甘肅省武威市肉牛牛病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查

楊彩虹，趙詠中，漆晶晶，靳 新，李曉雪，李興榮

（ 武威市畜牧獸醫(yī)總站，甘肅 武威 733000 ）

牛病毒性腹瀉/黏膜?。╞ovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的一種接觸性傳染病，根據(jù)臨床癥狀不同分為臨床急性感染癥狀（稱為牛病毒性腹瀉，BVD）、臨床持續(xù)性感染、臨床慢性感染癥狀（稱為黏膜病，MD）[1]。牛是BVDV主要的易感動物，豬、綿羊、山羊、駱駝等也是易感動物，可通過水平和垂直方式進行傳播。BVD/MD最早由Olafson等[2]在美國紐約發(fā)現(xiàn)，隨后在多個國家和地區(qū)廣泛傳播。在我國，自李佑民等[3]在吉林發(fā)現(xiàn)并分離到第一株BVDV以來，全國各地相繼報道了BVDV的感染和流行情況[4-6]。Ran等[7]、Deng等[8]研究結(jié)果顯示，我國北方奶牛群BVDV 平均抗體陽性率為72.2%，東部地區(qū)牛群BVDV平均抗原陽性率為41.19%，BVDV感染形勢嚴峻。感染BVDV 后引起的免疫抑制、繁殖障礙、持續(xù)性感染及其他病原體的混合感染，可使犢牛死亡率和淘汰率增加3%以上、青年牛死亡率達20%以上，阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展并造成重大經(jīng)濟損失[9-12]。

據(jù)世界各國防控BVDV 的經(jīng)驗[13-14]，開展流行病學(xué)調(diào)查是BVDV 防控與凈化的前提。為調(diào)查當前BVDV 在武威市肉牛群體的感染情況，本研究從武威市各縣區(qū)（民勤縣、古浪縣、天?？h、涼州區(qū)）、不同養(yǎng)殖類型（散養(yǎng)、規(guī)?；⒉煌L階段（犢牛、青年牛、成母牛）的牛群中采集血樣512 份，利用商品化試劑盒對采集的樣品進行BVDV抗體檢測；并從各縣區(qū)采集具有腹瀉癥狀的肉牛新鮮糞便425 份，利用RT-PCR 方法進行病原檢測。通過檢測結(jié)果掌握BVDV感染和流行現(xiàn)狀，以期為武威市肉牛BVDV的防控和凈化工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

血液樣品：2022 年2 月至2023 年4 月，采集自武威市各縣區(qū)未經(jīng)BVD 疫苗免疫的不同年齡段肉牛血液樣品512 份，其中涼州區(qū)125 份、古浪縣128 份、民勤縣132 份、天?？h127份，具體采樣信息見表1。

表1 血液樣品采集信息Tab.1 Blood sample collection information

糞便樣品：2022 年2 月至2023 年4 月，采集武威市各縣區(qū)未經(jīng)免疫的規(guī)模場具有腹瀉癥狀肉牛新鮮糞便425 份，其中涼州區(qū)120 份、古浪縣103 份、民勤縣105 份、天祝縣97份，具體采樣信息見表2。

表2 糞便樣品采集信息Tab.2 Fecal samples collection information

1.2 試劑與儀器

BVDV Ab99-44000 牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒（IDEXX公司）、RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）公司）、一步反應(yīng)RT-PCR試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）?？鼓裳?、恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀、PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)、高速離心機等。

1.3 試驗方法

1.3.1 BVDV血清抗體檢測

血液樣品經(jīng)37 ℃恒溫箱靜置30 min 后放入4 ℃冰箱，待血清析出后吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，采用商品化的牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑進行BVDV抗體檢測，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。

BVDV 抗體檢測結(jié)果判定：S/P=（樣品OD450nm值-陰性平均OD450nm值）/（陽性平均OD450nm值-陰性平均OD450nm值）；若NC-x≤0.25，S/P≥0.3 判定為陽性（+），0.2≤S/P＜0.3判定為可疑（±），S/P＜0.20判定為陰性（-）。

1.3.2 BVDV病原RT-PCR檢測

糞便樣品中加入6～7 mL PBS 振蕩搖勻，12 000 r/min離心10 min取上清置于-20 ℃冰箱保存，按照RNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組RNA，對其進行一步法RTPCR擴增。

根據(jù)GenBank上登錄的BVDV基因組序列，選擇基因組中高度保守的5'-UTR 區(qū)域設(shè)計1 對特異性引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，目的片段大小為297 bp，引物信息見表3。

表3 引物信息Tab.3 Primer information

擴增體系（20 μL）：ddH2O 5.5 μL、2×Buffer 10 μL、酶0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 3.0 μL。

擴增程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察并記錄擴增結(jié)果，統(tǒng)計BVDV病原陽性率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)錄入Excel軟件進行匯總整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV抗體檢測結(jié)果

2.1.1 不同地區(qū)肉牛BVDV血清抗體檢測結(jié)果（見表4）

表4 不同地區(qū)肉牛BVDV血清抗體檢測結(jié)果Tab.4 Detection results of BVDV serum antibody in beef cattle from different regions

由表4可知，武威市肉牛血清共檢出陽性樣品308份，抗體總陽性率為60.16%（308/512），其中涼州區(qū)樣品陽性率最高為71.20%（89/125），天祝縣樣品陽性率最低為44.88%（57/127）。

2.1.2 不同年齡段肉牛BVDV血清抗體檢測結(jié)果(見表5)

