胃復(fù)方調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖及血管生成機(jī)制研究

孫蕊，李東芳

湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410006

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，作為世界第五大癌癥，全球每年有超過1 萬人新診斷出胃癌，盡管在過去5 年中全球發(fā)病率和死亡率有所下降，但胃癌仍然是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其高發(fā)病率和高死亡率儼然成為威脅人類健康的重要因素[1]。胃癌的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療以手術(shù)為首選，多以根治性或姑息性手術(shù)為主，并結(jié)合輔助化療以及放療、靶向藥物治療和免疫治療[2]。部分患者即使在行手術(shù)治療后，也有較大概率復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，治療效果并不理想，因此防治復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，穩(wěn)定病情就顯得尤為重要[3]。中醫(yī)藥作為重要的輔助手段在增加患者對藥物的敏感性、緩解臨床癥狀、增效減毒、穩(wěn)定腫瘤、延長生存期等方面療效顯著[4]，近些年在臨床中逐漸被認(rèn)可。

胃復(fù)方是黎月恒教授臨床多年總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，對治療胃癌具有較好的臨床療效。課題組前期臨床研究[5-8]佐證了胃復(fù)方改善患者生活質(zhì)量及減輕藥物毒副反應(yīng)的效果，而基礎(chǔ)研究[9-12]進(jìn)一步探索了胃復(fù)方抗胃癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。課題組前期生物信息分析，核心靶點(diǎn)追溯胃復(fù)方發(fā)揮作用較大的成分分別為槲皮素（Quercetin）、木樨草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）、β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）、異鼠李素（Isorhamnetin）等。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)胃復(fù)方抗胃癌的作用機(jī)制可能與HIF-1 信號通路相關(guān)，且該通路位列前3 名，富集程度及可信度較高（見圖1），基于此，本課題開展體外實(shí)驗(yàn)研究探討胃復(fù)方抑制胃癌細(xì)胞增殖及血管生成的作用機(jī)制。

圖1 不同濃度WFF 對人胃癌HGC-27 細(xì)胞的增殖抑制作用

圖1 KEGG 富集分析高級氣泡圖（摘自本課題組前期研究結(jié)果，已發(fā)表，尚未見刊）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胃癌HGC-27 細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CL-0107。

1.2 藥物制備及試劑

1.2.1 中藥 參考《天然藥物化學(xué)》。在湖南省腫瘤醫(yī)院中藥房購置中藥飲片黃芪180 g（批次：201228）、黨參60 g（批次：201231）、茯苓60 g（批次：211201）、白術(shù)60 g（批次：201229）、香附60 g（批次：201164）、郁金60 g（批次：211126）、女貞子60 g（批次：210004）、菟絲子60 g（批次：211026）、莪術(shù)60 g（批次：210915）、白花蛇舌草90 g（批次：201224）、半枝蓮90 g（批次：210326）、甘草30 g（批次：210830），按照書中所用方法制備胃復(fù)方水提物（WFF）。因在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)時使用胃復(fù)方灌胃大鼠制取含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)效果并不理想，改用提取物后，預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)達(dá)到預(yù)期效果，故改用WFF 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 西藥 2-MeOE2（HIF-1α 抑制劑）：將10 mmol/L的母液先稀釋100 倍配制成100 μmol/L 的中間濃度，再將100 μmol/L 稀釋100 倍配制成1 μmol/L 的工作濃度。甲磺酸阿帕替尼：將藥物碾成粉末后將其配置成20 mmol/L 的母液，母液稀釋1 000 倍得到濃度為20 μmol/L 的工作液。

