肝癌細(xì)胞外泌體鑒定及其對(duì)肝細(xì)胞的影響

車小紅，張?jiān)伱?/p>

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占原發(fā)性肝癌的85%~90%。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染被認(rèn)為是中國(guó)HCC 發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[1~3]。HCC 的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及持續(xù)的炎癥損傷，包括肝細(xì)胞壞死和再生[4]。 盡管近年來(lái)在成像技術(shù)、肝移植、手術(shù)切除、射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞治療（transarterial chemoembolization，TACE） 和全身化學(xué)治療等方面都取得了新的突破，但HCC 發(fā)病率高、預(yù)后差，晚期肝癌患者的治療選擇非常有限，預(yù)后率仍然很低，至今沒(méi)有有效的治療方法[5]。 目前，HCC 的5 年生存率不超過(guò)20%，早期診斷可顯著降低HCC 患者的死亡率[6]。 因此，提高HCC 的早期診斷率和探索HCC 形成的具體機(jī)制是提高HCC 總生存率的主要方法。

外泌體 （exosomes，Exos） 是直徑為50~100 nm細(xì)胞外囊泡， 它們含有細(xì)胞分泌的許多活性成分，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA 和DNA[7]。 Exos 通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞之間及腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，間接影響腫瘤微環(huán)境，是腫瘤發(fā)生的重要工具[8]。細(xì)胞類型如間充質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)Exos 的釋放，這表明Exos 參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和耐藥[9]。此外，腫瘤來(lái)源的Exos 含有大量與癌癥相關(guān)的血清學(xué)標(biāo)志物，如miRNAs，可用于早期HCC 的檢測(cè)[10，11]。 多項(xiàng)研究表明外泌體與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)Exos 的深入研究，可能有助于解釋腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移過(guò)程， 為HCC 的早期診斷和治療提供新的方法。筆者通過(guò)提取并鑒定小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6 來(lái)源的Exos（Hepa1-6 Exos），研究AML12 細(xì)胞攝取Hepa1-6 Exos 的效率，并探討Hepa1-6 Exos 對(duì)AML12 細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Hepa1-6 細(xì)胞和AML12 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；溶酶體膜糖蛋白（CD63）、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、 白蛋白（albumin，ALB）和α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT）抗體（Abcam 公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6 和小鼠正常肝細(xì)胞AML12在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的達(dá)氏修正伊氏培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 中培養(yǎng)。 細(xì)胞每隔1 d 更換新鮮培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。

1.2.2 外泌體提取

Hepa1-6 細(xì)胞在無(wú)胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）培養(yǎng)液中培養(yǎng)24~36 h 后，采用ExoquickTC試劑盒提取Exos。 取上清液500 g 離心10 min 去除細(xì)胞，然后在10 000 g 條件下離心20 min，清除殘留的細(xì)胞碎片。所得上清液經(jīng)0.4 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后，采用ExoquickTC試劑盒沉淀。 所得樣品在磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS） 或DMEM 中重懸，保存在-80°C 條件下。

1.2.3 外泌體鑒定

采用電子顯微鏡分析Hepa1-6 Exos 的形態(tài)。 將純化的Exos 添加到網(wǎng)格中，用2%醋酸鈾酰將Hepa1-6 Exos 染色，于電子顯微鏡（型號(hào)：Tecnai G2 Spirit BioTwin）成像拍片。 分析Hepa1-6 Exos 的粒徑分布，將提取的Hepa1-6 Exos 均勻稀釋到500 ng/mL（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度），采用Nanoplus 分析儀（型號(hào)：ZetaVIEW S/N 17-310）檢測(cè)Hepa1-6 Exos 粒徑。

1.2.4 Western blot

使用放射免疫沉淀試驗(yàn)（radioimmunoprecipitation assay，RIPA） 裂解緩沖溶液在4 ℃條件下提取細(xì)胞或Hepa1-6 Exos 中的總蛋白， 用Pierce BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)濃縮在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（6 %）上，用SDS-PAGE（12%）分離。 將凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素過(guò)濾膜上，進(jìn)行印跡分析。 用3%牛血清ALB 阻斷后，膜隨后與一抗孵育。 在Tris 緩沖溶液加吐溫-20（Tris-buffered saling and tween-20，TBST）中洗滌3次后，與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h。

