骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)miR-181c對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用研究

許 建，郭 瑞

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱損傷重要的并發(fā)癥，可造成患者下肢功能障礙，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，目前尚無(wú)有效的治療方法[1]。 近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療SCI 顯示出良好效果，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSC）是最常用的成體干細(xì)胞[2]。 研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 主要通過(guò)外泌體發(fā)揮作用，如BMSC 來(lái)源的外泌體可通過(guò)靶向M2 巨噬細(xì)胞，上調(diào)SCI 小鼠脊髓組織中TGF-β 表達(dá)水平，穩(wěn)定微血管，促進(jìn)功能恢復(fù)[3]。 外泌體中攜帶多種活性物質(zhì)，如微小RNA（microRNA，miRNA）、基因等；最近研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 來(lái)源的多種miRNA 可減輕SCI[4~6]。 Li C 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 來(lái)源的miR-544 可減輕脊髓損傷。 另外Jiang Z 等[8]同樣發(fā)現(xiàn)，BMSC 來(lái)源的miR-145-5p 可通過(guò)Toll 樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子κB （nuclear factors κB，NF-κB） 通路減輕SCI。 miR-181c 是最近發(fā)現(xiàn)一種miRNA，對(duì)神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[9]，但miR-181c 與SCI 的關(guān)系尚不清楚?；诖耍P者通過(guò)構(gòu)建SCI 動(dòng)物模型，觀察BMSC 來(lái)源的miR-181c 對(duì)SCI 的修復(fù)作用，希望為SCI 的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡雄性無(wú)特定病原體（Specific pathogen free，SPF）級(jí)Wistar 裸大鼠30 只，體質(zhì)量200~250 g。 購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，動(dòng)物使用許可證號(hào)碼SYXK（新）2021-0004。 正常進(jìn)食、飲水，夜/晝各12 h。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器

達(dá)氏修正伊氏培養(yǎng)液 （Dulbecco’s modification Eagle’s medium，DMEM）/F-12、Trizol（BI 公司，以色列）；胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶（BI 公司，以色列）；引物序列，miR-181c mimics、miR-NC 質(zhì)粒，外泌體提取試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)）；lip2000（ 上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司， 中國(guó)）；DiI、Hoechst33342 及鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）（上海碧云天生物有限公司，中國(guó)）；TUNEL 試劑盒（廣州銳博生物有限公司，中國(guó)）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（R&D Systems，德國(guó)）；SeraMir Exosome RNA 提取試劑盒 （System BioSCIences，美國(guó)）；CD29-APC、CD90-熒光素5-異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、CD45-FITC 及CD34-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）（BD，美國(guó)）；兔抗Cleaved半胱胺酸蛋白酶第三型 （cysteine-dependent aspartate-specific proteases，Caspase 3）、Caspase 3、Bcl 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）及B 細(xì)胞淋巴瘤基因-2 （B cell lymphoma gene-2，Bcl2）（Abcam，美國(guó)）；CD9、CD63、β-actin（Cell Signaling Technology，美國(guó)）多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗（Sigma 公司，美國(guó)）；RNA 提取、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（Tarkara 公司，日本）。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝膠電泳及轉(zhuǎn)移裝置 （天津儀器廠，中國(guó)）；曝光機(jī)（Bio-rad 公司，美國(guó)）；ABI 7900 PCR 儀（天津儀器廠， 中國(guó)）；FEI Tecnai G2 F20 透射電子顯微鏡（Thermo，德國(guó)）；FACSVia 流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

取5 只大鼠用于原代BMSC 的分離、 培養(yǎng)和備用。 采用全骨髓貼壁法分離大鼠BMSC。 將大鼠麻醉后消毒，在生物安全柜中取股骨，切開后用無(wú)菌水沖洗骨髓腔收集骨髓細(xì)胞， 離心后用DMEM/F-12 懸浮。培養(yǎng)3 d 后去除未貼壁的細(xì)胞即為BMSC。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。 取傳代3 次的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

使用lip2000 轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-181c mimc 質(zhì)粒、miR-NC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BMSC， 分別定義為Control組（未處理）、miR-181c 組（轉(zhuǎn)染miR-181c mimc 質(zhì)粒）及miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC 質(zhì)粒）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取外泌體。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的提取

用不含外泌體的完全DMEM/F-12 培養(yǎng)3 組細(xì)胞24 h，收集上清液，于5 000×g 條件下離心30 min，保留上清液；并于5 000×g 條件下再離心30 min，收集上清液，使用外泌體提取試劑盒提取外泌體。 取4 mL外泌體懸浮液，透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)。

