龍須菜貯藏過程中的瓊膠品質變化研究

賀紫微,王迪,楊賢慶*,陳勝軍,趙永強,戚勃,相歡

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/農業(yè)農村部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東 廣州,510300)3(大連工業(yè)大學,海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連,116034)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis),又名海發(fā)菜、線菜、屬于紅藻門(Rhodophyta)江蘺科 (Gracilariaceae),是一種重要的產(chǎn)瓊膠類海藻,也是中國繼海帶、裙帶菜、紫菜之后的第四大栽培海藻[1],其原產(chǎn)地為山東,隨后在廣東、福建、海南等沿海省份養(yǎng)殖成功并大量栽培。2021年廣東省江籬產(chǎn)量高達45 138 t,占全國總量的12.23%,以龍須菜為代表的江蘺栽培已成為中國海藻栽培產(chǎn)業(yè)的重要支柱[2-3]。龍須菜在食品行業(yè)中的一個重要用途是提取瓊膠,瓊膠是由1,4-3,6內醚-α-L-半乳糖和1,3-β-D-半乳糖交替連接而成的多糖鏈,同時含有少量的硫酸基團[4],是目前世界上用途最廣泛的海藻膠(瓊膠、卡拉膠和海藻酸鈉)之一,由于其良好的凝膠特性,被廣泛用于食品、藥品和生化等領域[5-7]。

廣東沿海地區(qū)是我國龍須菜主要產(chǎn)地,由于收獲期炎熱多雨,農戶倉儲設備簡陋,遇高溫天氣時收獲堆積的龍須菜中心溫度可達50 ℃,且藻類作物在貯藏期間易受霉變,蟲蛀或其他污染物的干擾,極易發(fā)生品質劣變,進而影響其后續(xù)加工利用的經(jīng)濟效益,造成不可避免的經(jīng)濟損失[8]。因此,龍須菜在貯藏過程中的品質保證至關重要。貯藏時間是影響海藻瓊膠品質的重要因素,長時間貯藏會促進海藻多糖分子降解。FREILE-PELEGRN[9]曾報道過墨西哥尤卡坦州龍須菜瓊膠品質會受到貯藏時間的負面影響。ROMERO等[10]對龍須菜采后貯藏31個月胞壁多糖的狀況進行了研究,其結果也表明瓊膠的物理和結構參數(shù)一般都隨著貯藏時間的延長而降低。不僅如此,藻體水分含量、貯藏溫度增加也可能會加速瓊膠的降解過程[11]。張曦文等[12]探究了江籬在貯藏過程的瓊膠酶活性變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)江籬采收及干燥后的水分含量是影響瓊膠提取得率和凝膠強度的關鍵因素。ARMISEN[13]研究發(fā)現(xiàn),水分含量低于20%且貯藏條件干燥良好下的石花菜貯藏期限可達10年,其瓊膠的產(chǎn)量和質量與新鮮石花菜無異。海藻中的瓊膠降解程度會隨微生物的生長繁殖或瓊膠降解酶活性的升高而加劇。近年來,朱思穎等[14]發(fā)現(xiàn)了腐敗龍須菜中存在瓊膠酶會使其自身發(fā)生水解,探究表明江籬瓊膠的水解與微生物作用密切相關。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)瓊膠類海藻中34%的菌株對瓊膠具有降解性,在微生物分泌的瓊膠酶降解作用下,瓊膠黏度顯著下降,凝固性降低,瓊膠的凝膠性質改變[15-17]。

瓊膠的品質可以通過其物理特性(如凝膠強度、凝膠脫水、黏度、凝膠和熔融溫度)和化學特性(如硫酸鹽和3, 6-內醚半乳糖含量)反映。目前,關于海藻瓊膠的研究主要集中在海藻瓊膠的提取條件[18]、海藻種類[19]、海藻收獲季節(jié)[20]及環(huán)境參數(shù)[21]等因素對瓊膠的凝膠強度、凝膠脫水等品質影響的方面,但海藻收獲后的貯藏條件對其瓊膠品質的影響卻鮮有人探究。因此,本實驗通過模擬龍須菜采收及晾干后的自然貯藏條件,探究在貯藏過程中的龍須菜瓊膠提取得率、凝膠強度、瓊膠酶活性、還原糖含量、菌落總數(shù)和各項理化性質變化規(guī)律,明確瓊膠品質變化與貯藏條件之間的內在聯(lián)系,為合理貯藏龍須菜提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜采于廣東汕頭,2021年9月收獲,經(jīng)過初步的除雜、晾干等處理,水分含量控制在12%～55%;實驗用水為超純水;HCl、三氯乙酸、BaCl2、間苯二酚、乙縮醛、NaOH等,廣州化學試劑廠;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4快速恒溫數(shù)顯水浴鍋,常州澳華儀器有限公司;CT-3質構儀,美國Brookfield公司;BS224S分析天平,美國Sartorius公司;AS20500/BDT超聲清洗機,天津奧特賽恩斯儀器有限公司;Synergy全功能酶標儀,美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 瓊膠的提取