1.2.3 試劑 HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒（HonorGene 公司，貨號：HG-GHO00203）、2-MeOE2（美國APE×BIO，貨號：A4188）、1640 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：PM150110），胰酶消化液、雙抗（青鏈霉素）、細(xì)胞凍存液（長沙艾碧維生物科技有限公司， 貨號分別為： AWC0238a、 AWH0529a、AWC0229），胎牛血清（美國Gibco 公司，貨號：10099141），CCK-8 試劑（日本同仁公司，貨號：NU679），結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1062），4% 多聚甲醛（蘇州新賽美生物科技有限公司， 貨號： N1012）， 兔抗 HIF-1α、 VEGFA、VEGFR2，鼠抗β-actin（美國proteintech 公司，貨號分別為20960-1-AP、19003-1-AP、26415-1-AP、66009-1-Ig），山羊抗鼠、抗兔二抗（長沙艾碧維生物科技有限公司，貨號分別為：AWS0001、AWS0002）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司），直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤電子有限公司），倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司），低速離心機(jī)（廣州市知信儀器有限公司），多功能酶標(biāo)分析儀（深圳匯松科技發(fā)展有限公司），化學(xué)發(fā)光儀（Minichemi），精密天平（Ducurser），冷凍干燥機(jī)（Thermo）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌HGC-27 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取出所需的HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒，冰上化凍。取2 個無菌離心管，每管加95 μL 無血清1640 培養(yǎng)基，然后往離心管中分別加入3 μg 的HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒和5 μL 的Lip2000。輕輕混勻，室溫靜置5 min 后2 管混合，輕輕混勻，共約200 μL，室溫靜置20 min。最后將混合液均勻加到待轉(zhuǎn)染孔中，混勻。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后，換新鮮完全培養(yǎng)液。

1.6 CCK-8 法檢測最佳干預(yù)濃度 將HGC-27 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，按每孔200 μL 接種于96 孔板，隔夜后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基。以每孔200 μL 藥物給藥，給藥濃度為依次為0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8 mg/mL，于24 h 避光加入終濃度為10% 的CCK-8 試劑100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h 后于酶標(biāo)儀450 nm 處測定吸光光度值（OD）。細(xì)胞活力率=OD 值實(shí)驗(yàn)組-OD 值空白組/OD 值對照組-OD 值空白組×100%（空白組，無細(xì)胞，僅有CCK-8 試劑）。細(xì)胞存活率為50%時，為WFF 對應(yīng)的半數(shù)抑制率（IC50），即后續(xù)中藥干預(yù)的終濃度。

1.7 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)分組如下：NC組、WFF 組（IC50）、WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組、WFF+2-MeOE2 組、HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組、2-MeOE2組、甲磺酸阿帕替尼組共7 組。將HGC-27 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，按每孔200 μL 接種于96 孔板，隔夜后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基?；诒菊n題組前期實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，選取24 h為最佳實(shí)驗(yàn)時間，于24 h 避光加入終濃度為10%的CCK-8 試劑100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后于酶標(biāo)儀450 nm 處測定OD 值并計(jì)算細(xì)胞活力率。

1.8 檢測胃癌細(xì)胞血管生成 HGC-27 細(xì)胞分組同1.7。實(shí)驗(yàn)步驟如下：第1 天，將基質(zhì)膠、96 孔板和槍頭置于4 ℃冰箱過夜。第2 天，取出基質(zhì)膠置于冰盒上，往預(yù)冷的96 孔板每孔加入70 μL 基質(zhì)膠至均勻鋪滿孔，不要有氣泡，4 ℃靜置10 min。將其放置于37 ℃培養(yǎng)箱，30 min。用0.25% 胰酶消化以上處理的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每孔加入10 000 個細(xì)胞。

1.9 檢測胃癌細(xì)胞增殖及HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組為NC組、WFF 組（IC50）、WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組、WFF+2-MeOE2 1 μM 組、HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組、2-MeOE2 組共6 組。將各組細(xì)胞中蛋白質(zhì)定量蛋白濃度后，電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用1×PBST 配制5%脫脂奶粉封閉，將膜浸入后，室溫放置90 min。一抗孵育：用1×PBST 將一抗按照1∶1 000 比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜，孵育結(jié)束。1×PBST洗3 次，每次10 min。二抗孵育：用1×PBST 按照1∶5 000 比例稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min。孵育結(jié)束，1×PBST 洗3 次，每次15 min。顯色。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS23.0 和GraphPad Prism 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，若滿足正態(tài)性分布及方差齊性，應(yīng)使用單因素方差分析，否則使用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05和P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 選取胃復(fù)方IC50為最佳干預(yù)濃度 見圖1。CCK-8 結(jié)果顯示：WFF 對HGC-27 細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，隨著濃度的增加，細(xì)胞活力降低，呈濃度依賴性，WFF 各組與NC 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且其余各組組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。利用GraphPad Prism 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出IC50為1.480 8 mg/mL，與1.5 mg/mL 較為接近，可信度較高，故取1.5 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)WFF 干預(yù)濃度。

