微小核糖核酸-146a、c-Jun氨基末端激酶在成人過敏性紫癜患者外周血單個核細(xì)胞中的水平及臨床意義

馬今朝,李明峰,陳凱

(開封市人民醫(yī)院 a.皮膚科;b.腎病風(fēng)濕科,河南 開封 475000)

過敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpura,HSP)是一種常見的血管變態(tài)反應(yīng)性疾病,在兒童及成人群體中均可發(fā)病。據(jù)報(bào)道,17歲以下兒童中的發(fā)病率為10/10萬至30/10萬[1-2],而成人群體中HSP的發(fā)病率為0.1/10萬至1.8/10萬[3]。雖然成人HSP發(fā)病率低,但臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重[4-5]。除皮膚受累外,部分患者可以出現(xiàn)腸道壞疽、穿孔、大出血甚至終末期腎病[6-9],嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此,深入了解HSP發(fā)病機(jī)理對于并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、疾病治療及預(yù)后改善具有重要臨床意義。

目前認(rèn)為HSP的發(fā)生是由于免疫功能失調(diào),而多項(xiàng)研究表明微小核糖核酸(microRNA,miR)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用[10-12]。miR-146a是免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子[13-14],主要存在于單個核細(xì)胞中,在炎癥及自身免疫性疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[15-16]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)屬于MAPK家族[17],參與免疫調(diào)節(jié)、缺血再灌注損傷、炎癥等多種病理生理相關(guān)途徑[12-18]。已有研究表明,miR-146a、JNK可參與心肌缺血再灌注損傷、腎臟炎癥反應(yīng)等病理生理過程,此外miR-146a可負(fù)調(diào)控JNK信號通路,減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生,減輕炎癥反應(yīng)及組織損傷[19-21]。但miR-146a及JNK在成人HSP中的作用尚不明確。因此,本研究通過檢測成人HSP患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a、JNK水平及對免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響,以探究二者在成人HSP發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月至2022年12月開封市人民醫(yī)院收治的50例成人HSP患者作為研究組(HSP組),其中男28例,女22例,年齡20～65(45.66± 13.78)歲。選取同期體檢科接診體檢正常成年人50例作為正常對照組(Normal組),其中男28例,女22例,年齡20～65(46.50 ± 15.26)歲。兩組性別及年齡相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)。①符合第9版《內(nèi)科學(xué)》HSP診斷要點(diǎn)[22],典型四肢皮膚紫癜,可伴有腹痛、關(guān)節(jié)痛及血尿;血小板計(jì)數(shù)、功能及凝血相關(guān)檢查正常;排除其他原因所致的血管炎及紫癜;發(fā)病前1～3周常有低熱、咽痛、全身乏力或上呼吸道感染史;②初次發(fā)病;③簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①入院前1個月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑;②有自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、過敏性疾病;③依從性差;④臨床資料不完整。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核,同意批準(zhǔn)后實(shí)施(倫理批件號2020-LW-001),所有研究樣本采集均取得受試者及家屬同意。

1.3 研究方法

1.3.1主要試劑與儀器

東芝全自動生化分析儀(東芝醫(yī)療系統(tǒng)公司,型號TBA-FX8 2600);ABI實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,型號ABI7500);BD流式細(xì)胞分選儀(蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司,型號BD FACSAriaⅡ);BIOBASE醫(yī)用離心機(jī)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司,型號BL-4);RT-PCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號RO1100);AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號Q111-02);miScript SYBR Green PCR Kit(德國Qiagen公司,貨號218073);人全血單個核細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司,貨號P9011);總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號R1200)。

1.3.2樣本采集

采集HSP組及Normal組清晨空腹外周血5 mL,將血樣分為2份,1份以1 000 r·min-1離心15 min(離心半徑8 cm),收集上層血清,通過全自動生化分析儀檢測外周血中免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)-A、IgG、IgM水平。另1份加入單個核細(xì)胞分離液,按照說明書提取單個核細(xì)胞,用于淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)基因表達(dá)檢測。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群

將外周血轉(zhuǎn)移至有單個核細(xì)胞分離液的離心管中。按照1∶1比例加入磷酸鹽緩沖液,充分混勻后以1 500 r·min-1離心30 min(離心半徑8 cm)。去除上層液體,收集中間層的單個核細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液以1 000 r·min-1離心10 min,洗滌2次后,棄上清液,加入紅細(xì)胞裂解液,室溫避光孵育2 min,再次用磷酸鹽緩沖液以1 000 r·min-1離心10 min,洗滌2次,用磷酸鹽緩沖液重懸后得到單個核細(xì)胞。加入CD3、CD4、CD8、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、CD25抗體檢測總T淋巴細(xì)胞(CD3+)、CD4+T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4+)、CD8+T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD8+)、Th1淋巴細(xì)胞(IFN-γ+、CD3+、CD4+)、Th2淋巴細(xì)胞(IL-4+、CD3+、CD4+)、Th17淋巴細(xì)胞(IL-17+、CD3+、CD8+)、Treg淋巴細(xì)胞(CD25+、CD4+、CD3+)比率。

