頸動脈超聲聯(lián)合血清miR-34a 檢測對動脈粥樣硬化腦梗死發(fā)生及梗死體積的關(guān)系分析

劉琳琳，王 笑，王鑫雅

腦梗死系腦部血液循環(huán)功能性障礙而誘發(fā)局部腦組織軟化或壞死的心血管疾病，意識障礙、昏迷等是其常見臨床表征，具有發(fā)病率高、疾病進展快及預(yù)后差等特征，威脅患者生命安全[1，2]。 目前臨床治療腦梗死及早恢復腦組織血液灌注為主要目標，治療方式為腦保護、降低顱內(nèi)壓、溶栓及手術(shù)介入治療等[3]。 研究發(fā)現(xiàn)[4]，腦梗死的及早發(fā)現(xiàn)并對癥治療，可有效挽救因缺氧、缺血而受損的腦組織，增加神經(jīng)元的合成和分泌，恢復患者神經(jīng)功能，優(yōu)化預(yù)后，但目前臨床對疾病的預(yù)測尚無有效指標。頸動脈超聲是常見篩查腦部血管的影像學，其中以頸動脈內(nèi)膜中膜厚度（intimamedia thickness，IMT）最為常見，可表征血管斑塊穩(wěn)定性，但其具有延滯性，無法預(yù)測疾病的發(fā)生，存在局限性[5，6]。 血清學指標因其取樣簡便、檢測成本低廉及時效性強， 已成為臨床常見的篩選疾病首選標志物。miRNA 是常見的非編碼RNA，廣泛存在機體中，其可與mRNA 特異性結(jié)合，發(fā)揮生理功能，在腫瘤、免疫系統(tǒng)、造血功能障礙和心血管疾病中具有診斷效能和疾病預(yù)測價值， 其中miR-34a 與機體內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂存在相關(guān)性，而腦梗死的初始病變亦為血管內(nèi)皮細胞的壞死或凋亡，可能存在關(guān)系[7，8]。 因而筆者分析頸動脈超聲聯(lián)合血清miR-34a 檢測對動脈粥樣硬化腦梗死發(fā)生及梗死體積的關(guān)系，旨在為預(yù)測腦梗死發(fā)生和改善預(yù)后等臨床提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018 年11 月至2020 年10 月邢臺市第一醫(yī)院治療的152 例腦梗死患者，其中男性85 例，女性67 例；年齡49 ～71 歲，平均年齡60.23 歲（標準差4.03 歲）； 病程4 ～12 h， 平均病程8.06 h （標準差2.05 h）。 選擇同期在醫(yī)院行健康體檢的60 例（對照組），其中男性39 例，女性21 例；年齡49 ～71 歲，平均年齡60.09 歲（標準差4.18 歲）。此次研究試驗方案經(jīng)筆者所在醫(yī)院倫理委員審核并批準。

選擇標準：①均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》中腦梗死診斷標準[9]；②年齡18 ～75 歲；③首次發(fā)作，發(fā)病至入院時間<72 h，并在72 h 內(nèi)完成腦部MRI 掃描和頸動脈超聲等影像學檢測， 存在動脈粥樣硬化斑塊；④臨床病例資料齊全、完整；⑤患者或其家屬知情同意此次研究。

排除標準：①既往合并心肌梗死或冠心病等心血管疾病者； ②合并免疫系統(tǒng)或腦部器質(zhì)性病變者；③合并腦、肺、大腸等部位惡性腫瘤者；④合并心臟、腎臟及肺部功能等器官衰竭者；⑤不配合基線資料采集者。

兩組年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（t/χ2=0.225、1.460，P=0.822、0.227）。

1.2 方法

1.2.1 頸動脈超聲

采用德國Siemens S200 彩色多普勒超聲診斷儀，探頭為9L4 線陣，頻率為4 MHz。造影劑為Bracco 公司的SonoVue 造影劑，應(yīng)用0.9 %氯化鈉溶液（生理鹽水）稀釋搖勻后使用。檢測時，患者行平臥體位，并在頸部準備墊枕，頭部位置偏向?qū)?cè)，檢測左側(cè)從頸動脈開始，右側(cè)從頭臂動脈分叉處開始，依次、逐一檢測頸動脈， 正常的頸動脈血管呈現(xiàn)線狀，IMT ≤1.0 mm；存在早期動脈粥樣硬化斑塊，1.0 mm

1.2.2 梗死體積檢測

應(yīng)用MRI 儀器（SIGNA Pioneer 3.0 T 型號。 美國GE 公司），檢測患者梗死灶的最長徑、寬徑、層厚及梗死層面數(shù)等，梗死灶體積= 梗死灶的最長徑× 寬徑×層厚× 梗死層面數(shù)×0.5，大體積腦梗死>10 cm3，中小體積≤10 cm3[11]。

