外周血中核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2對子宮內(nèi)膜癌的診斷效能及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

丁永梅,周福平,劉國芳

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療科,上海 201805

子宮內(nèi)膜癌(EC)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤疾病,占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%,且近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。現(xiàn)階段,EC多為低惡性程度病變,其整體預(yù)后趨于良好,但若病理高度惡性且診斷不及時(shí),5年生存率僅為20%～63%[2]。因此尋找用于診斷EC臨床預(yù)后和預(yù)測指標(biāo)以實(shí)現(xiàn)EC的早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療是臨床密切關(guān)注的問題。目前,在臨床工作中腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合影像學(xué)檢查在EC和子宮良性病變輔助診斷中扮演著重要角色,且能為手術(shù)切除淋巴結(jié)提供依據(jù)[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與抗氧化應(yīng)激機(jī)制關(guān)系密切,核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)及其信號通路參與了腫瘤的形成與發(fā)展,同時(shí)結(jié)合核酸序列上含有一段抗氧化反應(yīng)元件(ARE)序列,可激活基因或其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),對癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移具有重要作用[4-5]。現(xiàn)階段對Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)在EC中的表達(dá)和生物學(xué)作用價(jià)值尚不明確,這兩種因子是否存在類似特性也缺少相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?；诖?本研究利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定了80例EC患者外周血中Nrf2、HO-1的表達(dá)情況,收集其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)數(shù)據(jù),以期為臨床實(shí)踐提供參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2022年5月本院收治的EC患者80例作為EC組。年齡32～75歲,平均(48.76±5.73)歲;國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)病理分期[6]:Ⅰ期41例,Ⅱ期26例,Ⅲ期8例,Ⅳ期5例;病理類型:透明細(xì)胞癌6例,腺鱗癌8例,漿液性乳頭狀癌9例,子宮內(nèi)膜樣腺癌57例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例,非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)方法確診為EC;(2)術(shù)前未伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙;(3)出現(xiàn)子宮不規(guī)則出血、陰道異常排液等;(4)術(shù)前未進(jìn)行新輔助化療或放療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有其他惡性腫瘤疾病,如肺癌、乳腺癌、胰腺癌等;(2)伴有其他婦科嚴(yán)重疾病;(3)入選前半年內(nèi)有免疫調(diào)節(jié)劑用藥史;(4)有精神疾病史,存在溝通障礙;(5)伴有其他肝臟、腎臟等嚴(yán)重疾病。另選取同期于本院就診的50例子宮良性病變患者作為子宮良性病變組,年齡33～74歲,平均(48.82±5.80)歲;疾病類型:子宮內(nèi)膜息肉14例,輕中度子宮內(nèi)膜不典型增生25例,更年期功能失調(diào)性子宮出血者11例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)確診為子宮良性疾病;(2)有其他內(nèi)分泌或腫瘤疾病史;(3)未伴有糖尿病、高血壓等;(4)未存在嚴(yán)重心、肝、腎功能不全。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有其他惡性腫瘤疾病,如肺癌、乳腺癌、胰腺癌等;(2)伴有其他婦科嚴(yán)重疾病;(3)入選前半年內(nèi)有免疫調(diào)節(jié)劑用藥史;(4)伴有精神疾病史,存在溝通障礙。同時(shí)納入體檢中心50例無生殖系統(tǒng)疾病的健康女性作為對照組,其常規(guī)檢查、血清生化檢查、影像學(xué)檢查結(jié)果均正常,年齡34～76歲,平均(48.58±5.69)歲。3組年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平檢測 采集3組宮頸檢查當(dāng)日清晨空腹外周靜脈血2～4 mL置于2支培養(yǎng)瓶中,血液標(biāo)本于室溫環(huán)境中保存20 min,以100 μL乙二胺四乙酸(購自碧云天生物技術(shù)公司)抗凝,加入紅細(xì)胞裂解液 200 μL,收集上清液作為細(xì)胞裂解液。2支培養(yǎng)瓶內(nèi)均加入5 μL脂多糖進(jìn)行誘導(dǎo),2 h后再分別于2支培養(yǎng)瓶中加入5 mL Nrf2、HO-1阻斷劑(購自北京索萊寶科技有限公司)進(jìn)行阻斷,24 h后采用Trizol法提取總RNA。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作,完成反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,然后采用熒光定量PCR檢測Nrf2、HO-1 mRNA水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。Nrf2、HO-1的引物序列見表1。均經(jīng)30次循環(huán)后收集目的基因mRNA進(jìn)行檢測。

