降尿酸活性發(fā)酵乳桿菌F40-4在酸乳發(fā)酵中的應(yīng)用

吳宇,曹佳媛,劉伊索,劉銀雪,易華西*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 海德學(xué)院,山東 青島,266100)2(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266500)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是嘌呤代謝異常所致的慢性代謝疾病,常伴有痛風(fēng)、肥胖、糖尿病、高血壓等并發(fā)癥。研究表明,我國(guó)已經(jīng)成為HUA的多發(fā)地[1]。調(diào)查顯示,目前我國(guó)HUA患者集中于中老年男性和絕經(jīng)女性,呈現(xiàn)男性多于女性,沿海高于內(nèi)陸的分布,并具有年輕化的趨勢(shì)[2]。2000—2014年我國(guó)HUA患病率達(dá)13.3%[3]。2019—2020年廣州8 832名調(diào)查對(duì)象中患HUA比例達(dá)39.1%,其中男性患病率為53.6%,女性患病率為20.9%[4]。HUA已經(jīng)成為我國(guó)僅次于糖尿病的第二大代謝疾病。

目前治療HUA的藥物分為以下幾類:抑制嘌呤代謝相關(guān)酶的降尿酸藥物(別嘌呤醇、非布司他、托匹司他)[5],促進(jìn)尿酸排泄藥物(苯溴馬隆、丙磺舒)[6],雙重抑制降尿酸藥物,尿酸酶類藥物[7]。然而這些藥物可能引發(fā)肝功能受損、胃腸道不良反應(yīng)和腸道菌群失調(diào)等副作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),益生菌可能對(duì)尿酸異常具有一定的調(diào)節(jié)作用[9]。益生菌可以影響尿酸合成關(guān)鍵酶活性從而抑制尿酸的合成,也可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群等方式促進(jìn)尿酸的排泄,從抑制尿酸合成和加速尿酸排泄2個(gè)層面發(fā)揮降尿酸作用[[10]。據(jù)此,益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群或者促進(jìn)嘌呤和尿酸代謝可能是緩解或治療HUA的重要途徑之一。WANG等[11]認(rèn)為,腸道菌群對(duì)尿酸的生出、代謝、排泄有重要的影響。XIAO等[12]從傳統(tǒng)泡菜中篩選出14株乳酸菌,發(fā)現(xiàn)其對(duì)高尿酸血癥腎功能損傷具有一定的保護(hù)治療作用。酸乳是一種深受消費(fèi)者青睞的酸乳制品,也是益生菌發(fā)揮益生功能的重要載體。2015年,日本發(fā)現(xiàn)格氏乳桿菌PA-3通過(guò)降解嘌呤達(dá)到降低尿酸的效果,并據(jù)此研究開(kāi)發(fā)了具有降尿酸功效的明治PA-3益生菌酸乳。YAMANA等[13]也成功篩選了具有降尿酸活性的格氏乳桿菌LG08。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于降尿酸益生菌及其產(chǎn)品的研究不多,主要原因是缺乏降尿酸活性穩(wěn)定和發(fā)酵特性優(yōu)良的益生菌菌株。實(shí)驗(yàn)室前期從健康嬰兒糞便中篩選得到了1株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)F40-4,體外研究和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證均具有明顯的降尿酸效果。本研究旨在探究這株發(fā)酵乳桿菌F40-4在酸乳發(fā)酵中的應(yīng)用潛力,為進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)具有降尿酸功效的益生菌酸乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全脂乳粉、白砂糖、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌F40-4,中國(guó)海洋大學(xué)功能性乳品與益生菌工程實(shí)驗(yàn)室;MRS肉湯培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;PBS緩沖液,北京索萊寶生物科技有限公司;NaOH、酚酞,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1D超凈工作臺(tái),蘇州市凈化設(shè)備有限公司;202-3AB電熱恒溫干燥箱、LRH-250生化培養(yǎng)箱、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;PB-10酸度計(jì),德國(guó)賽多利斯集團(tuán);TG20KR-D高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;iCinac型酸化監(jiān)控儀,法國(guó)AMS公司;YP202 N電子天平,上海精科儀器有限公司;TA.XT PLUS質(zhì)構(gòu)儀,英國(guó)SMS公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將冷凍保存L.fermentumF40-4菌株的甘油菌液以2%的接菌量接入10 mL滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化,按此方法繼續(xù)活化3代,取活化第3代的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

參考楊慧等[14]的方法。分別取10 μL活化的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌液分別接種于0.6% MRS肉湯半固體培養(yǎng)基中,然后倒入提前放置牛津杯的平皿中,待培養(yǎng)基凝固后,取出牛津杯,向孔洞中加入150 μLL.fermentumF40-4菌液,以150 μL MRS肉湯為空白對(duì)照,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。觀察抑菌圈大小,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.3.3 酸乳制備

