德 ，舒萬芬 ，秦 琴 ，王洪鑫 （.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550025）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種常見而復雜的炎癥性疾病，由肺內(nèi)外各種致病因素引起。其特征是急性、進行性呼吸窘迫和持續(xù)低氧血癥，病死率高達40%[1]。機械通氣和激素給藥是目前較為有效的ALI治療方案[2]，但仍缺乏副作用較小的有效治療藥物。ALI屬于中醫(yī)“爆喘”“喘脫”范疇[3]，治療上主要涉及清熱解毒、活血化瘀、益氣扶正等中藥及方劑[4]。芍藥甘草湯（Shaoyao gancao decoction，SGD）源于張仲景之《傷寒雜病論》，2018年作為第一批經(jīng)典名方收錄在《古代經(jīng)典名方目錄》中。該方由芍藥和炙甘草2味藥材組成。方中白芍性微寒，能夠養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗；甘草性平，能夠補脾益氣、清熱解毒、緩急止痛?，F(xiàn)代研究和臨床實踐也證實，SGD具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、調(diào)節(jié)免疫等作用，對多種炎癥性疾病有顯著的治療作用[5]。選用SGD治療ALI具有中醫(yī)理論與現(xiàn)代研究基礎。

肺腸軸理論與中醫(yī)基礎理論“肺與大腸相表里”揭示了肺臟與胃腸道的關聯(lián)性，二者胚胎起源相同、結構相似[6]?，F(xiàn)代研究亦證實肺和腸道在生理和病理條件下相互影響。如近年研究表明，腸道微生物能夠影響肺功能，參與多種肺系疾病，包括支氣管哮喘、肺癌、ALI和慢性阻塞性肺疾病等[7]。而肺部疾病也可表現(xiàn)出腸道菌群改變的特征，如采用糞菌移植治療手段可顯著降低Toll樣受體4/核因子κB 信號通路活性和氧化應激水平，從而改善脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI[8]。可見，機體腸道菌群的改變對于肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療都起著重要作用。本研究擬探討SGD 對ALI 大鼠腸道菌群的影響，從而闡明其防治ALI 的作用機制，為中醫(yī)藥治療ALI提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器為FlexStation3 型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）、AE/240型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司]、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、H1650R型冷凍高速離心機（湘潭湘儀儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

白芍（批號220101）、炙甘草（批號210601）飲片均購自貴州一品藥業(yè)連鎖有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院孫慶文教授鑒定白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，炙甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制加工品。地塞米松（dexamethasone，DEX）原料藥（批號C13694947，純度≥98%）購自上海麥克林生化科技有限公司；LPS（批號527N031）購自上海索萊寶生物科技有限公司；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為ZC-36391、ZC-36404、ZC-37624）購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級雄性大鼠，共60 只，體重（200±20） g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0008。大鼠飼養(yǎng)于通風良好、室溫18～25 ℃、相對濕度50%～70%的動物房中，飼養(yǎng)期間確保大鼠能夠自由進食與飲水。本動物實驗獲得了貴州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（倫理批準號20210133）。

2 方法

2.1 SGD的制備

SGD由白芍和炙甘草按1∶1（m/m）配伍組成。稱取白芍、炙甘草各55 g，加入600 mL水[9]，浸泡30 min，用電陶爐以武火（1 200 W）煮沸后再以文火（600 W）煎煮至300 mL，濾液減壓濃縮，得到按生藥量計為2.0 g/mL 的SGD藥液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大鼠分組、給藥及ALI模型建立

將60只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組（CON組，生理鹽水）、模型組（MOD 組，生理鹽水）、陽性對照組（DEX 組，5 mg/kg 地塞米松）[10]和芍藥甘草湯低、中、高劑量組（SGD-L、SGD-M、SGD-H 組，給藥劑量以生藥量計分別為5.8、11.6、23.2 g/kg，分別為臨床等效劑量的0.5、1、2倍[9]），每組10只。各組大鼠每天灌胃1次，灌胃體積均為10 mL/kg，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，CON組大鼠氣道滴注等體積的生理鹽水，其余各組大鼠氣道滴注LPS（5 mg/kg）建立ALI模型[10]。

2.3 樣本采集

造模12 h 后，麻醉大鼠，經(jīng)氣管注射冰磷酸鹽緩沖液5 mL灌洗左肺，30 s后緩慢回抽，重復2次，收集肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）并置于離心管中，在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。隨后取右肺上葉用于病理形態(tài)學觀察，右肺下葉則用于計算肺組織濕/干重比。取糞便置于－80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 肺組織病理形態(tài)學觀察