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量實(shí)驗(yàn)步驟制備BCA 工作液，按A ∶B=50 ∶1 比例配置工作液，充分混勻；將蛋白質(zhì)樣品加入到各孔中，每孔分別加入BCA 工作液；密封后，于37 ℃靜置30 min；室溫，用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（optical density，OD）562nm值；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品濃度。

1.2.5 外泌體的體外熒光示蹤

將純化的Hepa1-6 Exos （1 μg/μL） 與1 mmol/L的DiI（細(xì)胞膜橙紅色熒光探針）染料（500 ∶1 體積比）孵育30 min， 用PBS 洗滌后離心去除游離的熒光染料。為了在AML12 細(xì)胞中體外示蹤Hepa1-6 Exos，將AML12 細(xì)胞與標(biāo)記的Hepa1-6 Exos 孵育3 h，用PBS洗滌3 次，再用4%多聚甲醛溶液固定10 h 后，再用PBS 洗滌2 次，10 min 后再用PBS 洗滌2 次。 細(xì)胞核用Hoechst（1 ∶1 000）在37 ℃反染10 min。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用醋酸鈉溶液清洗細(xì)胞（去除非特異性黏附），并使用共聚焦顯微鏡觀察拍片。

1.2.6 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分成2 組：對(duì)照組（AML12 細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（AML12 細(xì)胞+Hepa1-6 Exos）。 將2 組細(xì)胞接種至96 孔板，每孔加入1×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h 后，對(duì)2組細(xì)胞進(jìn)行處理。 24 h、48 h、72 h 后進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)，在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD[12]。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組同1.2.6 所述， 將2 組細(xì)胞接種至6 孔板，每孔加入2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h 后，對(duì)2 組細(xì)胞進(jìn)行處理。24 h、48 h、72 h 后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

使用TRIzol 試劑按制造商說(shuō)明書(shū)指示從2 組細(xì)胞中提取總RNA。 然后， 利用PrimeScript 第一鏈cDNA 合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Prime-Script RT master mix 分析mRNA 水平上的相關(guān)基因表達(dá)。 所有定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （quantitative polymerase chain reaction，qPCR）至少重復(fù)3 次。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參。 ALB 上游引物序列為5′-TGCTTTTTCCAGGGGTGTGTT-3′， 下游引物序列為5′-TTACTTCCTGCACTAATTTGGCA-3′；A1AT 上游引物序列為5′-AGGGTGGCTTCTAGCCTCTTT-3′， 下游引物序列為5′-CAGTCCGTGTGTACTCTTCCC-3′；GAPDH 上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

RNA 定量： 定量時(shí)適量稀釋溶于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）的RNA 樣品，紫外分光光度計(jì)選擇RNA 定量， 檢測(cè)樣品， 讀取OD260nm及OD260nm/OD280nm比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。 兩組間比較采用Studentdent’s t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

2.1.1 外泌體形態(tài)

相關(guān)研究報(bào)道Exos 為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)首先收集了Hepa1-6 Exos，通過(guò)透射電子顯微鏡分析其形態(tài)。 結(jié)果顯示Hepa1-6 Exos 呈脂質(zhì)雙層茶托樣結(jié)構(gòu)，具有典型的Exos 結(jié)構(gòu)，結(jié)果符合Exos 的形態(tài)特征（圖1）。

圖1 Hepa1-6 Exos 的形態(tài)特征（標(biāo)尺=100 nm）Fig.1 Image of morphological characteristics of Hepa1-6 Exos(scale bar=100 nm)

2.1.2 外泌體特異性蛋白表達(dá)

Exos 表達(dá)特異性蛋白CD63、TSG101 和CD9 等，而不表達(dá)高爾基體標(biāo)志物GM130 蛋白。 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hepa1-6 細(xì)胞和Hepa1-6 Exos 均表達(dá)CD9、CD63 和TSG101 蛋白（圖2），證明Hepa1-6 Exos 表達(dá)標(biāo)志性蛋白。

圖2 Hepa1-6 Exos 特異性蛋白表達(dá)Fig.2 Diagram of Hepa1-6 Exos specific protein expression