參考張穎等[15]的方法。將蒸餾水加熱至55 ℃后,加入12%脫脂奶粉和6%白糖,攪拌均勻后使溶液保持在65 ℃,水合30 min進(jìn)行分裝。用溫控水浴鍋加熱,使體系保持在95 ℃,高溫滅菌5 min后迅速冷卻至42 ℃。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組酸乳,按接種比例分為0∶1組(L.fermentumF40-4和發(fā)酵劑接種比例0∶1)、1∶1組(L.fermentumF40-4和發(fā)酵劑接種比例1∶1)、1∶2組(L.fermentumF40-4和發(fā)酵劑接種比例0.5∶1)。42 ℃恒溫發(fā)酵,利用酸化監(jiān)控儀每10 min測(cè)一次pH,每30 min測(cè)定一次可滴定酸度,待pH接近4.5時(shí),達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn),4 ℃冷卻后熟24 h,進(jìn)行酸乳理化性質(zhì)測(cè)定。

1.3.4 析水率測(cè)定

稱取10 g酸乳樣品,4 ℃,1 000 r/min離心10 min,稱取沉淀質(zhì)量,析水率按公式(1)計(jì)算:

(1)

1.3.5 可滴定酸度測(cè)定

參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》。利用酸堿滴定法,以酚酞為指示劑,0.1 mol/L NaOH測(cè)定酸乳中可滴定酸的含量。

1.3.6 微生物指標(biāo)測(cè)定

總活菌數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》,利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

使用質(zhì)構(gòu)儀采用2次咀嚼測(cè)試程序?qū)λ崛檫M(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析[16-17]。參數(shù)設(shè)置如下:底部類型為直徑50 mm圓柱形探頭,力量感應(yīng)源ILC/500 N,底部類型為直徑50 mm圓柱形探頭,形變百分量35%,檢測(cè)速度60.0 mm/min,觸發(fā)力0.75 N。

1.3.8 感官評(píng)價(jià)

挑選10名接受過(guò)專業(yè)感官分析培訓(xùn)的學(xué)生組成評(píng)價(jià)組(男女比例為1∶1),分別對(duì)發(fā)酵酸乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.9 風(fēng)味化合物測(cè)定

樣品準(zhǔn)備:準(zhǔn)確稱取2.0 g酸乳樣品于頂空瓶中,3組樣品每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

頂空條件:孵育溫度60 ℃,時(shí)間10 min,孵育速度250 r/min,進(jìn)樣速率51 mL/min,進(jìn)樣針溫度T3為65 ℃,進(jìn)樣體積為500 μL。

GC-IMS條件:FS-SE-54-CB-1色譜柱(15 m×0.53 mm,1 μm);IMS溫度T145 ℃;柱溫T240 ℃;漂移氣(E1)和載氣(E2)均為氮?dú)?純度99.999%。色譜洗脫程序?yàn)槌绦蛏龎?E1和E2流量隨時(shí)間變化情況如表1所示。

表1 色譜柱洗脫參數(shù)Table 1 Elution parameters of column

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以星號(hào)表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳發(fā)酵劑菌株生長(zhǎng)的影響

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是酸乳發(fā)酵劑的主體菌株。開(kāi)發(fā)復(fù)合發(fā)酵劑的前提是輔助發(fā)酵菌株與保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌之間不能有明顯的生長(zhǎng)拮抗作用。據(jù)此,研究了L.fermentumF40-4對(duì)酸乳發(fā)酵劑主體菌株保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的影響,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明,L.fermentumF40-4對(duì)嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用,對(duì)保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)有輕微抑制作用,但其程度不影響菌株的生長(zhǎng)發(fā)酵。保加利亞乳桿菌是酸乳發(fā)酵劑中的主要產(chǎn)酸菌株,若能在酸乳后熟期一定程度地抑制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng),則可以有效減輕后酸化[18],改善酸乳的風(fēng)味和口感。L.fermentumF40-4對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的輕度抑制特性有可能在酸乳后熟和貯藏期間起到延緩后酸化的作用。另外,L.fermentumF40-4對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的影響研究是在MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行,L.fermentumF40-4在牛乳基質(zhì)中對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的影響還待進(jìn)一步研究。

a-保加利亞乳桿菌;b-嗜熱鏈球菌圖1 L.fermentum F40-4對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of L.fermentum F40-4 on the growth of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus

2.2 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中pH和酸度的影響

將L.fermentumF40-4與酸乳發(fā)酵劑配比分別調(diào)配為0∶1、1∶1和1∶2,于42 ℃發(fā)酵,每隔10 min測(cè)定pH和可滴定酸度,結(jié)果如圖2所示。3組酸乳的pH在發(fā)酵過(guò)程中均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),在3 h后3組發(fā)酵樣品中的pH均為4.5左右,達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。1∶1和1∶2組發(fā)酵酸乳樣品的pH在前90 min一直高于0∶1組。在90 min后,3組樣品pH的下降速率均有所減緩;相對(duì)1∶1組和0∶1組而言,1∶2組發(fā)酵酸乳pH下降速率最快,且發(fā)酵終點(diǎn)pH最低。上述結(jié)果表明L.fermentumF40-4在前90 min發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵劑菌株具有輕微的抑制作用,這與前面L.fermentumF40-4對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果一致,但在發(fā)酵后期這種抑制作用基本消失。酸乳發(fā)酵過(guò)程中的酸度變化趨勢(shì)與pH變化基本一致。結(jié)合3組樣品發(fā)酵過(guò)程中pH和酸度的整體變化情況,L.fermentumF40-4的添加不會(huì)影響酸乳的正常發(fā)酵進(jìn)程。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中酸乳的pH變化Fig.2 Change of pH value of yogurt during fermentation

2.3 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳冷藏過(guò)程中pH的影響

酸乳發(fā)酵結(jié)束后,冷藏后熟是賦予酸乳更佳風(fēng)味和口感的重要步驟。在本研究中,酸乳發(fā)酵停止后,將酸乳置于4 ℃冷藏24 h,3組酸乳樣品的pH如圖3所示。

圖3 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳樣品冷藏pH的影響Fig.3 Effect of L.fermentum F40-4 on pH of refrigerated yogurt samples

3組樣品在貯藏過(guò)程中pH都降低了,其中1∶1樣品組酸乳下降最少,0∶1組下降最多,說(shuō)明L.fermentumF40-4的添加對(duì)主要產(chǎn)酸菌保加利亞乳桿菌具有一定的抑制作用。市售酸乳的pH一般在4～4.5[21-22],3組酸乳樣品的pH均在此范圍。后酸化是目前酸乳冷藏和貯藏過(guò)程中的一種負(fù)面現(xiàn)象,主要是由于保加利亞乳桿菌持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致,影響了酸乳的口感和風(fēng)味。上述研究結(jié)果表明,L.fermentumF40-4可以延緩酸乳在冷藏過(guò)程中的pH下降進(jìn)程,具有改善酸乳后酸化的效果。這可能是由于L.fermentumF40-4對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)具有一定程度的抑制作用,從而延緩了后酸化。

2.4 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳貯藏過(guò)程中活菌數(shù)的影響

活菌數(shù)是評(píng)判酸乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。3組酸乳樣品在貯藏過(guò)程中的最終活菌數(shù)如圖4所示。1∶1組的總活菌數(shù)最高,1∶2組樣品活菌數(shù)次之,0∶1組樣品的總活菌數(shù)最低,原因可能是1∶1組樣品中L.fermentumF40-4的接種量比0∶1組和1∶2組樣品多,所以該組酸乳樣品的總活菌數(shù)最高。3組樣品的活菌數(shù)都在109以上,符合酸乳品質(zhì)要求。

圖4 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳貯藏活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of L.fermentum F40-4 on the number of bacteria in yogurt samples during storage

2.5 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳析水率的影響

析水率是表征酸乳凝固特性的重要指標(biāo)。添加不同比例的L.fermentumF40-4對(duì)酸乳冷藏過(guò)程中析水率的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳貯藏析水率的影響Fig.5 Effect of L.fermentum F40-4 on water-discharging rate of yogurt during storage

結(jié)果表明,1∶1組樣品的析水率最低,0∶1組樣品的析水率最高。酸乳的析水率與酸度、菌粉添加量等因素有關(guān),若酸度較低或菌粉添加較多且有震動(dòng)收縮過(guò)程均會(huì)導(dǎo)致析水率上升[21]。酸度過(guò)高,超過(guò)了酪蛋白的等電點(diǎn),酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)脫水現(xiàn)象,導(dǎo)致乳清析出較多;菌粉添加量較多,則凝乳微粒數(shù)量較多,一旦受到震動(dòng),水從酪蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中流出。根據(jù)結(jié)果可知,添加L.fermentumF40-4能夠降低酸乳析水率,減少了乳清析出,且最佳添加比例為1∶1。