3.2 WFF 抑制胃癌細(xì)胞增殖 見表1。與NC 組比較，WFF 組、WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組、WFF+2-MeOE2 組、2-MeOE2 組細(xì)胞活性均有所降低，表明有抑制HGC-27 細(xì)胞增殖的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞活性增高，表明有促進(jìn)HGC-27 細(xì)胞增殖的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且各組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與單用WFF 組比較，WFF+HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組比較，WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組有效抑制了HGC-27 細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與2-MeOE2 組比較，WFF+2-MeOE2 組有效抑制了HGC-27 細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組處理人胃癌HGC-27 細(xì)胞后的OD 及細(xì)胞活力率（）

表1 各組處理人胃癌HGC-27 細(xì)胞后的OD 及細(xì)胞活力率（）

注：①與NC 組比較，P＜0.01；②與WFF 組比較，P＜0.01；③與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組比較，P＜0.01；④與2-MeOE2 組比較，P＜0.01

細(xì)胞活力率（%）-48.74 71.46 31.60 118.72 44.02 46.92組 別NC 組WFF 組WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組WFF+2-MeOE2 組HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組2-MeOE2 組甲磺酸阿帕替尼組n3 3 3 3 3 3 3 OD 1.752±0.04②③④0.978±0.05①③1.321±0.02①②③④0.720±0.03①②③④2.036±0.03①②④0.907±0.03①②③0.951±0.14①②③④

3.3 胃復(fù)方水提物抑制胃癌細(xì)胞血管生成 血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，①成管數(shù)目：見圖2a、圖3。與NC 組比較，過表達(dá)HIF-1α 質(zhì)粒組成管數(shù)目增多，其余各組均有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與單用WFF 組比較，WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組成管數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明WFF 與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒有拮抗降低成管能力作用；WFF+2-MeOE2 組成管數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明WFF 與2-MeOE2 聯(lián)用具有協(xié)同降低成管能力作用。②成管交叉點(diǎn)：見圖2b、圖3。與NC 組比較，過表達(dá)HIF-1α 質(zhì)粒組成管交叉點(diǎn)增多，其余各組均有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與單用WFF 組比較，WFF+過表達(dá)HIF-1α 質(zhì)粒組成管交叉點(diǎn)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明WFF 與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒有拮抗降低成管能力作用；WFF+2-MeOE2 組成管交叉點(diǎn)有減少趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③成管網(wǎng)眼數(shù)、成管長度：見圖2c、圖2d、圖3。與NC組比較，過表達(dá)HIF-1α 質(zhì)粒組成管網(wǎng)眼數(shù)、成管長度增多，其余各組均有所減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與單用WFF 組比較，WFF+過表達(dá)HIF-1α 質(zhì)粒組成管網(wǎng)眼數(shù)、成管長度增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明WFF 與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒有拮抗降低成管能力作用；WFF+2-MeOE2 組成管網(wǎng)眼數(shù)、成管長度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明WFF 與2-MeOE2 有協(xié)同降低成管能力作用。