取右肺上葉組織用5%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后，以蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，然后在光學顯微鏡下對肺組織進行病理形態(tài)學觀察。

2.5 肺組織濕/干重比計算

取右肺下葉用生理鹽水清洗后吸干水分，稱重，得濕重。然后將肺組織置于干燥箱中，70 ℃干燥48 h，稱重，得干重。計算肺組織濕/干重比，即肺組織濕重/肺組織干重×100%。

2.6 BALF中炎癥因子水平檢測

取“2.3”項下BALF，采用ELISA 法檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，具體操作根據(jù)相應試劑盒說明書進行。

2.7 腸道菌群檢測

以CON組、MOD組和藥效最優(yōu)的SGD劑量組大鼠的糞便為檢測樣本（每組隨機選擇6只大鼠的樣本進行檢測），委托杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司進行16S rRNA 測序和生物信息學分析。對糞便樣本進行DNA提取后，采用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）對可變區(qū)（V3～V4）擴增，之后在lllumina MiSeq平臺測序，按照相似度97%聚類，獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。對所獲OTUs進行分類學注釋并生成不同分類水平下的物種豐度，利用Mothur軟件計算樣品的Observed-species、Shannon、Simpson、Chao1 和Goods-coverage指數(shù)，分析單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，即Alpha多樣性；基于weighted UniFrac算法中的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非度量多維標度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）比較不同樣品在物種多樣性方面的相似程度，即Beta 多樣性；最后，通過線性判別分析進行效應大小[linear discriminant analysis（LDA） effect size，LEfSe]分析并尋找差異菌群（以LDA score log10＞4為標準）。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α＝0.05。為了確定在ALI 進展中起作用的關鍵菌群，將MOD 組和SGD-L 組的差異菌屬與炎癥因子進行Pearson相關性分析。

3 結果

3.1 大鼠肺組織病理形態(tài)學變化觀察結果

CON 組大鼠肺組織結構正常，未見明顯水腫、炎癥細胞浸潤或纖維結締組織增生，肺泡上皮細胞形態(tài)較為正常，未見明顯變性、壞死，間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤及纖維組織增生；MOD組大鼠肺組織可見肺泡隔增厚，肺泡輕微水腫伴大量炎癥細胞浸潤，且以淋巴細胞和中性粒細胞為主，血管周圍間質(zhì)性水腫，說明ALI 模型復制成功；與MOD組比較，各給藥組大鼠的肺組織病變程度均明顯減輕，具體表現(xiàn)為肺組織炎癥細胞浸潤減少、肺泡隔增厚和肺泡水腫情況有所改善。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學觀察的顯微圖（HE染色，×200）

3.2 大鼠肺組織濕/干重比計算結果

與CON組比較，MOD組大鼠肺組織濕/干重比顯著升高（P＜0.01）；與MOD 組比較，各給藥組大鼠的肺組織濕/干重比均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大肺組織濕/干重比和BALF 中IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定結果（±s，n＝10）

表1 各組大肺組織濕/干重比和BALF 中IL-1β、IL-6、TNF-α水平測定結果（±s，n＝10）

a：與CON組比較，P＜0.01；b：與MOD比較，P＜0.01；c：與MOD組比較，P＜0.05。

TNF-α/（pg/mL）22.19±5.27 90.27±6.80a 42.66±5.03b 54.04±5.65b 59.44±16.67b 67.50±10.50b組別CON組MOD組DEX組SGD-L組SGD-M組SGD-H組肺組織濕/干重比/%6.80±0.59 8.23±0.62a 7.31±0.64b 7.40±0.68b 7.53±0.63c 7.58±0.60c IL-1β/（pg/mL）12.62±0.77 33.07±3.12a 23.34±2.29b 22.19±3.63b 24.57±3.17b 28.22±3.65b IL-6/（pg/mL）33.41±9.58 137.33±12.39a 69.03±7.89b 86.49±9.67b 99.19±12.49b 104.24±14.12b

3.3 大鼠BALF中炎癥因子水平測定結果

與CON 組比較，MOD 組大鼠BALF 中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）。與MOD組比較，各給藥組大鼠BALF 中上述炎癥因子水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