1.2.3 動(dòng)物分組、建模和處理

將30 只大鼠均分為5 組（每組5 只）：假手術(shù)組（Sham 組）、SCI 組、SCI + 外泌體組、SCI + miR-181c組和SCI+miR-NC 組。

除Sham 組外，其他4 組均進(jìn)行SCI 建模。 具體步驟如下：使用異氟醚麻醉，背部剪毛、消毒；在第10胸椎處作約2 cm 的切口，切斷椎板、顯露脊髓；用手術(shù)刀切開脊髓，可見脊髓充血水腫，大鼠出現(xiàn)尾部痙攣及右下肢癱瘓，提示建模成功。 依次縫合肌肉和皮膚，術(shù)后給予青霉素預(yù)防感染。Sham 組大鼠僅給予第10 胸椎椎板切除術(shù)。

造模完成后1 h，SCI+外泌體組大鼠尾靜脈注射10 μg BMSC 來(lái)源的外泌體；SCI + miR-181c 組大鼠尾靜脈注射10 μg 轉(zhuǎn)染miR-181c mimic 的BMSC 來(lái)源的外泌體；SCI+miR-NC 組大鼠尾靜脈注射10 μg轉(zhuǎn)染miR-NC 的BMSC 來(lái)源的外泌體；Sham 組、SCI組大鼠尾靜脈注射等體積的0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。 2 d 注射1 次，共注射3 次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSC 用胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液 （1 × 106/mL）， 分別加入CD29-APC、CD90-FITC、CD45-FITC 及CD34-PE 單克隆抗體，4 ℃環(huán)境下避光孵育30 min；同樣取BMSC 的外泌體，加入上述抗體和孵育條件；然后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3 次后再次重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 脊髓神經(jīng)細(xì)胞攝取外泌體檢測(cè)

首先使用紅色熒光染料Dil 標(biāo)記外泌體， 于1×106×g 條件下離心1 h。 無(wú)菌條件下取尾靜脈注射外泌體大鼠的脊髓組織，制備5 μm 冰凍切片，用4%多聚甲醛溶液固定15 min， 再用Hoechst33342 室溫染細(xì)胞核，鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）室溫復(fù)染細(xì)胞骨架，用磷酸鹽緩沖溶液洗3 次，封片。 共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.6 脊髓損傷的行為學(xué)評(píng)分

對(duì)5 組大鼠處理后第1 天、 第3 天、 第7 天、第14 天及第28 天進(jìn)行行為學(xué)巴索-比蒂-布雷納漢（Basso-Beattie-Bresnahan，BBB）評(píng)分。 將每組大鼠放在空曠的地方，觀察5 min，記錄SCI 的BBB 評(píng)分分值。 BBB 評(píng)分總分21 分，0 分代表肢體無(wú)運(yùn)動(dòng)，21分代表肢體正常，分值越高說(shuō)明下肢運(yùn)動(dòng)功能越好。

1.2.7 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用4 %多聚甲醛溶液固定的脊髓組織， 制備5 μm 石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，檸檬酸修復(fù)抗原， 根據(jù)TUNEL 試劑盒說(shuō)明書染色，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（diaminobenzidine，DAB）顯色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞（細(xì)胞呈綠色）數(shù)量，取平均值。 細(xì)胞凋亡率（%）= 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.8 Western blot

檢測(cè)脊髓組織中Cleaved Caspase 3、Caspase 3、Bax 及Bcl2 蛋白，BMSC、 外泌體中CD9、CD63 表達(dá)水平。 收集5 組脊髓組織、BMSC 及外泌體，加入細(xì)胞裂解溶液提取總蛋白，將蛋白樣品于100 ℃煮5 min。分別制備10%分離膠及5%濃縮膠，每孔中加入30 μg蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，用5%無(wú)脂牛奶室溫下封閉1 h，加入Cleaved Caspase 3（1:1 000）、Caspase 3（1:1 000）、Bax（1:1 000）、Bcl2（1:1 000）、CD9（1:1 000）、CD63（1:1 000）、β-actin（1:1 000）于4 ℃條件下過(guò)夜。 次日PVDF 膜與二抗室溫下孵育1 h， 加入發(fā)光液，曝光， 用ImageJ 軟件分析灰度值， 采用目標(biāo)蛋白/βactin 表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 酶聯(lián)免疫吸附分析法