1.3.4實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀檢測miR-146a及JNK水平

Trizol法提取外周血單個核細(xì)胞中的總RNA,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,加入miR-146a、U6、JNK及GAPDH引物(表1),將cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測,通過2-△△CT法計(jì)算miR-146a、JNK的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血單個核細(xì)胞中miR-146a與JNK水平

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示,HSP組miR-146a相對表達(dá)水平為(0.88±0.02),JNK相對表達(dá)水平為(1.13±0.01)。Normal組miR-146a相對表達(dá)水平為(1.29±0.02),JNK相對表達(dá)水平為(0.95±0.02)。與Normal組相比,HSP組外周血單個核細(xì)胞中miR-146a水平降低,JNK水平增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 HSP組與Normal組外周血單個核細(xì)胞中miR-146a與JNK水平(**P<0.01)

2.2 HSP患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a與JNK水平的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HSP組外周血單個核細(xì)胞中miR-146a與JNK水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.269,P=0.001)。

2.3 HSP組與Normal組外周血Ig及淋巴細(xì)胞亞群

HSP組外周血中IgA為(2.10±0.04)g·L-1,IgG為(11.65±0.22)g·L-1,IgM為(1.49±0.04)g·L-1。Normal組外周血IgA為(1.07±0.03)g·L-1,IgG為(11.13±0.24)g·L-1,IgM為(1.46±0.05)g·L-1。與Normal組相比,HSP組外周血中IgA升高(P<0.05),IgG及IgM差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 HSP組與Normal組外周血中IgA、IgG、IgM水平(**P<0.01;nsP>0.05)

流式細(xì)胞術(shù)顯示,HSP組中總T淋巴細(xì)胞占外周血單個核細(xì)胞比率為(67.77±0.38)%,CD4+T淋巴細(xì)胞比率為(31.32±0.34)%,CD8+T淋巴細(xì)胞比率為(40.78±0.32)%,Th1細(xì)胞比率為(6.69±0.18)%,Th2細(xì)胞比率為(7.13±0.14)%,Th17細(xì)胞比率為(2.91±0.06)%,Treg細(xì)胞比率為(4.92±0.16)%。Normal組中總T淋巴細(xì)胞比率為(68.37±0.43)%,CD4+T淋巴細(xì)胞比率為(37.38±0.34)%,CD8+T淋巴細(xì)胞比率為(36.02±0.28)%,Th1細(xì)胞比率為(9.74± 0.21)%,Th2細(xì)胞比率為(4.53± 0.11)%,Th17細(xì)胞比率為(1.86±0.03)%,Treg細(xì)胞比率為(8.44±0.16)%。與Normal組相比,HSP組CD4+T淋巴細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Treg細(xì)胞比率降低,CD8+T淋巴細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞比率升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 HSP組與Normal組各淋巴細(xì)胞亞群比率(**P<0.01;nsP>0.05)

2.4 HSP患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a及JNK水平與免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HSP組外周血單個核細(xì)胞中的miR-146a水平與IgA水平、Th2細(xì)胞比率、Th17細(xì)胞比率、CD8+T細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與CD4+T細(xì)胞比率、Th1細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān)(P<0.05)。JNK水平與CD4+T細(xì)胞比率、Th1細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與IgA水平、Th2細(xì)胞比率、Th17細(xì)胞比率、CD8+T細(xì)胞比率呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 HSP患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a及JNK水平與免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

3 討論

HSP是一類系統(tǒng)性血管炎,可表現(xiàn)為皮膚、關(guān)節(jié)、胃腸道及腎臟等多器官受累[23]。雖然在成人中發(fā)病率較低,但患者臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重。皮膚病變幾乎見于所有HSP患者,紫癜多對稱地分布在下肢、臀部,偶爾會累及軀干和面部。約2/3的HSP患者存在關(guān)節(jié)受累,可伴有明顯的關(guān)節(jié)周圍腫脹、壓痛。腹型HSP表現(xiàn)在約60%的成年患者中,患者表現(xiàn)為彌漫性腹痛,嚴(yán)重可發(fā)生腸道壞疽、穿孔及消化道大出血[6]。此外,一半以上患者可出現(xiàn)腎臟受累,最常見的表現(xiàn)為孤立的鏡下血尿以及不同程度的蛋白尿[7]。約1/3的患者在初次診斷時可出現(xiàn)高血壓及血肌酐升高,而10%～30%的患者最終發(fā)展為終末期腎病[8-9],需行腎臟替代、移植治療,嚴(yán)重影響預(yù)后及生存質(zhì)量。因此,探究HSP發(fā)病機(jī)制對疾病的診斷、治療、預(yù)后判斷有重要臨床意義。