2.1.3 外泌體粒徑分析性

對(duì)提取Hepa1-6 Exos 并進(jìn)行粒徑分析，結(jié)果顯示，Hepa1-6 Exos 粒徑主要分布在50~200 nm，且基本呈正態(tài)分布（圖3）。 符合Exos 正常粒徑大小分布范圍。

圖3 Hepa1-6 Exos 粒徑分析Fig.3 Diagram of particle size analysis of Hepa1-6 Exos

2.2 AML12 細(xì)胞高效攝取Hepa1-6 Exos

免疫熒光顯示，Hepa1-6 Exos 進(jìn)入AML12 后，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，且被細(xì)胞高效攝?。▓D4）。 說(shuō)明Hepa1-6 Exos 能與AML12 細(xì)胞進(jìn)行充分信息交流。

圖4 AML12 細(xì)胞攝取Hepa1-6 Exos 情況（標(biāo)尺=5 μm）Fig.4 Images uptake of Hepa1-6 Exos by AML12 cells(scale bar=5 μm)

2.3 Hepa1-6 Exos 促進(jìn)AML12 細(xì)胞增殖及抑制其凋亡

將Hepa1-6 Exos 與AML12 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力得到提高（表1）。 說(shuō)明Hepa1-6 Exos可促進(jìn)AML12 細(xì)胞增殖。 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率下降（表2）。 上述結(jié)果表明Hepa1-6 Exos 能抑制AML12 細(xì)胞的凋亡，且其抑制作用較大。

表1 兩組AML12 細(xì)胞增殖率比較Tab.1 Comparison of proliferation rate of AML12 cells between 2 groups

表2 兩組AML12 細(xì)胞凋亡率比較Tab. 2 Comparison of apoptosis rate of AML12 cells between 2 groups

2.4 Hepa1-6 Exos 增強(qiáng)AML12 細(xì)胞ALB mRNA和A1AT mRNA 的表達(dá)

經(jīng)Hepa1-6 Exos 處理后，采用qPCR 和Western blot 檢測(cè)兩組細(xì)胞中ALB mRNA、A1AT mRNA 和其蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)組ALB mRNA、A1AT mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為4.46±0.50、6.89±1.01，對(duì)照組分別為1.00±0.21、1.00±0.35。 與對(duì)照組相比， 實(shí)驗(yàn)組ALB mRNA、A1AT mRNA 表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.96、5.27，P<0.05）。 見(jiàn)圖5。

圖5 兩組AML12 細(xì)胞表達(dá)ALB、A1AT 蛋白電泳圖（Western blot）Fig. 5 Electrophoretogram of AML12 cells expressed ALB and A1AT protein(Western blot)

3 討論

HCC 是一種致命惡性腫瘤， 具有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，其轉(zhuǎn)移受微環(huán)境因素的影響較大，迄今肝癌早期診斷仍然缺乏合適的標(biāo)志物[13]。目前，肝移植、介入放射治療和化學(xué)栓塞治療仍是治療不可切除肝癌的主要選擇。 Exos 是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外小泡，1989 年由Johnstone RM 在研究網(wǎng)織細(xì)胞時(shí)首次發(fā)現(xiàn)[14]。 Exos 是具有多種生物功能的納米級(jí)顆粒，廣泛分布于血液、唾液、牛奶、腹水、尿液等體液中，富含核酸、蛋白質(zhì)、脂類和無(wú)機(jī)鹽離子[15]。Exos 參與細(xì)胞之間或細(xì)胞與組織之間重要的信息和物質(zhì)的交換。它們維持著人體細(xì)胞發(fā)育、生長(zhǎng)、分化和衰老的關(guān)鍵生理過(guò)程，是人類生命所必需的[7]。 越來(lái)越多的研究表明，Exos 的分泌和功能異常在惡性腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展和治療中起著至關(guān)重要的作用。