用ELISA 檢測(cè)大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)水平。 采用摘眼球方法取外周血，于1 000×g 條件下離心保留血清， 采用TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β 含量。

1.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)脊髓組織、 外泌體中miR-181c， 脊髓組織中TNF-α、IL-1β mRNA 水平。向脊髓組織中加入1 mL Trizol 試劑提取總RNA，利用SeraMir Exosome RNA 提取試劑盒提取外泌體中總RNA。 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 然后以cDNA 為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，10×cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。 循環(huán)條件：95 ℃15 s，55 ℃20 s，68 ℃35 s， 共40 個(gè)循環(huán)，內(nèi)參為U6。 相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

miR-181c 上、 下游引物：5'-ATGGTTCGTGCGAACATTCAACCTGTCGG-3'，5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。 TNF-α 上、下游引物：5'-ATACACTGGCCCGAGGCAAC-3'，5'-CCACATCTCGGATCATGCTTTC-3'。 IL-1β 上、 下游引物：5'-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3'，5'-CCCAAGTCAA-GGGCTTGGAA-3'。 U6 上、 下游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATAC TAAAAT-3'，5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)錄入Prism 8.0 軟件。 計(jì)量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，兩組間比較采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

光學(xué)顯微鏡下觀察，BMSC 培養(yǎng)第1 天主要以圓形或梭形為主；培養(yǎng)第3 天，可見貼壁細(xì)胞形態(tài)較為一致，呈漩渦狀排列，逐漸融合成片；培養(yǎng)第6 天細(xì)胞形態(tài)為梭形，形態(tài)均一，呈旋渦狀。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD29、CD90、CD34 及CD45 陽(yáng)性率分別為96.21%、97.76%、0.80%及0.87%。 見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間BMSC 形態(tài)變化光學(xué)顯微鏡圖（A）和流式細(xì)胞術(shù)圖（B）Fig.1 Optical microscope(A)and flow cytometry(B)of morphological changes of BMSC at different culture time

2.2 外泌體鑒定

透射電子顯微鏡下觀察，BMSC 來(lái)源的外泌體呈類圓形， 直徑約50 ～100 nm。 與BMSC 表達(dá)CD9、CD63（0.11±0.01、0.16±0.02）比較，BMSC 來(lái)源的外泌體高表達(dá)CD9、CD63 （0.85 ± 0.05、0.95 ± 0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.950、25.140，P<0.05）。 見圖2、3。

圖2 透射電子顯微鏡下BMSC 來(lái)源的外泌體形態(tài)Fig.2 Morphology of BMSC-derived exosomes under transmission electron microscope

圖3 BMSC 來(lái)源的外泌體表達(dá)CD9、CD63 與BMSC 比較電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of BMSC-derived exosomes expressed CD9,CD63 and BMSC

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在脊髓損傷大鼠的定位

熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈注射Dil 標(biāo)記的外泌體后， 有大量發(fā)光外泌體位于神經(jīng)元的細(xì)胞核周圍，提示脊髓神經(jīng)元細(xì)胞可攝取外泌體。 見圖4。

圖4 BMSC 來(lái)源的外泌體在SCI 大鼠定位Fig.4 Localization images of BMSC-derived exosomes in SCI rats

2.4 外泌體及脊髓組織中miR-181c 表達(dá)水平

Control 組與miR-NC 組外泌體中miR-181c 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.33±0.05 vs 0.34±0.04）（t=0.297，P>0.05）。 與miR-NC 組比較，miR-181c組外泌體miR-181c 表達(dá)水平升高 （1.03±0.21）（t=7.813，P<0.05）。

與Sham 組比較，SCI 組脊髓組織miR-181c 表達(dá)水平降低（0.69±0.05 vs 0.23±0.03）（t=19.100，P<0.05）。 與SCI 組比較，SCI+外泌體組脊髓組織miR-181c 表達(dá)水平升高 （0.42 ± 0.06）（t = 9.500，P <0.05）。 與SCI+miR-NC 組比較，SCI+miR-181c 組脊髓組織miR-181c 表達(dá)水平升高 （0.22 ± 0.03 vs 1.32±0.13）（t=18.440，P<0.05）。

