表面增強拉曼光譜法快速檢測豬肉中左旋咪唑殘留

施思倩，楊方威，姚衛(wèi)蓉，于 航，謝云飛

江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214000

引 言

左旋咪唑(Levamisole)又名左咪唑、左旋四咪哇、驅(qū)蟲速等，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，主要以鹽酸鹽形式存在。左旋咪唑是一種廣譜抗蟲藥，驅(qū)蟲機理主要為抑制蟲體肌肉的琥珀酸脫氫酶的活性與抑制膽堿酯酶的活性，使蟲體能量代謝受阻，肌肉麻痹，達到驅(qū)蟲效果，被廣泛應(yīng)用于抗牛、羊等牲畜體內(nèi)的線蟲。同時左旋咪唑具有特殊的免疫調(diào)節(jié)作用，在動物養(yǎng)殖中常用于抗菌消炎、抗病毒、促生長等方面。當(dāng)左旋咪唑因不合理使用在動物體內(nèi)形成殘留時，隨著食物鏈的蓄積作用，左旋咪唑在人體內(nèi)的濃度也會不斷增加，從而對人體造成危害。目前已有的有關(guān)左旋咪唑的毒副作用報道主要集中在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等毒副作用。

圖1 左旋咪唑化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of levamisole

目前國內(nèi)外報道用于檢測左旋咪唑的方法有電位滴定法、高效液相法、氣相色譜法及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-2]等。其中色譜法是目前檢測左旋咪唑鹽酸鹽的主要方法，該方法具有靈敏度和準(zhǔn)確度較高、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點，但是存在設(shè)備昂貴、前處理復(fù)雜等限制，在實際檢測中使用受到一定的限制。

表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)作為一種新興的光譜分析技術(shù)，近年來在食品、臨床、藥品檢測等領(lǐng)域飛速發(fā)展。SERS分析技術(shù)具有操作簡單、檢測快速、成本低廉的特點，可用于直接檢測硝基呋喃抗生素[3]、喹諾酮類抗生素、β-興奮劑等獸藥。陶進江等[4]通過優(yōu)化金膠合成條件、金膠添加量、活化劑添加量等條件，建立了快速可靠的鴨肉中己烯雌酚殘留SERS檢測方法。Cheng等[5]通過制備聚集再氧化氧化石墨烯/金納米粒子，首次建立了結(jié)合液-液提取凈化的動物尿液中克倫特羅的SERS測定方法，該方法檢測靈敏度高，與傳統(tǒng)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比測量結(jié)果可以100%準(zhǔn)確識別所有陽性和陰性尿樣。Zhao等[6]利用銀鏡反應(yīng)生成水溶性球形環(huán)糊精改性銀納米粒子，將其用于雞肉與鴨肉中馬波沙星含量的檢測，優(yōu)化檢測條件后拉曼信號增強系數(shù)達2.11×107。

但目前未見用SERS法檢測豬肉中左旋咪唑鹽酸鹽殘留的報道。本研究以金溶膠作為SERS增強基底，對左旋咪唑鹽酸鹽的拉曼檢測條件與豬肉中提取條件進行摸索與優(yōu)化，建立了一種液液萃取法提取豬肉中左旋咪唑鹽酸鹽殘留后進行SERS檢測的快速檢測方法。

1 實驗部分

1.1 試劑

左旋咪唑鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%)，檸檬酸三鈉鹽二水合物(純度99.0%)，均購于上海百靈威試劑公司； 氯金酸鉀(純度97.0%)購于南京森貝伽生物科技有限公司； 甲醇(色譜純)，正己烷(色譜純)，無水硫酸鈉(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，三氯甲烷(分析純)，鹽酸(分析純)，硝酸(分析純)，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司； 超純水。豬肉，購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

王水： 取一體積濃硝酸慢慢倒入至三體積濃鹽酸中, 不斷用玻棒攪拌混勻，冷卻。用于浸泡制備金膠的圓底燒瓶。

左旋咪唑鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液： 精確稱取0.10 g的左旋咪唑鹽酸鹽粉末溶于100 mL的甲醇中，制得濃度為1 000 mg·L-1的左旋咪唑鹽酸鹽母液。用甲醇稀釋左旋咪唑鹽酸鹽甲醇母液制得不同濃度的左旋咪唑鹽酸鹽甲醇稀釋液。