HSP的發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為免疫功能紊亂在發(fā)病過程中起重要作用。本研究顯示,HSP患者的IgA水平、CD8+T細(xì)胞比率、Th2細(xì)胞比率、Th17細(xì)胞比率升高,CD4+T細(xì)胞比率、Th1細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率降低,與既往研究結(jié)果一致[24]。當(dāng)CD4+T細(xì)胞減少、CD8+T細(xì)胞增多、CD4/CD8降低時,細(xì)胞免疫反應(yīng)過度激活、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[25-27]。Th1、Th2細(xì)胞屬輔助性T細(xì)胞,對炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用,當(dāng)Th1細(xì)胞比率降低、Th2細(xì)胞比率升高、Th1/Th2降低,同樣可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。Th17細(xì)胞是一種能產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞,可通過誘導(dǎo)IgA等抗體生成促進(jìn)炎癥反應(yīng)[28-30],而IgA可通過與抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,激活補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損、炎癥細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致HSP的發(fā)生[31-34]。Treg細(xì)胞是一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,具有抑制炎癥反應(yīng)、減少抗體生成、減輕炎性損傷等作用[35-37],當(dāng)HSP發(fā)生時,Treg細(xì)胞比率降低,其對炎癥反應(yīng)抑制作用減弱。因此,HSP的發(fā)生是涉及體液免疫、細(xì)胞免疫的復(fù)雜病理生理過程。

miR是一類長度在20到25個核苷酸的小分子RNA,能夠與mRNA結(jié)合,調(diào)控基因表達(dá),在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。miR-146a屬于miR,其是免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子[13-14],主要存在于單個核細(xì)胞中,miR-146a已被證明在炎癥及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。MAPK是一類高度保守的絲蘇氨酸蛋白激酶,可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化,并參與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。JNK屬M(fèi)APK家族[17],其與炎癥、自身免疫性疾病等多種病理生理途徑相關(guān)[12-18]。既往研究表明miR-146a可通過抑制NF-κB、MAPK信號通路減少IL-6、IL-8、IL-1β等促炎細(xì)胞因子表達(dá)而減輕炎癥反應(yīng)[38-39]。Gao等[21]研究也表明miR-146a可以抑制活性氧介導(dǎo)的JNK信號通路活化而減輕組織炎性損傷。本研究顯示,與正常人群相比,HSP患者外周血單個核細(xì)胞中的miR-146a水平降低、JNK水平升高,且二者水平呈負(fù)相關(guān),表明在HSP患者中miR-146a表達(dá)的降低可能導(dǎo)致JNK表達(dá)增高,提示miR-146a的表達(dá)對JNK的表達(dá)可能具有抑制作用,與Gao等[21]研究相符。此外,相關(guān)性分析結(jié)果顯示JNK水平與CD4+T細(xì)胞比率、Th1細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān),與IgA水平、Th2細(xì)胞比率、Th17細(xì)胞比率、CD8+T細(xì)胞比率呈正相關(guān),當(dāng)JNK表達(dá)增高時,IgA水平、Th2細(xì)胞比率、Th17細(xì)胞比率、CD8+T細(xì)胞比率升高,而CD4+T細(xì)胞比率、Th1細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率降低,提示JNK的表達(dá)促進(jìn)T細(xì)胞亞群向促炎細(xì)胞亞群方向分化及致病免疫球蛋白IgA分泌增多,導(dǎo)致免疫及炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、疾病進(jìn)展,該結(jié)果與Rincón 等[24]研究報(bào)道一致,說明JNK信號通路可以通過介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化、改變淋巴細(xì)胞亞群比率影響免疫應(yīng)答。而miR-146a和上述免疫指標(biāo)相關(guān)性與JNK相反,進(jìn)一步提示miR-146a對JNK的表達(dá)可能具有抑制作用。

4 結(jié)論

成人HSP患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)可抑制JNK表達(dá)介導(dǎo)的促炎反應(yīng),在HSP的發(fā)病過程中起保護(hù)作用。但本研究樣本量較小,且為單中心研究,并未結(jié)合其他醫(yī)院HSP患者進(jìn)行分析,導(dǎo)致結(jié)果可能存在一定程度的偏倚。此外,本研究也沒有通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)HSP患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a是否可以抑制JNK表達(dá)。在后續(xù)的研究中應(yīng)該增加樣本量,結(jié)合多中心的研究數(shù)據(jù)并完善相應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)miR-146a及JNK在成人HSP發(fā)病中的作用,為臨床診療工作提供參考依據(jù)。