預處理→堿處理→水洗Ⅰ→酸處理→水洗Ⅱ→過濾提膠→冷凍脫水→干燥

工藝流程參照文獻[22-23]的方法,要點如下。

堿處理:將干重10.0 g龍須菜投入裝有400 mL體積分數(shù)25%的NaOH溶液的燒杯中,40 ℃水浴4 h。藻體質量與堿用量比為1∶40 (g∶mL),用蒸餾水將藻體水洗3～4次至近中性。

酸處理:將水洗后的龍須菜投入裝有400 mL的HCl溶液(pH 1.5)中浸泡10 min,排去酸液,用蒸餾水將藻體水洗3～4次至近中性。

提膠:加200 mL蒸餾水于洗至中性的龍須菜中,煮制30 min,趁熱過200目紗布過濾。

冷凍脫水:將凝膠放置-20 ℃冰箱中冷凍,24 h后取出解凍脫水。

烘干和粉碎:分別將脫水后的瓊膠,置于50 ℃烘箱中烘干,粉碎。

1.3.2 瓊膠得率和凝膠強度的測定

將水分含量為12%、25%、35%、45%和55%的龍須菜分別密封于保鮮袋中,再分別放置于10、20、30、40、50 ℃恒溫恒濕箱中模擬貯藏7 d,每組設置3個平行,測定經(jīng)處理后不同貯藏時期各項指標。

1.3.2.1 得率測定

瓊膠得率按公式(1)計算:

(1)

1.3.2.2 凝膠強度測定

參照GB 1886.239—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 瓊脂》中規(guī)定的方法制備瓊膠凝膠,將瓊膠液體倒入直徑50 mm的玻璃培養(yǎng)皿中,冷凝后采用CT3質構儀測定其凝膠強度(g/cm2)。測定方法和參數(shù):采用TA19圓柱探頭,測試類型破裂模式,測試速度0.5 mm/s,觸發(fā)點負載5 g,測定5～7次取平均值。

1.3.3 瓊膠硫酸基含量的測定

準確稱取瓊膠樣品35.0 mg于50 mL容量瓶中,加10 mL 1 moL/L HCl溶液,100 ℃水浴3 h,冷卻后補齊至25 mL,并用濾紙過濾。按標準曲線的制作方法測吸收值(A1-A2),由標準曲線計算樣品中硫酸基含量。

1.3.4 瓊膠3,6-內醚半乳糖含量的測定

參考李龍等[25]的方法優(yōu)化后使用。準確吸取果糖稀釋溶液(25 μg/mL) 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL的具塞試管中,用去離子水補至1.0 mL后蓋塞冰水浴5 min,分別加入5 mL間苯二酚溶液,置80 ℃恒溫水浴15 min后冰水浴冷卻,于554 nm波長下測吸收值。其中每點做3個平行樣品,取平均值。結果表明,果糖質量濃度在0～25 mg/mL線性關系良好,所得回歸方程為:Y=0.024 4X+0.088 9(R2=0.996 4)。

準確稱取瓊膠樣品25.0 mg于50 mL離心管中,加20 mL蒸餾水加熱溶解,冷卻后補齊至50 mL,按標準曲線的制作方法測吸收值,由標準曲線計算樣品中3, 6-內醚半乳糖含量。

1.3.5 瓊膠相對黏度的測定

參考問莉莉[26]的方法并稍作優(yōu)化。于30 ℃恒溫條件下,記1 mg/mL的糖液流經(jīng)烏氏黏度計的時間為t0。保持多糖濃度一致,記錄不同樣品糖液流經(jīng)烏氏黏度計的時間為t,糖液和溶劑水流經(jīng)時間的比值即為相對黏度ηr,如公式(2)所示:

(2)

1.3.6 龍須菜中菌落總數(shù)的測定

采用平板計數(shù)法,稱取25.0 g龍須菜樣品,放入225 mL無菌生理鹽水袋,均質。參考GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中的方法檢測。

1.3.7 龍須菜中還原糖含量的測定

參考文獻[14,27]的方法優(yōu)化后使用。取樣品5.0 g于燒杯中,加入50 mL蒸餾水,置100 ℃水浴30 min,攪拌,真空抽濾,保存濾液。分別取濾液1.0 mL至3支10 mL離心管中,加入1.5 mL DNS溶液,沸水浴5 min,終止反應后用蒸餾水定容至25 mL,于520 nm波長下測吸收值,根據(jù)標準曲線計算還原糖含量。