圖2 各組對胃癌細(xì)胞血管生成的影響

圖3 各組處理人胃癌HGC-27 細(xì)胞后的血管生成情況（標(biāo)尺100 μm，光鏡倍數(shù)：100 倍）

3.4 胃復(fù)方水提物降低胃癌細(xì)胞增殖及HIF-1α/VEGF 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 見圖4、表2。Western blot 結(jié)果顯示，①與NC 組比較，WFF 組均能下調(diào)HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA的蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。②與 NC 組比較， 2-MeOE2 組下調(diào) HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA；HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組上調(diào)HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA 的蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。③與WFF 組比較，加入HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒后，HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、PCNA 的蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒對抑制蛋白表達(dá)有拮抗作用。其中Ki-67 的蛋白表達(dá)水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④與WFF 組比較，加入2-MeOE2 后，明顯下調(diào)HIF-1α、VEGFA、Ki-67、PCNA 的蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明2-MeOE2 對抑制蛋白表達(dá)有協(xié)同作用。其中VEGFR2 的蛋白表達(dá)水平有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組處理HGC-27 細(xì)胞的相對灰度值表達(dá)（，n=3）

注：①與NC 組比較，P＜0.05；②與NC 組比較，P＜0.01；③與WFF 組比較，P＜0.05；④與WFF+2-MeOE2 組比較，P＜0.05；⑤HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組比較，P＜0.05

PCNA 1 0.65±0.12②④⑤0.88±0.11③④⑤0.24±0.16②③⑤1.49±0.10②③④0.38±0.14②③⑤組 別NC 組WFF 組WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組WFF+2-MeOE2 組HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組2-MeOE2 組HIF-1α 1 0.53±0.08②④⑤0.93±0.08③④⑤0.24±0.13②③⑤1.46±0.09②③④0.37±0.07②③⑤VEGFA 1 0.49±0.15②⑤0.74±0.16②③④⑤0.14±0.02②③④⑤1.32±0.01②③④0.34±0.09②⑤VEGFR2 1 0.52±0.00②④⑤0.85±0.08③④⑤0.13±0.05②④⑤1.33±0.11②③④0.29±0.08②③⑤Ki-67 1 0.68±0.07②④⑤0.81±0.12①④⑤0.14±0.09②③⑤1.17±0.15①③④0.29±0.01②③⑤

圖4 各組處理HGC-27 細(xì)胞后的蛋白電泳圖

4 討論

非腫瘤細(xì)胞在代謝過程中多以氧化磷酸化途徑獲能，而癌癥細(xì)胞與之不同，即使在氧充足的條件下，也多以糖酵解途徑獲取能量，這一途徑被稱為有氧糖酵解[13]，通過糖酵解分解葡萄糖，產(chǎn)生大量乳酸，造成乳酸堆積，形成酸性腫瘤微環(huán)境，過程中產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）家族是正常組織及和腫瘤瘤體適應(yīng)缺氧環(huán)境的多功能轉(zhuǎn)錄因子，其本質(zhì)是一種異源二聚體，由α 和β 兩個亞基構(gòu)成[14]。HIF-1α 主要負(fù)責(zé)HIF-1的功能與活性，HIF-1β 負(fù)責(zé)維持HIF-1 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[15]。HIF-1α 分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，對氧濃度較為敏感，是調(diào)節(jié)氧分壓，發(fā)揮活性最重要的亞單位，常氧環(huán)境下，多被蛋白酶體快速水解[16]，在缺氧環(huán)境中，HIF-1α 含量累積，轉(zhuǎn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β 結(jié)合生成異源二聚體[17]，迅速上調(diào)一系列缺氧因子表達(dá)，使機(jī)體迅速適應(yīng)缺氧環(huán)境，盡可能降低缺氧對組織、細(xì)胞帶來的影響[18]。

VEGF 家族是一類血管調(diào)節(jié)因子[19]，瘤體內(nèi)發(fā)生缺氧，HIF-1 被激活，刺激VEGF 發(fā)揮功能，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，也使得瘤體內(nèi)新生血管生長，腫瘤得以快速生長[20]。在缺氧調(diào)節(jié)VEGF 途徑中，HIF-1 起核心紐帶的作用，HIF-1 能與VEGF 基因的缺氧反應(yīng)元件中的共有序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平增加VEGF 的表達(dá)，通過促VEGF mRNA 的轉(zhuǎn)錄和增強(qiáng)VEGF mRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)VEGF 蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤的血管生成[21]。MU G 等[22]研究顯示，鈣調(diào)蛋白2（CALM2）表達(dá)升高，調(diào)節(jié)HIF-1/VEGFA 軸并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管生成。HIF-1α/VEGF 通路在本課題組前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的通路中排名第三，可見與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