2.6 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)是評(píng)價(jià)酸乳品質(zhì)的另外一個(gè)重要指標(biāo),與酸乳的口感和風(fēng)味密切相關(guān)。對(duì)L.fermentumF40-4不同添加量的3組酸乳樣品進(jìn)行了質(zhì)構(gòu)檢測(cè)分析,結(jié)果如表2所示。3組樣品的內(nèi)聚性、硬度、咀嚼性、彈性、黏附性、膠黏性均無(wú)顯著差異。酸乳硬度是指質(zhì)構(gòu)探頭穿過(guò)酸乳過(guò)程中受到的壓力最大值,與原料乳、加熱強(qiáng)度、均質(zhì)參數(shù)、酸乳酸度等因素有關(guān)[14-15]。該3組樣品在原料乳、加熱處理、均質(zhì)強(qiáng)度等方面均保持一致,因此影響酸乳樣品硬度的因素可能與酸乳酸度有關(guān)。雖然L.fermentumF40-4的添加對(duì)酸乳的pH有一定的影響,但不會(huì)影響酸乳的質(zhì)構(gòu)指標(biāo),對(duì)酸乳口感不會(huì)帶來(lái)負(fù)面影響。

表2 不同酸乳樣品的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Table 2 Results of texture analysis of yogurt samples

2.7 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳感官評(píng)價(jià)的影響

感官評(píng)價(jià)是評(píng)判酸乳品質(zhì)的最直觀指標(biāo)。為研究添加L.fermentumF40-4對(duì)酸乳感官特性的影響,對(duì)3組酸乳樣品進(jìn)行了感官評(píng)價(jià),結(jié)果如圖6所示。

圖6 L.fermentum F40-4對(duì)對(duì)酸乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果的影響Fig.6 Effect of L.fermentum F40-4 on the sensory evaluation of yogurt samples

結(jié)果表明,未添加L.fermentumF40-4的0∶1組酸乳樣品感官評(píng)價(jià)顯著低于其他2組酸乳樣品。1∶2組樣品的色澤、質(zhì)地、氣味較佳,但口感上略有顆粒感,口味偏酸。1∶1組樣品的色澤乳白,氣味香甜且富有乳香風(fēng)味,質(zhì)地細(xì)膩無(wú)顆粒和裂紋,滋味酸甜適中,口感細(xì)膩綿密,無(wú)乳清析出,其在氣味、質(zhì)地、口感、滋味和色澤方面都高于0∶1組樣品,評(píng)分最高。上說(shuō)結(jié)果說(shuō)明接種L.fermentumF40-4可以提升酸乳的感官特性。

2.8 L.fermentum F40-4對(duì)酸乳揮發(fā)性風(fēng)味化合物影響

測(cè)定了1∶1組樣品和0∶1組樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),對(duì)差異風(fēng)味化合物進(jìn)行比較分析研究,結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明,酸乳風(fēng)味中化合物主要為烴類、酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、芳香族。添加L.fermentumF40-4后,酸乳樣品中的酯類含量顯著提高,包括肉桂酸甲酯、乙酸異丙酯、乙酸龍腦酯等,提升了酸乳的香味。在2組酸乳樣品的差異風(fēng)味組分中檢測(cè)出了乙酸辛酯、水楊酸甲酯、乙酸異丙酯、2-苯乙醇乙酸酯等酯類物質(zhì),其中肉桂酸甲酯、乙酸異丙酯、乙酸龍腦酯含量較高。在2組酸乳樣品中檢測(cè)出的差異酸類風(fēng)味物質(zhì)為辛酸、壬酸、乙酸,其中辛酸含量最高,賦予酸乳清香風(fēng)味。醛類化合物屬于微量香氣成分,對(duì)酸乳風(fēng)味構(gòu)成有重要影響[22]。在2組樣品的差異風(fēng)味組分中檢測(cè)出了正庚醛、壬醛等醛類物質(zhì)。酮類和醛類化合物由多不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸或微生物代謝產(chǎn)生,可賦予酸乳特有的風(fēng)味。在2組樣品的差異風(fēng)味化合物中檢測(cè)到了酮類和醛類化合物有2-丁酮。正庚醛、反式-2-己烯醛、戊烯醛。L.fermentumF40-4是專性發(fā)酵乳桿菌,除了上述風(fēng)味化合物之外,其發(fā)酵代謝產(chǎn)物還可能有乳酸、CO2和乙醇等物質(zhì)。綜上研究結(jié)果表明,添加L.fermentumF40-4賦予了酸乳更多的風(fēng)味物質(zhì)。

3 結(jié)論

將具有降尿酸活性的L.fermentumF40-4和酸乳發(fā)酵劑以不同比例組成復(fù)合發(fā)酵劑,探究L.fermentumF40-4對(duì)發(fā)酵酸乳品質(zhì)的影響。與不添加L.fermentumF40-4的酸乳相比,添加L.fermentumF40-4的酸乳樣品活菌數(shù)更高,析水率更低,提高了酸乳的質(zhì)構(gòu)和感官特性,產(chǎn)生了更豐富的風(fēng)味物質(zhì)。該研究結(jié)果表明添加L.fermentumF40-4有助于提高酸乳的品質(zhì),可作為輔助發(fā)酵劑用于降尿酸益生酸乳的發(fā)酵生產(chǎn)。