1.2.3血清miR-34a檢測

分別采集患者入院次日或?qū)φ战M當日清晨空腹肘靜脈血約2 mL，應(yīng)用德國SIGMA 臺式高速冷凍離心機3-18KS 離心機分離血清， 參數(shù)：2 500 r/min，時間15 min，半徑8 cm，溫度4 ℃，于-70 ℃保存，統(tǒng)一檢測。 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法檢測血清miR-34a。總RNA 的提出使用Trizol 試劑盒 （上海梵態(tài)生物科技有限公司，中國），反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，共計循環(huán)40 次。 計算miR-34a 的相對表達量。

miR-34a 引物： 上游5′-TCTGTCTCTCTTGGCAGT GTCTT-3′， 下游5′-AATGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3′；U6 引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 單獨及聯(lián)合檢測診斷效能

以影像學為金標準，繪制頸動脈超聲和miR-34a相對表達檢測的單獨和回歸受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線圖，血清指標診斷標準根據(jù)ROC 曲線獲得最佳診斷臨界值，miR-34a 數(shù)值高于臨界值為陽性，并建立Logistic 模型，評價二者聯(lián)合診斷效能。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。 計數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗；計量資料以均數(shù)± 標準差表示，行t檢驗；Pearman 相關(guān)分析梗死體積與頸動脈超聲IMT值和血清miR-34a 的關(guān)系，Logistic 回歸分析確定動脈粥樣硬化腦梗死發(fā)生的獨立影響因素； 繪制IMT和miR-34a 單獨和聯(lián)合檢測ROC 曲線， 采用Hanley-McNeil 方法比較ROC 曲線下面積 （area under curve,AUC）。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者頸動脈超聲和miR-34a 比較

腦梗死組患者IMT 和miR-34a 均明顯高于對照組 （1.57 mm±0.18 mm vs 0.67 mm±0.11 mm；2.34±0.58 vs 1.05 ± 0.30），差異有統(tǒng)計學意義（t = 44.189、21.170，P=0.000、0.000）。

2.2 腦梗死體積與頸動脈超聲和miR-34a 相關(guān)性分析

腦梗死患者梗死體積為（9.34 ± 1.09） cm3，腦梗死體積與IMT 和miR-34a 均呈正相關(guān) （r = 0.888、0.788，P=0.000、0.000）。 見圖1。

圖1 腦梗死體積與IMT、miR-34a 相關(guān)性Fig.1 Correlation between cerebral infarction volume and IMT,miR-34a

2.3 Logistic 回歸分析

以單因素中有統(tǒng)計意義的兩項指標為自變量，以是否發(fā)生動脈粥樣硬化腦梗死為因變量， 行非條件Logistic 回歸分析。 結(jié)果表明，IMT[比值比（odds ratio，OR）=2.726，95%可信區(qū)間 （confidence interval，CI）1.587 ～4.683，P = 0.000） 和血清miR-34a （OR =2.199，95%CI 1.275 ～3.792，P=0.005） 是腦梗死發(fā)生的獨立影響因素（P<0.05）。 見表1。

表1 Logistic 回歸分析結(jié)果Tab.1 Results of Logistic regression analysis

2.4 頸動脈超聲和miR-34a 單獨診斷及回歸分析價值比較

以IMT 和miR-34a 作為檢驗變量， 有無腦梗死為狀態(tài)標量，以靈敏度為Y 軸，以“1- 特異性”為X 軸繪制ROC 曲線。 根據(jù)ROC 曲線可得（圖2），IMT臨界值1.23 mm， 靈敏度為61.84 %， 特異度為76.67 %，AUC 為0.801（95%CI 0.750 ～0.852）；血清miR-34a 診斷的臨界值為1.55， 其對應(yīng)的靈敏度為63.16 %， 特異度76.67 %，AUC 為0.760 （95 % CI 0.707 ～0.812）。 將回歸預(yù)測方程作為新變量P，在最佳臨界切點時， 回歸分析靈敏度89.47 %， 特異度80.00%，AUC 為0.869（95%CI 0.831 ～0.900），回歸分析靈敏度和AUC 顯著高于各指標單獨檢測 （P <0.05）。 見表2、3。

表2 單項檢測和回歸分析ROC 曲線下面積比較Tab. 2 Comparison of area under ROC curve between single test and regression analysis

表3 IMT 和miR-34a 單項檢測及回歸分析診斷腦梗死比較例（%）Tab.3 ROC curves of IMT and miR-34a single detection and regression analysiscases（%）

圖2 IMT 和miR-34a 單項檢測和回歸分析的ROC 曲線圖Fig. 2 ROC curves of IMT and miR-34a single detection and regression analysis