5 mol·L-1的NaOH溶液： 稱取20.0 g NaOH固體，溶于100 mL水，混勻。

1.2 設(shè)備

ME204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司； ZNCL-GS磁力加熱油浴鍋，上海越眾儀器設(shè)備有限公司； 可調(diào)試移液器，美國Thermo Labsystems公司； Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司； GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； BCD-602W冰箱，青島海爾股份有限公司； PS-10超聲波清洗器，東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司； RamTracer-200-HS便攜式拉曼光譜儀，美國歐普圖斯； ZGDCY-24干式氮吹儀，上海梓桂儀器有限公司； TGL-16M臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司； WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 金溶膠制備

本方法中使用金溶膠作為SERS增強基底，通過改進后的經(jīng)典的檸檬酸三鈉還原氯金酸鉀法制得。具體操作為： 在事先泡過王水并洗凈烘干的圓底燒瓶中加入47 mL超純水與3 mL 10 mg·mL-1氯金酸鉀，充分混合，放入預(yù)熱好的120 ℃油浴鍋內(nèi)，磁力攪拌器以565 r·min-1攪拌并保持溫度恒定至溶液沸騰； 加入2 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)在120 ℃下恒溫攪拌20 min，得紫紅色的金納米溶膠，冷卻至常溫，4 ℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理

稱取2.5 g已攪碎的豬肉放入50 mL離心管中，依次加入5 g無水硫酸鈉、4 mL 10 mol·L-1的NaOH溶液、10 mL萃取劑，渦旋混勻。4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min，取上層有機層。重復(fù)萃取兩次豬肉組織并合并萃取液，一組氮吹干后水復(fù)溶，待測(一次液液萃取)。另一組加入2.5 mL 0.5 mol·L-1的HCl進行反萃取，混勻后4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min，取水層待測(二次液液萃取)。

1.5 拉曼檢測條件

儀器參數(shù)為： 激光光源波長785 nm，激光功率250 mW，掃描時間20 s，掃描次數(shù)3次。在包有錫紙的載玻片上依次滴加一定體積的金膠和待測液，混合均勻后立即進行掃描。每個樣品掃描9次取平均值。

1.6 理論光譜計算

先使用Gaussview 5.0軟件畫出左旋咪唑鹽酸鹽分子結(jié)構(gòu)式，得到Gaussian Input Files，然后通過兩步法進行理論光譜計算： (1)通過Optimation功能對左旋咪唑鹽酸鹽分子結(jié)構(gòu)式進行優(yōu)化，得到最佳分子空間結(jié)構(gòu)： (2)以優(yōu)化后分子結(jié)構(gòu)式作為Gaussian Input Files，通過Frequency功能B3LYP/6-311+G(d)基組水平對左旋咪唑鹽酸鹽分子進行光譜計算，該計算基組的校正因子為0.968 0。計算結(jié)束后得到Gaussian Output Files，其中含有優(yōu)化后的左旋咪唑鹽酸鹽分子結(jié)構(gòu)示意圖與理論計算拉曼光譜數(shù)據(jù)。通過比較理論計算光譜與固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拉曼光譜、標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS光譜，并結(jié)合參考文獻，對分子特征峰進行指認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理論計算

左旋咪唑鹽酸鹽在Gaussian計算中的結(jié)構(gòu)優(yōu)化圖如圖2(a)所示，由優(yōu)化后得到的分子結(jié)構(gòu)圖可知HCl分子的位置與苯環(huán)較接近，計算得到的理論光譜中主要的振動模式為苯環(huán)變形振動、苯環(huán)與HCl分子間的相互作用。由圖2(b)可看出矯正后固體拉曼光譜圖與理論計算拉曼光譜圖基本一致。如苯環(huán)的C—H面外彎曲振動在理論光譜中位于801 cm-1，固體光譜中位于810 cm-1，咪唑環(huán)中的N—H面內(nèi)彎曲振動在理論光譜中位于1 177 cm-1，固體光譜中位于1 187 cm-1。波數(shù)差在可接受范圍內(nèi)。

圖2 左旋咪唑鹽酸鹽理論計算結(jié)果(a)： 優(yōu)化后左旋咪唑鹽酸鹽分子結(jié)構(gòu)式；(b)： 理論計算拉曼光譜與固體拉曼光譜比較圖Fig.2 Theoretical calculation results of levamisole hydrochloride(a)： Optimize molecular structural formula of levamisole hydrochloride； (b)： Comparison between theoretical Raman spectra and solid Raman spectra