2.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

與Sham 組比較，SCI 組大鼠第3 天、第7 天、第14天及第28 天的BBB 評(píng)分降低（P<0.05）；與SCI 組比較，SCI+外泌體組大鼠第3 天、第7 天、第14 天及第28天的BBB 評(píng)分升高（P<0.05），但SCI+miR-NC 組大鼠BBB 評(píng)分基本無(wú)變化（P>0.05）；與SCI+miR-NC組比較，SCI+miR-181c 組大鼠第3 天、 第7 天、第14 天及第28 天的BBB 評(píng)分升高（P<0.05）。 見表1。

表1 5 組大鼠BBB 評(píng)分比較分Tab.1 Comparison of BBB scores of rats in 5 groupssores

2.6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡的影響

與Sham 組比較，SCI 組大鼠脊髓組織中Cleaved Caspase 3/Caspase 3、Bax 表達(dá)水平升高 （0.62 ± 0.11 vs 0.11 ± 0.01，0.79 ± 0.08 vs 0.47 ± 0.02），Bcl2 表達(dá)水平降低 （0.11±0.01 vs 0.24±0.02）， 脊髓組織凋亡率升高 （14.83% ±2.01% vs 4.73% ±0.12%）（t = 16.130、6.950、13.000、11.200，P < 0.05）； 與SCI組比較，SCI + 外泌體組大鼠脊髓組織中Cleaved Caspase 3/Caspase 3、Bax 表達(dá)水平降低 （0.19 ± 0.06 vs 0.62±0.11，0.48±0.07 vs 0.79±0.08），Bcl2 表達(dá)水平升高（0.18±0.02），脊髓組織凋亡率降低（8.43%±1.01 %）（t = 9.045、6.080、7.000、6.326，P < 0.05）。 與SCI + miR-NC 組比較，SCI + miR-181c 組大鼠脊髓組織中Cleaved Caspase 3/Caspase 3、Bax 表達(dá)水平降低 （0.17 ± 0.03 vs 0.51 ± 0.06，0.17 ± 0.03 vs 0.75 ±0.08），Bcl2 表達(dá)水平升高（0.1±0.02 vs 0.05±0.01），脊髓組織凋亡率降低 （5.77%±0.63%vs 14.92%±1.93 %）（t = 10.540、15.180、5.000、10.080，P < 0.05）。見圖5。

圖5 TUNEL 染色觀察各組神經(jīng)元凋亡情況（呈綠色熒光，×200）Fig.5 TUNEL staining images of neuronal apoptosis in each group(green fluorescence,×200)

2.7 來(lái)源的外泌體對(duì)大鼠炎癥反應(yīng)的影響

與Sham 組比較，SCI 組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量升高（800.82 pg/mL±49.82 pg/mL vs 82.34 pg/mL ±10.24 pg/mL，594.24 pg/mL±40.72 pg/mL vs 77.24 pg/mL±5.33 pg/mL）， 脊髓組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達(dá)水平升高 （2.89±0.23 vs 0.98±0.11，3.01±0.38 vs 1.01±0.09）（t=31.590、28.150、16.750、11.450，P<0.05）； 與SCI 組比較，SCI + 外泌體組大鼠血清TNF-α、IL-1β 含量降低（400.82 pg/mL±21.00 pg/mL、273.03 pg/mL±42.93 pg/mL），脊髓組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達(dá)水平降低 （2.01 ± 0.24、2.01 ±0.22）（t = 16.620、12.140、5.920、5.093，P < 0.05）。 與SCI + miR-NC 組比較，SCI + miR-181c 組大鼠血清TNF-α、IL-1β 含量降低（164.22 pg/mL±26.03 pg/mL vs 806.92 pg/mL±46.92 pg/mL，110.34 pg/mL±20.91 pg/mL vs 602.84 pg/mL ± 39.84 pg/mL）， 脊髓組織中TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達(dá)水平降低 （1.36 ±0.38 vs 2.91 ± 0.32，1.67 ± 0.11 vs 2.99 ± 0.26）（t =26.780、24.480、6.977、10.460，P<0.05）。

3 討論

近年來(lái)， 隨著交通事故的頻發(fā)，SCI 的發(fā)病率也隨之升高，該疾病具有較高致殘率，給患者家庭造成巨大負(fù)擔(dān)，因此盡早修復(fù)SCI 至關(guān)重要。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞炎性反應(yīng)、凋亡在SCI 中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10，11]。 因此，如何減輕脊髓炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)元的凋亡成為治療的關(guān)鍵。