3 討論

動脈粥樣硬化是腦梗死常見的病理基礎(chǔ)，若不穩(wěn)定性斑塊出現(xiàn)破裂、脫落等情況，則可造成腦動脈堵塞、狹窄，進而誘發(fā)腦梗死；同時研究表明，頸動脈狹窄程度超70%的患者中腦梗死患病率高達13%[12，13]。臨床實踐顯示[14]，腦梗死不可逆，預(yù)后和恢復情況與神經(jīng)功能損傷程度相關(guān)，在溶栓、改善腦循環(huán)、抗腦水腫及降顱壓等措施后，極易復發(fā)，且預(yù)后極差，造成失語、癱瘓等后遺癥，對家庭和社會帶來沉重負擔，因而及早預(yù)測腦梗死發(fā)生，并評估危險因素，對腦梗死的治療方案調(diào)整和改善患者生存質(zhì)量具有重要價值。頸動脈超聲具有經(jīng)濟、無創(chuàng)傷及便捷等優(yōu)勢，且IMT 可定量評估斑塊穩(wěn)定程度，但其受限于圖像分辨率和主觀因素，存在局限性，而在超聲的基礎(chǔ)上聯(lián)合血清指標可有效提高腦梗死陽性檢出率[15]。 筆者試驗顯示血清miR-34a 在腦梗死患者中異常表達， 但具體應(yīng)用于預(yù)測腦梗死研究較少，因而探討頸動脈超聲聯(lián)合血清miR-34a 檢測對動脈粥樣硬化腦梗死發(fā)生， 為臨床診斷提供參考價值。

腦梗死的發(fā)生、 發(fā)展與頸動脈粥樣硬化程度、斑塊穩(wěn)定性及狹窄程度緊密相聯(lián)，而頸動脈超聲在探查頸動脈斑塊體積、位置、數(shù)量、IMT 等方面具有獨特優(yōu)勢，可為臨床預(yù)測、治療腦梗死提供豐富、直觀的解剖學信息[16]。 筆者研究顯示，腦梗死組患者IMT 明顯高于對照組，且Logistic 回歸分析顯示IMT 是腦梗死發(fā)生的影響因素（P<0.05），證實IMT 與腦梗死的發(fā)展有關(guān)。 進一步比較診斷效能，IMT 臨界值1.23 mm，靈敏度為61.84%，特異度76.67%，AUC 0.801（95%CI 0.750 ～0.852），具有一定的預(yù)測價值，診斷效能較低。梁蓉[17]證實，頸動脈超聲預(yù)測腦梗死發(fā)生的靈敏度為80.36%、特異度為72.00%，筆者研究靈敏度結(jié)果低于文獻報道，可能與評判標準有關(guān)。筆者研究僅依靠定量IMT 預(yù)測疾病，而文獻以IMT、斑塊纖維帽完整性綜合判斷，但單獨頸動脈超聲診斷效能均較低。

miRNA 是非編碼蛋白的核糖核苷酸， 在多種疾病中均具有重要作用，已成為心腦血管疾病預(yù)測和預(yù)后評估的潛在、重要血清標志物，可通過與mRNA 結(jié)合調(diào)控機體細胞分裂、 凋亡等生物學反應(yīng)，miR-34a表達于心臟、腦組織中，可調(diào)控腦卒中等疾病的進程。血管內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)與動脈粥樣硬化有關(guān)，而miR-34a 可介導血管內(nèi)皮功能，間接參與機體斑塊的形成[18，19]。 筆者研究結(jié)果表明，腦梗死組患者血清miR-34a 水平明顯高于對照組， 且ROC 檢測表明血清miR-34a 診斷的臨界值為1.55， 其對應(yīng)的靈敏度為63.16 %、特異度76.67 %，AUC 為0.760（95 % CI 0.707~0.812），單獨診斷效能較低。

筆者研究將IMT 和miR-34a 進行聯(lián)合診斷并繪制ROC 曲線， 二者聯(lián)合診斷的靈敏度顯著高于單獨的診斷效能，且保持較高的特異度和準確率，即頸動脈超聲聯(lián)合miR-34a 可有效提高腦梗死檢出率。 此外，梗死體積的大小決定腦梗死患者的預(yù)后，筆者研究腦梗死體積與IMT 和miR-34a 均呈正相關(guān)（r =0.888、0.788，P=0.000）， 進一步論證二者應(yīng)用于腦梗死發(fā)生預(yù)測的臨床價值。

綜上所述，動脈粥樣硬化腦梗死體積與頸動脈超聲和血清miR-34a 成正相關(guān)， 頸動脈超聲和血清miR-34a 可應(yīng)用于單獨預(yù)測動脈粥樣硬化腦梗死的發(fā)生， 且聯(lián)合診斷預(yù)測動脈粥樣硬化腦梗死診斷效能更高，值得臨床進一步研究和推廣。