部分特征峰的出峰情況存在一定的差異，如固體光譜中469 cm-1處為雙峰，而理論光譜中對應(yīng)位置為單峰； 理論光譜中C—H面外彎曲在887 cm-1位置出峰，而固體中相應(yīng)位置并未出峰。這可能與物質(zhì)所處的狀態(tài)不同有關(guān)，理論計算中設(shè)定物質(zhì)為真空環(huán)境，而實驗光譜中左旋咪唑鹽酸鹽以粉末存在，有分子間作用力影響。

2.2 檢測條件優(yōu)化

對金膠與樣品溶液體積比與拉曼積分時間進行優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。隨著金膠體積的增加，特征峰的拉曼峰強先增加后減小。分析原因為金膠體積較少時混合體系中金納米粒子數(shù)少于目標(biāo)物質(zhì)分子數(shù)，增強效果欠佳； 當(dāng)金膠體積增加至一定值時，金納米粒子數(shù)與目標(biāo)物質(zhì)分子數(shù)相當(dāng)，增強效果最佳； 當(dāng)金膠體積進一步增加時，多余的金納米粒子又會阻礙金膠與目標(biāo)分子的結(jié)合，影響“熱點”的生成，導(dǎo)致增強效果下降。因此后續(xù)選擇樣品溶液∶金膠體積=1∶2為最佳體積比。改變積分時間，特征峰的拉曼峰強先增加后保持不變，分析原因為金膠與樣品混合后金納米粒子與目標(biāo)物完全結(jié)合需要一定的時間，然后體系達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此后續(xù)選擇20 s為最佳積分時間。

圖3 不同檢測條件下469 cm-1處特征峰SERS峰強情況Fig.3 SERS peak intensity at 469 cm-1 under different detection conditions

2.3 定性與定量分析

分子的拉曼振動頻率取決于分子的結(jié)構(gòu)式，對分子的拉曼特征振動模式進行歸屬，可以為SERS檢測結(jié)果的定性與定量提供理論依據(jù)。將固體光譜、高斯計算光譜、甲醇溶劑光譜與左旋咪唑鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液中的光譜進行比較，發(fā)現(xiàn)469，627和969 cm-1這3個位置的峰在固體、溶液與計算光譜中均有出峰且峰響應(yīng)值較高，即可將這3個峰作為左旋咪唑鹽酸鹽SERS檢測中用于定性和定量檢測的特征峰。根據(jù)拉曼位移與分子的振動模式對這3個特征峰進行歸屬，469 cm-1為C—S鍵伸縮振動，627 cm-1為苯環(huán)C—C彎曲變形振動，969 cm-1為咪唑環(huán)面內(nèi)彎曲和側(cè)鏈骨架振動[7]。

在最佳實驗條件下，對SERS檢測左旋咪唑鹽酸鹽的最低濃度進行探究。分別對0.01～500 mg·L-1的左旋咪唑鹽酸鹽甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進行拉曼測試，發(fā)現(xiàn)當(dāng)左旋咪唑鹽酸鹽濃度低至0.1 mg·L-1時，469，627和969 cm-1這3個特征峰仍能檢測到明顯的拉曼信號，當(dāng)濃度降低至0.01 mg·L-1時無明顯出峰，即SERS檢測左旋咪唑鹽酸鹽的檢測限可達0.1 mg·L-1。

圖4 左旋咪唑鹽酸鹽不同濃度甲醇溶液SERS光譜a—j分別為固體，甲醇，0.01，0.1，1，10，75，100，250, 500 mg·L-1溶液Fig.4 SERS spectra of levamisole hydrochloride in methanol solution with different concentrationsa—j, solid, methanol, 0.01, 0.1, 1, 10, 75, 100, 250, 500 mg·L-1 solution respectively

探究469，627和969 cm-1這3個特征峰的SERS強度與左旋咪唑鹽酸鹽濃度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)特征峰的SERS強度與濃度的對數(shù)值存在一定的線性關(guān)系，線性擬合結(jié)果如圖5所示，擬合方程R2值均在0.9以上。

圖5 峰強與濃度線性關(guān)系圖Fig.5 Linear relationship between peak intensity and concentration

