新疆昌吉市2 型豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

陳 旺，王 元，劉英玉*，劉俊飛，王雅雯，田亞琴，宋超慧

（ 1. 新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 昌吉天康畜牧有限公司，新疆 昌吉 831100 ）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcus suis）引起的一種細菌性傳染病，通常引發(fā)豬的肺炎和敗血癥等疾病，是由C、D、E 及L 群鏈球菌引起的一種多型性豬傳染病的總稱，臨床表現(xiàn)分為關節(jié)腫大、淋巴結腫脹、腦膜腦炎及敗血癥等多種類型[1-3]。豬鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，在自然界分布非常廣泛，不僅可以感染豬，還可以引起人、馬、牛、羊等多種動物的感染。豬鏈球菌可分為35 個血清型（1～34 型和1/2 型），其中1、2、7、9 型在中國比較常見，2 型毒力最強而且流行最廣[4]。常見的豬鏈球菌診斷方法主要有臨床診斷、動物尸體剖檢、病原分離培養(yǎng)及生化鑒定、血清學鑒定、分子水平鑒定等[5]。

2型豬鏈球菌可通過黏膜或傷口等傳播途徑感染人并引發(fā)疾病，是一種重要的人畜共患病原菌[6]。2型鏈球菌病通常呈地方性流行，一年四季均可發(fā)病，但常見于4～11周齡的豬群[7-8]。1998—1999 年中國江蘇省部分地區(qū)和2005年四川省暴發(fā)2型鏈球菌病，對豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。2022年7月，新疆昌吉市某規(guī)?；i場的保育仔豬出現(xiàn)發(fā)熱、關節(jié)腫脹、站立不穩(wěn)、腹部背部皮膚有紫色斑塊等臨床癥狀。本試驗采集了部分病死豬的組織樣品，并進行細菌分離鑒定試驗，分離純化菌株通過進行形態(tài)學觀察、生化反應鑒定、PCR鑒定及血清型分型、藥敏試驗進一步確定病因，以期為盡快確診并指導豬場合理使用藥物進行預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

樣品采集地點為新疆昌吉市某規(guī)?；i場，無菌采集病死豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結等組織器官作為試驗樣品。

1.1.2 主要儀器與試劑

細菌生化管購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 儀、凝膠成像儀購自Bio Rad 公司；生物安全柜購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；全自動核酸提取儀購自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司。

革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；核酸提取試劑盒購自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自美國BD 公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購自美國BD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原的分離培養(yǎng)與純化

嚴格按照無菌要求操作，將病死保育豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結等樣品劃線接種在TSA 平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，察看菌落培養(yǎng)生長情況。挑取2～3株疑似目標菌落進行革蘭氏染色鏡檢觀察，同時劃線接種于TSA瓊脂平板進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗

將菌液分別接種于七葉苷、棉籽糖、甘露糖、尿素、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖等生化鑒定管中以及甘油、6.5% NaCl液體和麥康凱平板上，培養(yǎng)10～12 h觀察生化鑒定結果。

1.2.3 PCR檢測和16S rRNA測序

用核酸提取試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。根據(jù)參考文獻[9]合成豬鏈球菌管家基因谷氨酸脫氫酶（gdh）引物，預擴增目的片段大小為689 bp；按照參考文獻[10]合成豬鏈球菌16S rRNA引物，預擴增目的片段大小為328 bp，引物序列見表1。將陽性PCR 擴增產物送至上海生工測序，將測序結果放在美國生物技術信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫上進行BLAST堿基序列比對，構建系統(tǒng)進化樹。

表1 PCR引物序列信息Tab.1 Primer sequences information for PCR

1.2.4 血清型分型（見表1）

參照文獻[9]合成2型豬鏈球菌莢膜多糖（CPS2J）特異性分型用引物，預擴增片段大小為675 bp。

1.2.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法，檢測該分離菌對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、磺胺嘧啶鈉、青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、氟苯尼考等8 種臨床常用藥物的敏感性。將培養(yǎng)10～12 h生長良好的100 μL 分離菌液涂布于TSA 平板表面，取藥敏紙片貼于TSA平板表面，待完全吸收后，將平板37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測定抑菌圈直徑大小，依據(jù)抑菌環(huán)直徑解釋標準[5,11]判定菌株對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化及染色鏡檢

無菌取病死豬的心、肺、淋巴結等組織器官涂抹在TSA 平板上，37 ℃培養(yǎng)10～12 h后觀察菌落形態(tài)并挑取目標菌落進行革蘭氏染色鏡檢觀察，結果見圖1。