表1 引物序列

1.2.2血清糖類抗原125(CA125)、人附睪蛋白4(HE4)水平檢測 采集3組宮頸檢查當(dāng)日清晨空腹外周靜脈血5 mL,血液標(biāo)本于室溫環(huán)境下保存20 min,以0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝,低速離心后留取上層血清,存于低溫環(huán)境中備用。采用ELISA測定血清CA125、HE4水平,所有試劑盒均購自于英國Abcam公司。正常參考范圍:CA125為0～35 U/mL,HE4為0～140 pmol/L。

2 結(jié) 果

2.13組血清CA125、HE4水平與外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較 EC組血清CA125、HE4水平均高于子宮良性病變組與對照組,且子宮良性病變組均高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);EC組外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平均低于子宮良性病變組與對照組,且子宮良性病變組均低于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清CA125、HE4水平與外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2血清CA125、HE4水平與外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平與血清CA125、HE4水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),血清CA125水平與HE4水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血清CA125、HE4水平與外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

2.3不同病理分期EC患者血清CA125、HE4水平與外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較 EC組患者血清CA125、HE4水平隨FIGO病理分期增加均呈升高趨勢,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EC組患者外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平隨FIGO病理分期增加均呈降低趨勢,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同病理分期EC患者血清CA125、HE4水平與外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.4外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平對EC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能 外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平預(yù)測EC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.695、0.667,當(dāng)兩項(xiàng)聯(lián)合診斷時(shí)AUC、靈敏度最高分別為0.839、81.01%,均高于單獨(dú)指標(biāo)診斷價(jià)值,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖1。

圖1 外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平預(yù)測EC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表5 外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平對EC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能

3 討 論

EC早期規(guī)范化診療可明顯提高術(shù)后5年生存率,有研究表明,大約10%的EC患者被臨床診斷為早期EC,但對手術(shù)病理樣本進(jìn)行判斷卻發(fā)現(xiàn)病灶內(nèi)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,因此這10%的EC患者存在一定概率無法得到早期綜合診療,進(jìn)而導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良[7]。因此術(shù)前診斷的準(zhǔn)確性對指導(dǎo)臨床制訂干預(yù)方案具有重要價(jià)值?，F(xiàn)階段EC診斷方法主要為組織學(xué)病理檢測、影像學(xué)檢查和血清標(biāo)志物檢測,其中病理檢測為診斷金標(biāo)準(zhǔn),但為有創(chuàng)性操作,盲刮存在遺漏病灶的風(fēng)險(xiǎn),且病理診斷的準(zhǔn)確性受醫(yī)生能力限制,同時(shí)術(shù)前影像學(xué)檢查對淋巴結(jié)診斷的效能整體偏低[8]。血清腫瘤標(biāo)志物在腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估中應(yīng)用廣泛,CA125作為EC血清標(biāo)志物用于臨床多年,但CA125水平在其他良、惡性疾病中也會升高,造成其在EC預(yù)判方面存在較大誤差,因此將CA125單獨(dú)作為EC的篩查指標(biāo)仍存在不足[3,9]。近年來,不斷有研究證實(shí)CA125和HE4聯(lián)合應(yīng)用在EC的診斷方面具有較大潛力,可提高單用CA125所造成的低靈敏度及特異度,同時(shí)呈現(xiàn)其與腫瘤級別、浸潤深度、宮外轉(zhuǎn)移等預(yù)后方面的緊密聯(lián)系[10-11]。本研究結(jié)果顯示,EC組血清CA125、HE4水平均高于子宮良性病變組與對照組,且子宮良性病變組血清CA125、HE4水平均高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),血清CA125水平與HE4水平呈正相關(guān)(P<0.05)。血清CA125、HE4水平隨FIGO病理分期增加均呈升高趨勢,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明血清CA125和HE4水平對EC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測作用。