3.4 大鼠腸道菌群分析結果

3.4.1 Alpha多樣性分析結果

如表2 所示，各組樣本的Goods-coverage 指數(shù)均大于0.98，表明測序結果良好，能夠反映各樣本的微生物群落情況[11]。與CON 組比較，MOD 組的Observedspecies、Shannon、Simpson、Chao1 指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），說明ALI 大鼠腸道內(nèi)菌群的豐富度和多樣性降低。與MOD 組比較，SGD-L 組上述4 項指數(shù)均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），表明SGD能夠增加ALI大鼠腸道內(nèi)菌群的豐富度和多樣性，恢復其菌群結構。

表2 各組大鼠腸道菌群的Alpha 多樣性分析結果（n＝6）

3.4.2 Beta多樣性分析結果

在PCoA 圖和NMDS 圖中，各組樣本內(nèi)部均能夠顯著聚類，表明各組樣本內(nèi)部腸道菌群趨于一致。CON組和MOD 組的菌群結構組成差異顯著（P＜0.05），表明ALI大鼠的腸道菌群結構發(fā)生了紊亂；SGD-L組的腸道菌群結構偏離了MOD 組，并趨向CON 組，表明經(jīng)SGD干預后，ALI大鼠的腸道菌群結構向正常狀態(tài)回調(diào)。結果見圖2。

圖2 各組大鼠腸道菌群的Beta多樣性分析結果

3.4.3 腸道菌群結構分析結果

如圖3所示，在門水平下與CON組比較，MOD組大鼠糞便中擬桿菌門（Bacteroidota）和變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著升高（P＜0.01），厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度顯著降低（P＜0.01）；與MOD 組比較，SGD-L組大鼠糞便中擬桿菌門和變形菌門的相對豐度顯著降低（P＜0.01），厚壁菌門的相對豐度顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠糞便中門水平菌群物種的相對豐度結果

如圖4所示，在屬水平下與CON組比較，MOD組大鼠糞便中乳桿菌屬（Lactobacillus）、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）和鏈球菌屬（Streptococcus）的相對豐度顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），梭狀芽孢桿菌屬（Clostridia_UCG-014）、毛螺菌屬（Lachnospira ceae_NK4A136_group）、厚壁菌屬（Firmicutes）的相對豐度顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與MOD 組比較，SGD-L 組大鼠糞便中乳桿菌屬、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬和鏈球菌屬的相對豐度顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），梭狀芽孢桿菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、杜氏桿菌屬（Dubosiella）、阿克曼菌屬（Akkermansia）的相對豐度顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。上述結果表明，SGD 能夠逆轉(zhuǎn)ALI 大鼠的腸道菌群紊亂，并使其恢復到與正常情況相似的菌群結構。

圖4 各組大鼠糞便中屬水平菌群物種的相對豐度

3.4.4 菌群差異分析結果

CON 組與MOD 組、MOD 組與SGD-L 組大鼠的腸道菌群組成和結構均存在顯著差異。相比于CON 組，MOD 組的差異菌屬為乳桿菌屬、鏈球菌屬和大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬；相比于MOD 組，SGD-L 組的差異菌屬為厚壁菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、杜氏桿菌屬、阿克曼菌屬。這些菌群可能作為ALI的生物標志物和SGD改善ALI的腸道指標。結果見圖5。

圖5 3組大鼠糞便中的差異菌屬分析結果

3.4.5 腸道菌群與炎癥因子的相關性分析結果

乳桿菌屬、鏈球菌屬、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬的相對豐度與炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平呈顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01）；毛螺菌屬、杜氏桿菌屬、厚壁菌屬的相對豐度與上述炎癥因子的水平呈顯著負相關（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖6。

圖6 差異菌屬與炎癥因子的相關性熱圖

4 討論

LPS 誘導的ALI 模型被認為是一種重復性好、與臨床病理變化相似度高的動物模型[12]。不同的LPS誘導方式與臨床ALI 的嚴重程度有一定的相關性。如氣管內(nèi)注射或鼻腔滴注LPS可直接誘導肺中性粒細胞募集，上調(diào)肺ALI炎癥因子，模擬ALI炎癥的初始癥狀。而腹腔內(nèi)注射LPS 可誘發(fā)全身膿毒性ALI，模擬更嚴重的臨床階段[13]。本研究采用氣道滴注LPS復制ALI模型，MOD組大鼠肺組織病理切片可見肺泡隔增厚、炎癥細胞浸潤、肺間質(zhì)水腫等病理變化，說明模型構建成功。ALI的特點之一是漿液涌入肺泡腔，導致肺泡水腫[14]。為了量化肺水腫的程度，本研究檢測了肺組織濕/干重比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SGD 預處理后可降低肺組織濕/干重比，表明SGD 可減緩肺水腫的發(fā)展。