1.3.8 龍須菜中瓊膠酶活性的測定

參考文獻[14, 27]的方法,優(yōu)化后使用。取龍須菜樣品5.0 g于50 mL離心管中,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4) 50 mL渦旋振蕩15 min,4 ℃下4 000 r/min離心20 min,取1.0 mL上清液與含2 g/L瓊膠的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)1.5 mL于新的離心管中,混勻后40 ℃反應30 min后,加入1.5 mL DNS溶液,沸水浴5 min,終止反應后用蒸餾水定容至25 mL,于520 nm波長下測吸收值,根據(jù)標準曲線計算瓊膠酶活性。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

采用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,每組實驗做3次平行,結果用“平均值±標準差”表示,用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏條件對龍須菜瓊膠提取得率的影響

由圖1可知,相同貯藏時間和貯藏溫度下,龍須菜瓊膠提取得率隨著水分含量的增加而顯著減小(P<0.05),相同貯藏時間和水分含量下,龍須菜瓊膠提取得率隨著貯藏溫度的升高而顯著減小(P<0.05)。相對于貯藏溫度10 ℃,貯藏溫度50 ℃時水分含量對龍須菜瓊膠的提取得率的影響更顯著,相對于水分含量55%,水分含量12%時龍須菜瓊膠提取得率更高。這與張曦文等[12]對江籬瓊膠提取得率的研究結果具有相似性。在貯藏過程中,較高的水分含量和貯藏溫度會導致龍須菜提取的瓊膠得率明顯下降,結合不同貯藏條件下龍須菜中瓊膠酶活性的變化和還原糖含量變化,推測在適宜微生物生長的貯藏條件下,微生物大量繁殖,分泌瓊膠酶、纖維素酶及其他酶致使藻體軟化,在提取過程中瓊膠更易溶于堿液,導致水洗時膠質不同程度的流失,得率下降。

2.2 貯藏條件對龍須菜瓊膠凝膠強度的影響

由圖2可知,相同貯藏時間和貯藏溫度下,龍須菜瓊膠凝膠強度隨著水分含量的增加而減小,相同貯藏時間和水分含量下,龍須菜瓊膠凝膠強度隨著貯藏溫度的升高而減小。相對于貯藏溫度10 ℃,貯藏溫度50 ℃時水分含量對龍須菜瓊膠凝膠強度的影響更顯著,相對于水分含量55%,水分含量12%時龍須菜瓊膠凝膠強度更高。ROMERO等[10]和FREILE-PELEGRN等[11]曾報道,貯藏過程中,貯藏時間的延長和水分含量的增加對藻類瓊膠凝膠強度有消極影響。在實驗過程中發(fā)現(xiàn),還原糖含量與瓊膠酶活性高的龍須菜樣品,所提取的瓊膠凝膠強度普遍較低,對凝膠強度有顯著性差異的瓊膠樣品進行黏度檢測,通過相對黏度反映分子質量大小,其結果表明凝膠強度與黏度之間呈極顯著正相關,多糖分子質量的差異可能是導致凝膠強度變化的主要原因。可以推測在貯藏過程中海藻瓊膠發(fā)生了降解,瓊膠分子鏈斷裂,分解為沒有凝固性能的小分子,還原糖含量增加,3, 6-內醚半乳糖含量減少,瓊膠凝膠強度降低。

a-1 d;b-3 d;c-5 d;d-7 d圖2 不同水分含量及不同貯藏時間下貯藏溫度對凝膠強度的影響Fig.2 Effect of storage temperature on gel strength under different moisture content and storage time

2.3 貯藏條件對瓊膠理化性質的影響

硫酸基含量、3, 6-內醚半乳糖含量和相對黏度是瓊膠品質的重要判斷指標[28]。瓊膠的硫酸化程度與凝膠特性(凝膠強度、凝膠和熔融溫度)呈負相關性[29];3, 6-內醚半乳糖含量越高,瓊膠凝膠能力越強;相對黏度越大,瓊膠凝膠性能越好[30-31]。由表1～表3可知,貯藏溫度保持恒定,在相同水分含量下,龍須菜瓊膠的硫酸基含量隨著貯藏時間的增加呈現(xiàn)增加趨勢,3, 6-內醚半乳糖含量隨著貯藏時間的增加呈現(xiàn)減小趨勢。相同貯藏時間下,龍須菜瓊膠的硫酸基含量隨著水分含量的增加呈現(xiàn)增加趨勢,3, 6-內醚半乳糖含量隨著水分含量的增加呈現(xiàn)減小趨勢。ROMERO等[10]和FREILE-PELEGRN等[11]的報道中,多糖分子質量的減少被認為是貯藏6個月后海藻瓊膠凝膠品質下降的主要原因,在本試驗中,瓊膠的相對黏度隨著貯藏時間和水分含量的增大呈現(xiàn)減小趨勢,可以推測出,高水分含量加速了龍須菜瓊膠的降解。