近年來,隨著對抗氧化系統(tǒng)研究的深入發(fā)現(xiàn),肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為與氧化應(yīng)激密切相關(guān),可能是氧化應(yīng)激環(huán)境促進(jìn)了腫瘤的血管生成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。但上述觀點(diǎn)停留在研究氧化應(yīng)激在促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞癌變的相關(guān)領(lǐng)域,對已發(fā)展至EC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷中的應(yīng)用卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道,其具體分子機(jī)制仍尚未明確。Nrf2/ARE信號通路是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要保護(hù)通路,其中Nrf2與多種疾病尤其是癌癥的發(fā)生與治療密切相關(guān),正常情況下Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)的DC結(jié)構(gòu)域相互作用,同時(shí)被捆綁于主要由肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架上,與泛素連接酶3形成復(fù)合物使Nrf2多聚泛素化并被26S蛋白酶體降解[13]。受到活性氧等親電試劑刺激后Nrf2從Nrf2/Keap1復(fù)合物中被釋放而變得穩(wěn)定,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),與基因中的Maf蛋白相結(jié)合,形成異二聚體[14]。異二聚體可與ARE啟動子結(jié)合,激活醌氧化還原酶、血紅素氧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等抗氧化靶基因的表達(dá)。HO-1即為上述眾多靶基因中重要因子,其活化在內(nèi)源性抗炎和抗氧化應(yīng)激過程中起基本作用,即能阻止醌類及其衍生物繼續(xù)參與氧化還原反應(yīng),維持氧化還原穩(wěn)態(tài)[15]。由于腫瘤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用,故探究Nrf2/ARE的第一信號途徑亦具有重要價(jià)值[16-18]。本研究結(jié)果顯示,EC組外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平均低于子宮良性病變組與對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平與血清CA125、HE4水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),提示Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)異?？蔀檩o助判斷EC的發(fā)生、發(fā)展提供一定參考依據(jù)?，F(xiàn)階段研究表明,下調(diào)Nrf2及其下游基因的表達(dá)能明顯降低EC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,同時(shí)高表達(dá)的Nrf2蛋白和腫瘤細(xì)胞的高耐藥性有關(guān),抑制其表達(dá)能提高腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性[19]。Nrf2/ARE的第一信號途徑在EC患者中的異常表達(dá)已被明確,但其在EC患者外周血中含量的研究及對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指向性則涉及不多。本研究結(jié)果顯示,EC組外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平隨FIGO病理分期增加均呈降低趨勢,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平可對EC的精確診斷做出判斷,在EC中扮演著抑癌基因的角色,并在各FIGO病理分期均能顯示出差異。

本研究同時(shí)采用ROC曲線對EC患者外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測中的價(jià)值,結(jié)果顯示,兩項(xiàng)聯(lián)合診斷時(shí)AUC、靈敏度最高,分別為0.839、81.01%,均高于單獨(dú)指標(biāo)診斷價(jià)值,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？赡苁荖rf2作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要前端調(diào)節(jié)樞紐,能在一定程度上表現(xiàn)出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生前的腫瘤微環(huán)境,而HO-1作為Nrf2/Keap1信號途徑下游調(diào)控的抗氧化酶基因,一般在受到氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷后上調(diào),能顯示細(xì)胞存活及細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài),由此可見Nrf2、HO-1 mRNA能從不同維度參與EC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,具有一定的協(xié)同作用,能共同提高預(yù)測的效能。

綜上所述,檢測外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平可診斷EC,且Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平在FIGOL病理分期中存在差異,能夠?yàn)榕袛嗄[瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及制定治療方案提供參考依據(jù)。但本研究仍存在如樣本量少、結(jié)果有一定偏倚等局限,后續(xù)研究應(yīng)逐步提高樣本量并重視對分組例數(shù)的控制,且關(guān)于外周血Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平聯(lián)合檢測預(yù)測EC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的最佳截?cái)嘀颠€有待進(jìn)一步探索。