高溫大曲中大曲巖石芽孢桿菌的篩選及其特性分析

孫佳,杜海*,徐巖*

1(江南大學(xué) 釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)

近年來,發(fā)酵食品受到廣泛的歡迎,在各國(guó)菜肴中占有重要的地位[1]。發(fā)酵食品采用自然接種、天然發(fā)酵的工藝,具有獨(dú)特的風(fēng)味特征。白酒是一種典型的多菌種固態(tài)發(fā)酵食品,風(fēng)味是衡量白酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[2]。醬香型白酒是中國(guó)三大傳統(tǒng)白酒之一,因其獨(dú)特的風(fēng)味而廣受喜愛。醬香型白酒具有濃郁持久的香氣,無論是香味化合物的種類還是含量都遠(yuǎn)高于其他香型白酒[3]。醬香型白酒的風(fēng)格源于其獨(dú)特的釀造工藝和發(fā)酵特點(diǎn)[4]。醬香型白酒的釀造采用高溫大曲, 高溫大曲含有多種微生物和酶類,在賦予醬香型白酒典型特征香氣和口味方面起著重要作用。

高溫大曲生產(chǎn)過程中的培養(yǎng)溫度為60 ℃以上,遠(yuǎn)高于其他大曲[5]。高溫大曲在堆積發(fā)酵結(jié)束拆倉(cāng)時(shí)會(huì)形成不同顏色的曲塊,分為白曲、黃曲和黑曲[6]。溫度是影響高溫大曲發(fā)酵過程中微生物群落組裝和風(fēng)味代謝的關(guān)鍵環(huán)境因素之一[7-8]。芽孢桿菌為多種類型大曲中最具代表性和具有耐高溫特性的細(xì)菌之一,被證明是醬香型白酒生產(chǎn)中主要的產(chǎn)醬香風(fēng)味功能性細(xì)菌,在白酒的發(fā)酵過程中,可以水解蛋白質(zhì)和淀粉等大分子物質(zhì),并代謝生成多種風(fēng)味化合物,其對(duì)于白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)已被廣泛研究[9-11]。

除了研究較多的芽孢桿菌外,其他微生物的潛在功能也需要探索。大曲巖石芽孢桿菌(Scopulibacillusdaqui)最早是從芝麻香型白酒制作過程中采集的高溫大曲樣品中分離出來的一株嗜熱菌[12],與其相關(guān)的研究報(bào)道非常少。本研究使用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和高通量測(cè)序技術(shù),同時(shí)運(yùn)用相關(guān)性分析的手段,解析了火山渣芽孢桿菌屬(Scopulibacillus)與大曲風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)程度。并以高溫大曲黑曲樣本為篩菌對(duì)象,采取合適的分離篩選辦法,對(duì)高溫大曲中的火山渣芽孢桿菌屬微生物進(jìn)行分離,研究其對(duì)在不同溫度下(30、40、50、60 ℃)的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)風(fēng)味情況。本研究有助于高溫大曲中嗜熱微生物的研究,并為其在制曲工藝中的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

高溫大曲樣本,貴州省某酒廠,選取黃白黑3種不同類型的大曲樣本各3塊作為平行采集樣本,詳細(xì)信息見表1。將曲磨成細(xì)粉,確保每個(gè)樣品的質(zhì)量有200 g,放入自封袋中及時(shí)轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

1.2 主要試劑與儀器

乙醇、三氯甲烷、酵母粉、瓊脂粉、蛋白胨,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司;飽和酚溶液,生工生物工程(上海)股份有限公司。

GC 7890B氣相色譜/MS 5975質(zhì)譜、色譜柱DB-FFAP,美國(guó)Agilent公司;SPME自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),德國(guó)Gerstel公司;三相萃取頭,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 核酸提取、測(cè)序及生物學(xué)分析