2.4 檢測提取方法的優(yōu)化

由于豬肉中基質(zhì)復(fù)雜，用有機試劑對目標(biāo)物進行提取時其中含有的蛋白質(zhì)與脂肪也容易被提取，檢測時會對拉曼檢測結(jié)果的靈敏度造成影響。而左旋咪唑鹽酸鹽在堿性條件下具有一定的質(zhì)子化傾向，電離受到抑制，轉(zhuǎn)化為左旋咪唑，易溶于鹵代烷、醚、酯類等弱極性有機溶劑，酸性條件下轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽易溶于水而在有機試劑中的溶解度小。為了提高目標(biāo)物質(zhì)的提取效率、減少雜質(zhì)干擾，本研究比較了一次液液萃取與二次液液萃取的提取效果(加標(biāo)濃度為100 μg·kg-1)。

結(jié)果顯示經(jīng)正己烷提取后直接氮吹用水復(fù)溶得到的加標(biāo)提取液中，目標(biāo)物質(zhì)特征峰SERS強度較強，而經(jīng)過二次液液萃取后得到的加標(biāo)提取液中基質(zhì)干擾無明顯減少，但目標(biāo)物質(zhì)特征峰SERS強度降低，說明一次液液提取的提取效率與去除雜質(zhì)干擾的效果較好，相比較而言二次提取并沒有明顯減少雜質(zhì)干擾，對目標(biāo)物的提取效果也較差。因此選擇操作簡單效果較好的一次液液萃取作為樣品提取方法。

圖6 不同萃取方法提取效果比較a： 固體； b: 一次液液萃取空白; c: 一次液液萃取加標(biāo); d: 二次液液萃取空白; e: 二次液液萃取加標(biāo)Fig.6 Comparison of extraction effects of different extraction methodsa: Solid; b: Once liquid-liquid extraction blank; c: Once liquid-liquid extraction standard addition； d: Twice liquid-liquid extraction blank； e: Twice liquid-liquid extraction standard addition

圖7 不同萃取溶劑提取效果比較a: 固體; b: 三氯甲烷提空白; c: 乙酸乙酯提空白; d: 正己烷提空白; e: 三氯甲烷提加標(biāo); f: 乙酸乙酯提加標(biāo); g: 正己烷提加標(biāo)Fig.7 Comparison of extraction effects of different extraction solventsa: Solid; b: Ethyl acetate blank; c: n-hexane blank; d: Chloroform blank; e: Ethyl acetate extraction; f: n-hexane extraction； g: Chloroform extraction

比較液液萃取中乙酸乙酯、正己烷和三氯甲烷3種常見有機萃取劑的萃取效果，發(fā)現(xiàn)用正己烷提取時，空白基質(zhì)提取液中干擾峰較少，加標(biāo)提取液中目標(biāo)物質(zhì)的特征峰SERS強度較強，因此選擇正己烷為樣品提取溶劑。

2.5 檢測回收率的確定

為了考察SERS技術(shù)檢測豬肉提取液中左旋咪唑鹽酸鹽殘留量的可靠性，利用所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程，對不同加標(biāo)濃度左旋咪唑鹽酸鹽樣本進行預(yù)測。選擇0.5，1和10 μg·kg-1為加標(biāo)濃度進行加標(biāo)實驗，結(jié)果得到預(yù)測樣本中左旋咪唑鹽酸鹽的平均加標(biāo)回收率為80.39%～95.94%，RSD值為3.08%～6.20%，說明采用該方法檢測豬肉中左旋咪唑鹽酸鹽殘留量準(zhǔn)確有效，可以實現(xiàn)豬肉中左旋咪唑鹽酸鹽殘留的快速檢測。

3 結(jié) 論

對豬肉中左旋咪唑鹽酸鹽殘留量的SERS檢測方法進行研究，通過改變金膠與樣品的體積比和積分時間優(yōu)化拉曼檢測條件，通過比較不同萃取方法與萃取溶劑的提取效果，確定了正己烷一次液液萃取的提取方法。在最佳檢測條件下，在左旋咪唑鹽酸鹽特征峰SERS 強度與濃度對數(shù)值(0.1～25 mg·L-1)之間建立了良好的線性關(guān)系，線性方程R2值均在0.9以上。對樣品進行加標(biāo)實驗，平均回收率為80.39%～95.94%，RSD值為3.08%～6.20%。說明用SERS方法檢測禽畜肉中左旋咪唑鹽酸鹽殘留量操作簡單，可滿足現(xiàn)場快速檢測的需求，這對于將SERS快速檢測方法用于畜牧業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)中左旋咪唑獸藥的使用與殘留量監(jiān)控具有重要意義。