圖1 分離株菌落形態(tài)及鏡檢結果Fig.1 Colony morphology and microscopic examination results of isolated strains

由圖1（a）可知，分離株菌落針尖大小、灰白色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊。

由圖1（b）可知，菌株革蘭氏陽性，有長鏈狀、短鏈狀、單鏈或雙鏈等多種形態(tài)。

2.2 分離株生化反應試驗結果

將純化后的分離株接種于細菌生化反應管內，培養(yǎng)12 h后觀察。結果顯示，分離株可發(fā)酵葡萄糖、棉籽糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露糖、果糖；能夠分解七葉苷，但不能分解尿素；在甘油、6.5% NaCl溶液和麥康凱平板中無法生長。生化鑒定結果與豬鏈球菌的生化特性相符。

2.3 分離株PCR鑒定及測序結果（見圖2、圖3）

圖2 分離株PCR鑒定結果Fig.2 PCR identification results for isolated strains

圖3 系統(tǒng)進化樹構建結果Fig.3 Construction results of phylogenetic tree

由圖2可知，采用細菌16S rRNA基因通用引物和豬鏈球菌管家基因gdh引物對分離株進行PCR擴增，電泳結果顯示擴增出約328 bp和689 bp的目的條帶，與預期目的條帶大小一致。

由圖3 可知，將16S rRNA 擴增產物的測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行BLAST堿基序列比對，結果顯示分離株與豬鏈球菌同源性高達100%，在系統(tǒng)進化樹上與2型豬鏈球菌處于同一分支，確定所分離株為2型豬鏈球菌。

2.4 分離株血清型分型結果（見圖4）

由圖4 可知，使用CPS2J特異性基因引物經PCR 擴增和電泳后，擴增出約675 bp的目的條帶，該菌株為2型豬鏈球菌。

注 ： M為DL2000 Marker；1為2型豬鏈球菌；2為陰性對照。

2.5 分離株藥敏試驗結果（見表2）

表2 分離株藥敏試驗結果Tab.2 Drug sensitivity test results of isolated strain

由表2可知，分離株對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考均敏感，對青霉素中介，對磺胺嘧啶鈉耐藥。

3 討論

豬鏈球菌病是一類非常重要的人畜共患急性傳染病，除了能夠感染人和豬以外，還能夠感染馬、羊、貓、狗、野豬等其他動物[5]。豬鏈球菌的致病性差異非常大，與其不同的血清型有關，只有強毒力的菌株才能夠引起豬肺炎、敗血癥和突然死亡等癥狀，低毒力的菌株多見于豬的呼吸道[12-14]。近些年，隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)蓬勃發(fā)展，豬鏈球菌發(fā)病率也呈升高的趨勢發(fā)展，極大地影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[15]。尤其是在中國湖南、廣東、廣西、江蘇、四川、新疆、上海等地均有2 型豬鏈球菌感染的報道[6,15]。此外，豬鏈球菌作為革蘭氏陽性菌，對各種抗生素藥物的抵抗力不是很強[16-17]。但隨著近年來日常生產過程中抗生素的大量使用，導致豬鏈球菌出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象，進而產生了大量的耐藥菌株，引起臨床用藥效果不明顯、疾病控制難度越來越大等現(xiàn)象。而且，豬鏈球菌的耐藥基因可通過食物鏈傳遞給人類，因此豬場管理者在臨床用藥時應按照交替輪換用藥、聯(lián)合用藥的準則，避免產生大量耐藥菌株[18]。

本研究中，經藥敏試驗表明分離株對8 種臨床常見藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對環(huán)丙沙星、林可霉素、恩諾沙星、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考敏感，對青霉素中介，對磺胺嘧啶鈉耐藥，推測可能與臨床長期使用磺胺類藥物存在較大關系。此藥敏試驗結果與彭凌等[19]、劉澤文等[20]、徐引弟等[21]研究結果不完全相同，說明抗生素在生產過程中的普遍使用造成臨床上菌株的耐藥性差異很大。因此，為了解在豬鏈球菌的防治過程中抗生素的耐藥情況，開展藥敏試驗非常有必要。

4 結論

本研究結果表明，新疆昌吉市某規(guī)?；i養(yǎng)殖場保育仔豬死亡的原因是2型豬鏈球菌感染，建議該豬場可選擇環(huán)丙沙星、林可霉素、恩諾沙星等藥物進行治療與防控。