為了確定大曲中的微生物群落結(jié)構(gòu),提取大曲的DNA后進(jìn)行高通量測(cè)序。DNA提取具體實(shí)驗(yàn)步驟參考ZHANG等[13]的方法。提取到的總DNA測(cè)定其濃度后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將質(zhì)量濃度>50 ng/μL,且具有清晰條帶的DNA樣本置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜?xì)菌使用通用引物組338F和806R擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)。真菌使用通用引物組ITS3和ITS4擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)區(qū)域。測(cè)序工作由南京基序智谷生物科技有限公司(中國(guó)南京)完成。生成的所有原始序列均通過QIIME v.1.9.1和R(http://www.r-project.org)進(jìn)行處理。使用Greengene_16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)和基于QIIME的RDP分類器包裝器(v.2.2),對(duì)代表性的細(xì)菌OTU序列進(jìn)行注釋。使用BLAST將代表性真菌OTU序列與UNITE真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)(https://unite.ut.ee/)進(jìn)行比較。

1.4 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

將大曲粉(5 g)添加到20 mL超純水中,超聲波處理30 min(0 ℃),4 ℃冰箱過夜放置后8 000×g離心10 min(4 ℃),收集上清液備用。在20 mL頂空樣品瓶中依次加入5 mL上清液以及1.5 g NaCl,再以5 μL薄荷醇(質(zhì)量濃度為100 mg/L)作為內(nèi)標(biāo),迅速用帶聚四氟乙烯墊片的空心鐵蓋密封。檢測(cè)條件參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法[14]。

1.5 菌株的篩選及形態(tài)學(xué)觀察

稱取10 g高溫大曲黑曲樣品,加入90 g滅菌后的0.9%生理鹽水和2～3顆玻璃珠,放置于50 ℃培養(yǎng)箱振蕩30 min。涂布適宜稀釋梯度的菌懸液于LB平板,重復(fù)操作3次后置于50 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h,根據(jù)不同菌落形態(tài)進(jìn)行類編號(hào)和形態(tài)學(xué)觀察。

1.6 菌株的分子生物學(xué)鑒定

使用Plant Genomic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒提取待測(cè)菌株的DNA。以細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性6 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。測(cè)定濃度后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。將符合條件的DNA樣本送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì),用MEGA 11.0構(gòu)建目標(biāo)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 菌株的生長(zhǎng)特性研究

將分離篩選出的菌株接種于小麥汁培養(yǎng)基中,分別于30、40、50、60 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng),每隔3 h取一次樣,并于600 nm處測(cè)其OD值。

1.8 菌株的固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味成分分析

小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基:破碎后的小麥為原料,加入95 ℃的水(50%)潤(rùn)糧5 h,115 ℃滅菌30 min,無菌條件下按200 U/g淀粉加入糖化酶,60 ℃處理2 h,裝瓶115 ℃滅菌30 min備用。將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基,50 ℃搖床培養(yǎng)24 h即為種子液。將種子液按10%的接種量添加至100 g的小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別置于30、40、50、60 ℃ 4個(gè)不同溫度下的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵7 d。采用HS-SPME-GC-MS分析檢測(cè)菌株在不同溫度下發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。具體操作參考1.4節(jié)的方法。

1.9 數(shù)據(jù)分析及繪圖

利用SIMCA-14.1軟件對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析;使用RFRUSPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算出Spearman相關(guān)系數(shù),顯著性水平設(shè)定在0.05,利用Gephi繪制網(wǎng)絡(luò)圖;生長(zhǎng)曲線及風(fēng)味變化繪圖采用Origin 2022。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫大曲中的揮發(fā)性組分分析

通過HS-SPME-GC-MS分析,在黃白黑3種高溫大曲樣本中共鑒別出135種揮發(fā)性化合物,共計(jì)12類(表2)。其中定性出的數(shù)量最多的是含氮化合物、醇類和酯類化合物,均定性出23種,共占據(jù)全部組分的51.11%。并非所有揮發(fā)性成分都具有一定的香氣屬性,將定性出的135種揮發(fā)性化合物與Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)兩個(gè)香氣數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示共有78種化合物具有香氣貢獻(xiàn),其相對(duì)含量如增強(qiáng)出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034637)。