表1 10 ℃貯藏下不同水分含量龍須菜的理化性質 Table 1 Physical and chemical properties of G.lemaneiformis with different moisture content at stored 10 ℃

表2 30 ℃貯藏下不同水分含量龍須菜的理化性質Table 2 Physical and chemical properties of G.lemaneiformis stored at 30 ℃

2.4 貯藏條件對菌落總數(shù)的影響

由圖3可知,龍須菜在不同水分含量和貯藏溫度貯藏過程中菌落總數(shù)的變化。由圖3-a可知,水分含量12%時,貯藏溫度和貯藏時間對龍須菜菌落總數(shù)影響不明顯;由圖3-b和圖3-c可知,水分含量35%和55%條件下,菌落總數(shù)隨著貯藏時間的延長而上升,且不同貯藏溫度下,菌落總數(shù)從高到低順序為30 ℃>50 ℃>10 ℃。龍須菜附生菌在適宜的生長條件下大量繁殖,分泌瓊膠酶,導致瓊膠降解[32-34]。

2.5 貯藏條件對龍須菜中還原糖含量的影響

由圖4可知,龍須菜中還原糖含量受水分含量和貯藏溫度的影響。由圖4-a可知,水分含量12%時,貯藏溫度和貯藏時間對龍須菜還原糖含量影響不明顯,當水分含量增加至35%和55%時,由圖4-b和圖4-c可知,任意時刻下,30 ℃和50 ℃條件下龍須菜還原糖含量均比10 ℃條件下的龍須菜還原糖含量高,龍須菜中還原糖含量隨貯藏溫度和貯藏時間的增加而顯著升高(P<0.05)。這些發(fā)現(xiàn)與朱思穎等[14]利用腐爛龍須菜水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的實驗中還原糖變化趨勢一致。在貯藏過程中,內源性或微生物來源的酶引起瓊膠水解、多糖鏈斷裂,導致還原糖含量顯著升高,且這與產(chǎn)瓊膠酶的微生物生長繁殖以及酶活性發(fā)揮的最適溫度和水分含量有關。

a-12%;b-35%;c-55%圖4 不同水分含量下貯藏溫度對還原糖的影響Fig.4 Effect of storage temperature on reducing sugar under different moisture content

2.6 貯藏條件對龍須菜中瓊膠酶活性的影響

由圖5可知,龍須菜中瓊膠酶活性受水分含量和貯藏溫度的影響。由圖5-a可知,水分含量12%時,貯藏溫度和貯藏時間對龍須菜瓊膠酶活力影響不明顯,可能的原因是,酶的表面需要一定量的水分子使酶催化底物的活性中心達到一定柔韌性的“開放”構象[29],水分含量12%的藻體水分含量極低,活性中心均不易與底物分子結合,故無明顯變化。ARMISEN[13]的報告中,也曾說明干燥良好的江籬(含水量低于20%)可以儲存近10年,而不會損失產(chǎn)量或瓊膠品質。由圖5-b可知,水分含量35%條件下,瓊膠酶活性隨著貯藏時間的延長顯著上升(P<0.05),且貯藏溫度30和50 ℃條件下的瓊膠酶活性明顯高于10 ℃條件下的瓊膠酶活性;由圖5-c可知,水分含量55%條件下,貯藏溫度10和30 ℃條件下的瓊膠酶活性隨著貯藏時間的延長顯著上升(P<0.05),貯藏溫度50 ℃條件下,隨著貯藏時間的增加,瓊膠酶活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,酶活性在第5天達到最高。研究表明,貯藏過程中水分含量和貯藏溫度的變化對龍須菜瓊膠酶活性具有重要的影響。

a-12%;b-35%;c-55%圖5 不同水分含量下貯藏溫度對瓊膠酶活性的影響Fig.5 Effect of storage temperature on agarase activity under different water content

3 結論與討論

該研究以龍須菜為實驗對象,通過還原糖含量、瓊膠酶活性和菌落總數(shù)研究不同貯藏條件對龍須菜瓊膠得率、凝膠強度的影響。實驗結果表明,貯藏過程中的貯藏溫度和水分含量對龍須菜瓊膠提取得率和瓊膠凝膠強度有顯著影響。藻體微生物大量繁殖,分泌瓊膠降解酶,導致瓊膠分子鏈斷裂,黏度下降,凝膠性能降低。結合現(xiàn)有研究現(xiàn)狀,綜合以上實驗結果可以得出,龍須菜有效的前處理和貯藏技術能有效抑制微生物的活動,從而提高瓊膠得率和凝膠品質。本實驗為龍須菜合理貯藏提供了科學依據(jù)。