BMSC 是一種多潛能干細(xì)胞， 具有采集簡(jiǎn)單、排斥反應(yīng)小及多向分化的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療神經(jīng)損傷疾病[12]。 Jia Y 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將BMSC 移植到SCI 部位，可減輕局部炎癥反應(yīng)、減輕組織水腫、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Khodabandeh Z 等[14]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，SCI 模型移植BMSC 后可增加局部神經(jīng)元數(shù)量，減少壞死空洞面積。上述研究表明BMSC 可促進(jìn)損傷的脊髓修復(fù)，但具體機(jī)制尚不清楚。 外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑大約20~120 nm 的細(xì)胞外囊泡，在細(xì)胞間信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[15]。普遍認(rèn)為，BMSC 來(lái)源外泌體可代替BMSC 發(fā)揮其治療功能，同時(shí)外泌體安全性更高、免疫排斥作用更低。 筆者研究從BMSC 中提取了外泌體， 投射電子顯微鏡觀察到外泌體直徑在20 ~ 120 nm， 高表達(dá)外泌體特定的標(biāo)志物CD63、CD9，提示成功提取了BMSC 中的外泌體。

目前BMSC 來(lái)源的外泌體已經(jīng)應(yīng)用于多種疾病的治療，其對(duì)SCI 的保護(hù)作用也得到了普遍認(rèn)可。 研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 可抑制損傷脊髓組織中神經(jīng)元的凋亡，減輕炎癥反應(yīng)[16]。 Fan L 等[17]研究結(jié)果表明，BMSC來(lái)源的外泌體可通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB 通路抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)。 筆者研究通過(guò)尾靜脈將BMSC 來(lái)源的外泌體注射到SCI 模型大鼠體內(nèi)，可在脊髓神經(jīng)元內(nèi)檢測(cè)到熒光標(biāo)記的外泌體，說(shuō)明神經(jīng)元是BMSC 來(lái)源的外泌體的主要靶細(xì)胞。筆者進(jìn)一步觀察了BMSC 來(lái)源的外泌體對(duì)SCI 的修復(fù)作用，結(jié)果表明， 移植外泌體的SCI 大鼠BBB 評(píng)分高于SCI模型大鼠，提示BMSC 來(lái)源的外泌體可改善大鼠的下肢運(yùn)動(dòng)功能障礙。 進(jìn)一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體移植的大鼠脊髓組織中凋亡細(xì)胞更少，降低了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)， 同時(shí)還可以降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，提示BMSC 來(lái)源的外泌體可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，降低炎癥反應(yīng)。 上述結(jié)果與其他人研究結(jié)果基本一致[18]，再次驗(yàn)證了BMSC 來(lái)源的外泌體可通過(guò)抑制凋亡、減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮修復(fù)脊髓的作用。

在觀察到BMSC 來(lái)源的外泌體對(duì)SCI 的修復(fù)作用后， 筆者試圖探索外泌體中的何種物質(zhì)發(fā)揮作用。外泌體中包含多種活性成分，有學(xué)者在BMSC 來(lái)源的外泌體中分離出多種miRNAs[19，20]。 外泌體中的miRNAs 可被細(xì)胞吸收發(fā)揮轉(zhuǎn)移和介導(dǎo)細(xì)胞間通信的媒介。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs 參與了SCI 的修復(fù)過(guò)程，如miR-181c[21，22]。 研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c 在多種退行性疾病腦海馬組織中低表達(dá)， 提示低表達(dá)miR-181c 可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[23]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-181c 過(guò)表達(dá)可抑制氧-糖剝奪的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子IL-1β、TNF-α 的表達(dá)[24]。 此外，miR-181c 可抑制局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[25]。但外泌體中miR-181c 是否參與了SCI 的神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)尚不清楚。 筆者研究對(duì)此進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI 模型大鼠脊髓組織中低表達(dá)miR-181c，在注射過(guò)表達(dá)miR-181c 的BMSC 外泌體后大鼠的BBB 評(píng)分升高，炎性因子水平降低，且脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡降低， 提示BMSC 來(lái)源的外泌體可能通過(guò)miR-181c 實(shí)現(xiàn)對(duì)脊髓的修復(fù)作用。

但筆者研究存在一定的局限性。 首先，miR-181c在SCI 中的作用有待臨床樣本中驗(yàn)證。 其次，miR-181c 修復(fù)SCI 的機(jī)制需要細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索。

總之，BMSC 來(lái)源的外泌體攜帶的高水平miR-181c 可修復(fù)SCI，減少脊髓炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元凋亡。