表2 三種類型大曲中鑒定的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds identified in three kinds of Daqu

采用偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)模型法,對(duì)不同樣本間的78種香氣化合物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。如圖1所示,9個(gè)高溫大曲樣品根據(jù)黃白黑3種不同類型聚為3類,表明黃白黑3種不同類型的大曲之間的代謝物具有顯著差異。如電子增強(qiáng)出版附表1所示,含氮化合物中2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪在黃曲和黑曲中的含量明顯高于白曲。YANG等[15]基于全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography and time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF/MS)和超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用(ultra performance liquid chromatography with tandem quadrupole time of flight mass spectrometer,UPLC-Q-TOF/MS)從高溫大曲3種不同類型的大曲中共檢測(cè)出647種化合物,其中黑曲和黃曲中的吡嗪結(jié)構(gòu)多樣,如2,6-二甲基吡嗪僅存在于黑曲和黃曲。WANG等[16]的研究表明在高溫環(huán)境下,嗜熱微生物(如芽孢桿菌)可以產(chǎn)生吡嗪,成為占主導(dǎo)地位的微生物群落,說明黑曲和黃曲的發(fā)酵溫度可能更高。因此,3種大曲中化合物的組成和含量差異顯著,可能是由于發(fā)酵室不同區(qū)域溫度差異引起的菌群差異所導(dǎo)致的。

圖1 三種類型大曲的PLS-DA評(píng)分圖Fig.1 PLS-DA score plot of three kinds of Daqu

2.2 高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了揭示高溫大曲黃白黑樣品中菌群結(jié)構(gòu)的差異,對(duì)細(xì)菌和真菌屬水平進(jìn)行了分析。高通量結(jié)果顯示所有樣品中共檢測(cè)到108個(gè)細(xì)菌屬和22個(gè)真菌屬。本研究將相對(duì)豐度>1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)屬,其分布情況如圖2所示。

a-細(xì)菌;b-真菌圖2 三種類型大曲的微生物群落屬水平結(jié)構(gòu)Fig.2 Microbial community structure at the genus level of three kinds of Daqu

對(duì)于真菌屬,Thermoacus和Thermomyces在所有樣品中均占有極高的豐度,其平均相對(duì)豐度分別為49.8%和41.9%。對(duì)于細(xì)菌屬,細(xì)菌群落主要由3種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬組成:Virgibacillus、Kroppenstedtia、Scopulibacillus,其平均相對(duì)豐度分別為34.9%、29.3%、11.2%。ZHU等[17]研究了高溫大曲發(fā)酵過程微生物多樣性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,結(jié)果表明Kroppenstedtia、Bacillus、Virgibacillus、Thermoascus和Thermomyces為高溫大曲發(fā)酵終點(diǎn)的標(biāo)志性微生物。此外,已有研究揭示了Scopulibacillus是高溫大曲的代表性細(xì)菌群之一[18],在我們的研究中Scopulibacillus隨大曲顏色的加深而明顯增多(白曲1.4%,黃曲8.7%,黑曲23.7%)。這很可能是由于其作為一種嗜熱菌屬,相對(duì)于白曲,黃曲和黑曲的發(fā)酵溫度更高,因而更有利于其生長(zhǎng)繁殖。