腫瘤來(lái)源的Exos 在侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的幾乎所有步驟中都起著至關(guān)重要的作用。首先，腫瘤源性Exos 提供自分泌和旁分泌信號(hào)， 激活腫瘤上皮細(xì)胞中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial- mesenchymal transition，EMT），使腫瘤細(xì)胞具有侵襲周圍組織的能力。 其次，腫瘤Exos 被吸收并沉淀到目標(biāo)組織中， 在轉(zhuǎn)移細(xì)胞停止之前形成一個(gè)轉(zhuǎn)移前小生境。最后，腫瘤Exos 調(diào)節(jié)宿主免疫，使疾病無(wú)限制地發(fā)展，甚至通過(guò)激活炎癥反應(yīng)途徑逃避免疫細(xì)胞，使其得到培養(yǎng)[16，17]。 近年來(lái)，腫瘤來(lái)源的Exos 已被證實(shí)能促進(jìn)癌癥進(jìn)展。

相關(guān)研究表明，通過(guò)Exos 的RNA 和蛋白質(zhì)交換不僅在HCC 的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用， 而且可能是潛在的實(shí)時(shí)、非侵入性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的來(lái)源[18]。迄今為止，對(duì)肝臟Exos 的研究有限，大多數(shù)研究來(lái)源于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。 既往研究表明，Exos 作為腫瘤微環(huán)境中的載體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，也是HCC 診斷和預(yù)后潛在有效的生物標(biāo)志物[19，20]。肝癌Exos 分泌的miRNA 可誘導(dǎo)多種生物學(xué)功能，通過(guò)滅活致癌miRNA 可能是肝癌靶向治療的新方向。 盡管Exos 和HCC 研究進(jìn)展令人振奮，但仍有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步闡明， 如Exos 在HCC 轉(zhuǎn)移的EMT 途徑中的作用，以及Exos 在HCC 與靶細(xì)胞之間的作用機(jī)制等仍有待進(jìn)一步研究。

筆者通過(guò)高速離心法提取Hepa1-6 Exos，保證了實(shí)驗(yàn)所需Exos 的純度。 實(shí)驗(yàn)鑒定了Hepa1-6 Exos 的生物特征，其呈脂質(zhì)雙層茶托樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)特征性蛋白， 粒徑主要分布在50 ~ 200 nm。 上述結(jié)果表明Hepa1-6 Exos 具有Exos 的特征，符合其特性。實(shí)驗(yàn)揭示AML12 細(xì)胞能高效攝取Hepa1-6 Exos， 表明提取的Hepa1-6 Exos 能與AML12 細(xì)胞進(jìn)行充分信息交流。 在此基礎(chǔ)上，將Hepa1-6 Exos 與AML12 細(xì)胞共培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)Hepa1-6 Exos 能促進(jìn)AML12 細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡；同時(shí)Hepa1-6 Exos 增強(qiáng)了AML12 細(xì)胞中ALB 和A1AT 的表達(dá)。 Exos 作為一種納米級(jí)囊泡，具備克服各種生物屏障的能力。 它通過(guò)細(xì)胞膜融合、胞飲和內(nèi)吞等方式進(jìn)入細(xì)胞后，將自身攜帶的配體或受體、蛋白質(zhì)或核酸，或作為藥物遞送載體對(duì)細(xì)胞發(fā)揮作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和遷移等生物學(xué)行為，從而改變受體細(xì)胞的生理和代謝功能。 Exos 通過(guò)膜融合將來(lái)源細(xì)胞的基因突變信息遞送至受體細(xì)胞，從而導(dǎo)致原癌基因的激活和抗凋亡基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞獲得增殖特性。 在傷口愈合后期，Exos 可抑制膠原蛋白表達(dá)，減少瘢痕形成。 研究發(fā)現(xiàn)，Exos 介導(dǎo)核酸、蛋白質(zhì)和脂類等生物活性物質(zhì)的遞送參與肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成。

綜上所述，筆者鑒定了肝癌細(xì)胞來(lái)源的Exos，并分析了其對(duì)正常肝細(xì)胞的影響， 結(jié)果表明Hepa1-6 Exos 可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 因此Exos 有望成為肝癌診斷標(biāo)志物，為肝癌早期診斷和治療提供了新思路。 同時(shí)，筆者研究尚存在不足，肝癌細(xì)胞的Exos對(duì)正常肝細(xì)胞促增殖和抑制凋亡的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡明此作用機(jī)制，從而為肝癌的臨床診治提供新的策略。