表5 不同年齡段肉牛BVDV血清抗體檢測結(jié)果Tab.5 Detection results of BVDV serum antibody in beef cattle of different ages

由表5 可知，不同年齡段牛群均有BVDV 感染，青年牛和成年母牛BVDV抗體陽性率相差不大，犢?？贵w陽性率最低為26.47%（111/158），成母?？贵w陽性率最高為74.45%（142/184）。

2.1.3 不同養(yǎng)殖模式下肉牛BVDV 血清抗體檢測結(jié)果（見表6）

表6 不同養(yǎng)殖模式下肉牛BVDV血清抗體檢測結(jié)果Tab.6 Detection results of BVDV serum antibody in beef cattle under different breeding modes

由表6 可知，武威市各縣區(qū)規(guī)模場和散養(yǎng)戶肉牛BVDV 血清抗體陽性率相差不大，規(guī)模場為57.06%（225/375），散養(yǎng)戶為55.47%（83/137）。

2.2 BVDV病原檢測結(jié)果（見圖1、表7）

圖1 部分樣品RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of RT-PCR amplification of some samples

表7 不同地區(qū)肉牛糞便BVDV病原檢測結(jié)果Tab.7 Detection results of BVDV pathogen in beef cattle feces from different regions

采用RT-PCR方法對采集到的具有腹瀉癥狀的425份新鮮肉牛糞便樣品進行病原檢測，部分樣品RT-PCR擴增結(jié)果見圖1。

由表7 可知，武威市不同縣區(qū)規(guī)模場肉牛群均存在BVDV的感染，病原總陽性率為7.76%（33/425），各縣區(qū)感染情況存在差異，其中天祝縣糞便樣品病原陽性率最低為2.06%（2/97），涼州區(qū)最高為15.83%（19/120）。

3 討論

近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展及交易運輸，BVD 的發(fā)生與傳播隨之增加，如Deng 等[15]對全國范圍內(nèi)的奶牛進行流行病學(xué)調(diào)查顯示抗體陽性率高達89.49%，抗原陽性率高達32.06%，感染情況較為嚴重。當前，BVD已成為危害養(yǎng)牛業(yè)的主要傳染病之一，該病的防控和凈化工作迫在眉睫[16]。

本研究中，武威市各縣區(qū)肉牛BVDV抗體總陽性率為60.16%，病原總陽性率為7.76%?？贵w總陽性率水平高于2016 年李勇生等[17]對甘肅省部分地區(qū)進行調(diào)查得到的56.36%，以及陳穎彬等[18]、高亞桃等[19]對河北及周邊地區(qū)BVDV 流行病學(xué)調(diào)查的40.5%；抗體總陽性率水平低于張忠輝等[20]在青海地區(qū)調(diào)查的82.3%以及劉澤余等[21]吉林地區(qū)牧場調(diào)查的77.1%。病原陽性率高于山東地區(qū)的0.49%[22]、寧夏地區(qū)2.71%[23]和河南地區(qū)的1.77%[24]；與四川、西藏高原地區(qū)19.46%[25]、吉林地區(qū)23.40%[21]、寧夏銀川地區(qū)17.24%[26]部分牧場BVDV病原陽性率相比較偏低。因此，在國內(nèi)不同地區(qū)，BVDV 感染因地域、調(diào)運、防控措施等不同而存在差異，但均處于較高水平。

從不同年齡段肉牛感染BVDV 情況來看，成年母牛（74.45%）和青年牛（68.35%）的抗體陽性率高于犢牛（26.47%）。與李天增等[5]對全國98 家規(guī)模牛場BVDV 抗體陽性率調(diào)查結(jié)果相比，犢牛群（30.16%～47.87%）偏低，青年牛群（51.35%～73.02%）基本保持一致。呈現(xiàn)犢牛群BVDV 抗體陽性率較低，一方面與4～6 月齡犢牛獲得的母源抗體自然消退有關(guān)；另一方面可能是部分母牛在妊娠早期（30～125 d）感染了BVDV，所產(chǎn)犢牛屬于持續(xù)性感染牛（persistent infection，PI），對BVDV產(chǎn)生免疫抑制。從養(yǎng)殖模式來看，規(guī)模場BVDV 抗體陽性率略高于散養(yǎng)戶，可見BVD 的防控無論是在規(guī)模場還是散養(yǎng)戶均應(yīng)引起足夠重視。

武威市涼州區(qū)BVDV 感染病原、抗體陽性率均為最高，天?？h最低。其中涼州區(qū)BVDV 感染病原陽性率（15.83%）與王衡等[27]2019年所做調(diào)查得出的19.77%相比有所下降。通常情況下不同采樣方法、采樣時間及牧場選擇均會引起調(diào)查結(jié)果不一致；也有可能隨著農(nóng)場主對BVD認知程度增加，疫病防控措施及時跟進，使BVDV 感染率有所下降。此外，研究顯示，牛群感染BVDV 后短時間內(nèi)不會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，疾病的發(fā)展進程同樣會導(dǎo)致調(diào)查結(jié)果差異。盡管如此，本調(diào)查結(jié)果顯示，武威市內(nèi)以涼州區(qū)BVDV的感染形勢最為嚴峻，需要及時開展BVD防控和種群凈化工作。

4 結(jié)論

本調(diào)查結(jié)果顯示，武威市各縣區(qū)的肉牛群普遍存在BVDV 感染，已對養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成潛在威脅，各級部門應(yīng)高度重視BVD防控和凈化工作，堅持自繁自養(yǎng)，加強疫苗免疫，持續(xù)篩查并淘汰PI牛，逐步達到凈化的目的。