2.3 微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析是研究微生物和風(fēng)味化合物之間潛在相互作用的有力工具。為了加強(qiáng)黃白黑大曲樣本之間的分離,進(jìn)行了PLS-DA。通過變量投影重要性指標(biāo)(variable importance in projection,VIP)值來判別對(duì)于區(qū)分黃白黑3種大曲具有一定貢獻(xiàn)的差異微生物和風(fēng)味化合物,其中共有5種微生物和28種香氣化合物VIP值>1。因此計(jì)算了5種差異微生物與28種差異化合物之間的Spearman相關(guān)系數(shù),并選取ρ>0.5和顯著性P<0.05的關(guān)系作為網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)相關(guān)節(jié)點(diǎn)(圖3)。分析結(jié)果顯示,3個(gè)細(xì)菌屬與2個(gè)真菌屬與20種風(fēng)味化合物呈顯著正相關(guān)性(P<0.05,ρ>0.5)。其中,Scopulibacillus與6種風(fēng)味化合物顯著正相關(guān)(P<0.05,ρ>0.5)。參考香氣數(shù)據(jù)庫(kù),這6種風(fēng)味化合物大多都有怡人的芳香氣味,如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪(炸馬鈴薯)、3-羥基-2-丁酮(奶油味)、鄰苯二甲醚(香草味)、正己醇(花香味)和苯乙醇(蜂蜜味)。SHI等[18]研究結(jié)果顯示包含Scopulibacillus在內(nèi)的4個(gè)細(xì)菌屬和2個(gè)真菌屬幾乎與高溫大曲所有豐富的揮發(fā)物都表現(xiàn)出正相關(guān)。這些結(jié)果表明Scopulibacillus可能是高溫大曲中重要的風(fēng)味功能微生物。

圖3 微生物與揮發(fā)性物質(zhì)之間的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between microbiota and volatile compounds

2.4 菌株的分離篩選及形態(tài)學(xué)特征

利用平板涂布分離方法,對(duì)能夠在50 ℃的高溫條件下存活的菌株進(jìn)行多次分離純化。最終得到1株純種菌株LBM32026。其在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果如圖4所示。

a-菌落形態(tài)圖;b-顯微形態(tài)圖圖4 菌株LBM32026的形態(tài)學(xué)特征Fig.4 Morphological characteristics of strain LBM32026

2.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定

以目標(biāo)菌株的DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增出的16S rDNA序列大小為1 443 bp。從系統(tǒng)樹可知,LBM32026與大曲巖石芽孢桿菌親緣關(guān)系最近。通過序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)菌株LBM32026與Scopulibacillusdaqui(KC913194.1)相似性為99.79%。由此可確定這株菌為Scopulibacillusdaqui,其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。

圖5 菌株LBM32026系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of strain LBM32026

2.6 菌株的生長(zhǎng)特性研究

由圖6可知,該菌株在50和60 ℃的高溫條件下培養(yǎng)9 h后逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)期,15 h時(shí)OD600達(dá)到最大,此后菌株生長(zhǎng)較為平緩,進(jìn)入穩(wěn)定期。而在30 ℃和40 ℃的低溫條件下,菌株幾乎不生長(zhǎng)。即該菌株在50 ℃和60 ℃條件下生長(zhǎng)較為迅速,在30 ℃和40 ℃條件下生長(zhǎng)速度變慢甚至出現(xiàn)抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

圖6 菌株LBM32026在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of strain LBM32026 at different temperatures

2.7 菌株的固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味成分分析

為了進(jìn)一步確定ScopulibacillusdaquiLBM32026產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物,采用HS-SPME-GC-MS分析檢測(cè)耐高溫菌株在30、40、50、60 ℃ 4個(gè)不同溫度下發(fā)酵7 d的發(fā)酵產(chǎn)物,共發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性化合物40種。其中包括8種醇類、2種酯類、3種酸類、8種含氮類、7種芳香族、4種酚類、5種醛類、1種酮類、1種內(nèi)酯類和1種其他類化合物,其半定量計(jì)算結(jié)果見增強(qiáng)出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034637)。經(jīng)對(duì)比在原位體系中6種與Scopulibacillus顯著正相關(guān)的風(fēng)味化合物也均被檢測(cè)到,其中2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪僅在50、60 ℃中被檢測(cè)出,這表明高溫更有利于這類物質(zhì)的產(chǎn)生。3-羥基-2-丁酮的含量呈先升高后下降的趨勢(shì),在發(fā)酵體系中其可以作為四甲基吡嗪合成的前體物質(zhì)。鄰苯二甲醚僅在40 ℃下微量檢出。正己醇和苯乙醇的含量隨著發(fā)酵溫度的升高整體呈下降趨勢(shì)。