維護機體內(nèi)炎癥環(huán)境的平衡及阻斷級聯(lián)放大的失控性炎癥反應是防治ALI的重要策略[15]。IL-1β、IL-6和TNF-α 是ALI 發(fā)病過程中重要的炎癥因子[16]，TNF-α 和IL-1β不僅放大了炎癥級聯(lián)反應，引起炎癥性損傷，還招募了中性粒細胞進入肺部，并表現(xiàn)出髓過氧化物酶活性增加，從而加重了肺損傷[17]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6水平是預測ALI 患者發(fā)病率和死亡率的重要指標[18]。因此，抑制上述炎癥因子的表達可以起到減輕ALI 的作用。為了檢測SGD 對LPS 誘導的ALI 大鼠的抗炎作用，筆者采用ELISA 法檢測了大鼠BALF 中炎癥因子水平。結果顯示，SGD 明顯抑制了模型大鼠BALF 中IL-1β、IL-6 和TNF-α的產(chǎn)生，有效緩解了ALI的炎癥反應。

腸道菌群在ALI的發(fā)生發(fā)展和治療中起關鍵作用。人體腸道菌群在門水平下主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成，其同樣也是大鼠腸道中最豐富的2個菌門。厚壁菌門的相對豐度降低與擬桿菌門的相對豐度升高常被認為是菌群失調(diào)的標志[19]。厚壁菌門和擬桿菌門主要參與宿主體內(nèi)脂肪和膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)，維持能量平衡，其中前者能夠幫助身體吸收和儲存能量，而后者則相反[20]。也有研究表明，厚壁菌門與IL-17 信號通路和補體信號通路密切相關，可能在免疫和炎癥的調(diào)節(jié)中起重要作用[21]。變形菌門是腸道的4 個主要菌門（厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門）中隨時間變化最不穩(wěn)定的菌門，其相對豐度被視為反映腸道菌群紊亂的標志之一及潛在的疾病診斷指標。變形菌門能夠有效利用炎癥反應產(chǎn)生的硝酸鹽作為電子受體，進行厭氧呼吸。因此在炎癥環(huán)境中，變形菌門比依賴發(fā)酵生長的厚壁菌門和擬桿菌門更具增殖優(yōu)勢，其過度生長可進一步加重局部炎癥反應[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，MOD組大鼠糞便中厚壁菌門的相對豐度降低，擬桿菌門和變形菌門的相對豐度升高；經(jīng)SGD 干預后，逆轉(zhuǎn)了這種趨勢，使SGD-L組大鼠恢復到了與CON組相似的菌群結構。

宿主體內(nèi)許多促炎因子的產(chǎn)生都是由腸道微生物群誘導的，如鏈球菌及其細胞壁成分已被證明可誘導TNF-α 和IL-1β 分泌，鏈球菌及其家族的多個成員與肺功能下降有關[23]；乳桿菌能在人淋巴細胞中誘導IL-6和TNF-α 分泌[24]；過度生長的大腸埃希菌可以促進趨化因子配體5及CXC趨化因子配體1的表達，從而加重炎癥損傷的程度[22]。而部分益生菌（如瘤胃球菌屬、杜氏桿菌屬、毛螺菌屬）可以抑制炎癥細胞因子的表達，以抑制炎癥發(fā)生[25]。本研究中，菌群與炎癥因子的相關性分析結果顯示，差異菌屬與炎癥因子具有顯著的相關性。這提示SGD可能通過恢復菌群結構、調(diào)節(jié)有害菌與有益菌比例發(fā)揮抗炎作用。如阿克曼菌是一種黏液降解菌，對維持腸黏膜的完整性起到了重要作用。而腸道屏障的損壞可能導致微生物轉(zhuǎn)運到血液中，并使炎癥反應持續(xù)，從而加劇肺損傷[26]。這提示SGD可能通過維持腸道穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮抗ALI作用。

綜上所述，SGD 可能通過改善肺組織損傷、減輕炎癥反應、調(diào)節(jié)菌群結構來發(fā)揮改善ALI的作用。然而在本研究中，藥效學結果出現(xiàn)劑量和效應“倒掛”的現(xiàn)象，這可能是中藥提取物產(chǎn)生的雙向調(diào)節(jié)作用，具體原因有待進一步分析。此外，本研究并未對在腸道菌群研究中確定的差異菌屬進行單獨驗證，后續(xù)可開展驗證實驗對本研究結果加以證實。