本研究CCK-8 結(jié)果顯示，與NC 組比較，WFF組、WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組、WFF+2-MeOE2組、2-MeOE2 組、甲磺酸阿帕替尼組均對HGC-27細(xì)胞增殖具有抑制作用。與單用WFF 組比較，WFF+2-MeOE2 組的細(xì)胞活性更低，抑制作用更明顯，說明2-MeOE2 具有抑制HGC-27 細(xì)胞增殖的作用；WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組的細(xì)胞活性增高，抑制作用降低，說明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒具有促進(jìn)HGC-27 細(xì)胞增殖的作用。與單用HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組比較，WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組的細(xì)胞活性降低，說明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒與WFF 聯(lián)用對HGC-27 細(xì)胞增殖有拮抗抑制作用；與單用2-MeOE2組比較，WFF+2-MeOE2 組的細(xì)胞活性更低，說明2-MeOE2 與WFF 聯(lián)用對HGC-27 細(xì)胞增殖有協(xié)同抑制作用。

血管生成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了胃復(fù)方水提物有效降低了人胃癌HGC-27 細(xì)胞血管生成能力，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，除HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組外，其余各組與NC 組比較，均降低了HGC-27 細(xì)胞血管生成能力。與單用WFF 組比較，WFF+2-MeOE2 組成管數(shù)目、交叉點(diǎn)、網(wǎng)眼數(shù)及長度減少，說明2-MeOE2 可降低HGC-27細(xì)胞成管的能力；WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組成管數(shù)目、交叉點(diǎn)、網(wǎng)眼數(shù)及長度增多，說明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)?？商岣逪GC-27 細(xì)胞成管的能力。與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組比較，WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組成管數(shù)目、交叉點(diǎn)、網(wǎng)眼數(shù)及長度減少，說明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒與WFF 聯(lián)用對HGC-27 細(xì)胞的成管能力有拮抗降低作用；與2-MeOE2 組比較，WFF+2-MeOE2 組成管數(shù)目、網(wǎng)眼數(shù)及長度減少，說明2-MeOE2 與WFF 聯(lián)用對HGC-27 細(xì)胞的成管能力有協(xié)同降低作用。

Western blot 顯示，與NC 組比較，WFF 作用HGC-27 細(xì)胞后下調(diào)了HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA 的蛋白表達(dá)。與單用WFF 組比較，WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組的蛋白表達(dá)均有所升高，說明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)?？缮险{(diào)HGC-27 細(xì)胞HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA 的蛋白表達(dá)；WFF+2-MeOE2 組蛋白表達(dá)均有所降低，說明2-MeOE2 作為HIF-1α 的抑制劑，不僅可以下調(diào)HIF-1α 的表達(dá)，也可下調(diào)VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA的蛋白表達(dá)。與HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組比較，WFF+HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒組的蛋白表達(dá)均有所降低，說明WFF 可直接調(diào)控HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Ki-67、PCNA 等因子，下調(diào)各因子蛋白的表達(dá)，同時說明HIF-1α 過表達(dá)質(zhì)粒與WFF 聯(lián)用對HGC-27 細(xì)胞各蛋白的表達(dá)有拮抗下調(diào)作用；與2-MeOE2 組比較，WFF+2-MeOE2 組的蛋白表達(dá)均有所降低，說明2-MeOE2 與WFF 聯(lián)用對HGC-27 細(xì)胞各蛋白的表達(dá)有協(xié)同下調(diào)作用。本研究提示W(wǎng)FF 可能通過抑制HIF-1α/VEGF 信號通路，發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖及抗血管生成的作用。

綜上所述，本研究顯示W(wǎng)FF 可抑制人胃癌HGC-27 細(xì)胞增殖及血管生成，且能夠抑制胃癌增殖及HIF-1α/VEGF 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明WFF 發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖及抗血管生成的作用可能與通過抑制HIF-1α/VEGF 信號通路有關(guān)。在未來，WFF 更深層次的作用機(jī)制需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討。