隨著溫度的升高,菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分整體含量、含氮化合物、酚類、醛類、內(nèi)酯類和酸類化合物含量呈上升趨勢(shì)。含氮化合物主要是吡嗪類,是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物之一[19]。吡嗪類化合物一般具有烘焙香和堅(jiān)果香味,對(duì)高溫大曲曲香的形成具有重要貢獻(xiàn)[20]。菌株還可以代謝生成愈創(chuàng)木酚,相對(duì)含量占總揮發(fā)性化合物的20%以上,愈創(chuàng)木酚具有煙熏風(fēng)味,是醬香型白酒中主要的酚類物質(zhì)。醛類化合物通常表現(xiàn)為水果香味,是大曲和白酒中的重要呈香物質(zhì)。包含丙位壬內(nèi)酯在內(nèi)的內(nèi)酯類化合物,具有奶香、水果香、堅(jiān)果香、焦糖香等優(yōu)良的風(fēng)味特征,對(duì)大曲和白酒整體風(fēng)味的形成具有重要作用[21]。菌株在60 ℃發(fā)酵可以產(chǎn)生酸類物質(zhì)3-甲基丁酸。王勇等[22]提取牛欄山二鍋頭中的香氣化合物,發(fā)現(xiàn)3-甲基丁酸等是聞香強(qiáng)度較高的物質(zhì),且具有水果香,對(duì)白酒整體香氣貢獻(xiàn)較大。如圖7所示,芳香族、醇類和酯類這3類化合物在30和40 ℃下含量較高。首先,固態(tài)發(fā)酵相較于液態(tài)發(fā)酵其發(fā)酵時(shí)間更長(zhǎng)且營(yíng)養(yǎng)底物更豐富,所以菌株在30和40 ℃的固態(tài)發(fā)酵條件下也能生長(zhǎng),并代謝了部分發(fā)酵產(chǎn)物。此外,風(fēng)味化合物之間存在相互轉(zhuǎn)化,部分化合物不僅來源于微生物代謝也可能來源于化學(xué)反應(yīng)。

圖7 菌株LBM32026在不同溫度下的揮發(fā)性化合物含量Fig.7 Content of flavor compounds of strain LBM32026 at different temperatures

3 結(jié)論與討論

本研究解析了火山渣芽孢桿菌屬與高溫大曲風(fēng)味化合物的關(guān)聯(lián)程度。研究結(jié)果顯示,Scopulibacillus與大曲中6種風(fēng)味化合物呈顯著正相關(guān)。并以高溫大曲黑曲樣本為篩菌對(duì)象,最終得到一株純種菌株ScopulibacillusdaquiLBM32026。研究其在不同溫度下的生長(zhǎng)特性,發(fā)現(xiàn)菌株在50和60 ℃下生長(zhǎng)較為迅速,在30和40 ℃下生長(zhǎng)速度變慢甚至出現(xiàn)抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象。利用單菌固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析不同溫度下菌株的風(fēng)味代謝情況,共檢測(cè)到揮發(fā)性化合物40種。且在原位體系中與Scopulibacillus顯著正相關(guān)的6種風(fēng)味化合物均被檢測(cè)到。隨著發(fā)酵溫度的升高,菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性化合物整體含量、含氮化合物、酚類、醛類、內(nèi)酯類和酸類化合物含量呈上升趨勢(shì)。綜上,菌株LBM32026能夠耐受較高的發(fā)酵溫度且發(fā)酵風(fēng)味良好。