日本醫(yī)蛭攝食前后不同組織中水蛭素基因(hirudin)的時空表達(dá)模式

石 萍,游華建,鄧小書,陳仕江,魯增輝

(1.重慶市中藥研究院,重慶 400065;2.重慶中醫(yī)藥學(xué)院,重慶 402760;3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重慶分中心,重慶 400065)

【研究意義】水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,作為活血化瘀類藥材的代表,具有破血通經(jīng)、逐淤消癥的功效[1]?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明,水蛭藥材在治療動脈粥樣硬化[2]、高脂血癥[3]、抗血栓[4]、抗腫瘤[5]等方面具有較好的療效。日本醫(yī)蛭(HirudonipponiaWhitman),別名水蛭、稻田醫(yī)蛭,隸屬于環(huán)節(jié)動物門蛭綱醫(yī)蛭科醫(yī)蛭屬[6],是《中國藥典》(2020年版本)收載的唯一攝食動物血液的水蛭藥材種類[1],其體內(nèi)含有世界上最強(qiáng)的天然凝血酶抑制劑——水蛭素,因此具有極高的抗凝血酶活性和抗血小板聚集作用[7]。臨床上,水蛭素多用于治療彌漫性血管內(nèi)凝血、不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌梗死和連續(xù)性腎臟替代治療[8]。研究發(fā)現(xiàn),水蛭不同部位的抗凝活性存在較大差異,而且攝食行為對水蛭的抗凝活性也有一定影響,這一現(xiàn)象與水蛭素的時空分布必然有一定的聯(lián)系,但相關(guān)文獻(xiàn)資料還十分欠缺。為此,重慶市中藥研究院藥用動物課題組研究水蛭素hirudin基因的時空表達(dá)模式,對于闡明水蛭抗凝活性差異的機(jī)理、合理采收水蛭藥材和藥用部位的充分利用均有重要的理論和實(shí)踐意義。【前人研究進(jìn)展】近年來,由于生存環(huán)境的破壞、人為過度捕撈、自身繁殖率低下等因素的影響,野生水蛭資源數(shù)量銳減[9-11],已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足藥企及人民群眾的用藥需求。天然水蛭素是由65～66個氨基酸殘基組成的、無糖基化的小分子酸性單鏈多肽,來源非常有限[12-14]。有學(xué)者致力于通過基因工程途徑獲取水蛭素,以期擺脫自然資源的限制,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)水蛭藥材的現(xiàn)代化利用[7,15-16]。另有學(xué)者研究不同品種、不同部位、不同采收加工方式對水蛭抗凝活性的影響,以期提高水蛭藥材的抗凝活性。研究表明,不同種類水蛭的抗凝活性存在較大差異,其中日本醫(yī)蛭、菲牛蛭等吸血蛭類的抗凝活性顯著高于寬體金線蛭等非吸血蛭類[17-18]。水蛭不同部位的抗凝活性有顯著差異,其頭部的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于尾部[19]。不同采收及加工方法對金邊螞蟥的抗凝血酶活性有顯著影響,超低溫冷凍干燥方法加工后的抗凝活性高于曬干方法[20];超低溫凍干的水蛭抗凝活性高于曬干和鮮品[21]。究其原因可能是水蛭素受高溫影響會嚴(yán)重失活[22]。螞蟥唾液腺在攝食后各階段的抗凝活性均顯著高于其他組織,攝食行為和食物均可誘導(dǎo)唾液腺和消化道分泌抗凝活性物質(zhì)[23]。傳統(tǒng)認(rèn)為,水蛭素主要來源于水蛭頭部的唾液腺,而軀體內(nèi)含有的是偽水蛭素[24]。實(shí)踐證明,水蛭除了頭部具有較強(qiáng)的抗凝活性外,軀體也具有較強(qiáng)的抗凝活性。因此有必要研究除唾液腺以外的組織是否也能表達(dá)水蛭素基因,攝食行為是否影響唾液腺及其他組織中的水蛭素基因表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】目前,關(guān)于水蛭素基因表達(dá)模式的研究報道極其匱乏,尤其是在抗凝血活性極高的日本醫(yī)蛭中水蛭素基因的時空表達(dá)相關(guān)研究尚未見報道,因此本研究基于前期唾液腺轉(zhuǎn)錄組篩選數(shù)據(jù)及克隆得到的日本醫(yī)蛭水蛭素基因全長序列[25],對日本醫(yī)蛭在不同攝食階段、不同組織中的水蛭素基因(hirudin)時空表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用實(shí)時熒光定量PCR的方法對日本醫(yī)蛭攝食前后不同階段、各種組織中水蛭素基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析,為日本醫(yī)蛭抗凝機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料,同時為水蛭藥材的科學(xué)采收加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

本研究所用水蛭(同一居群、月齡一致)均來源于重慶市中藥研究院水蛭養(yǎng)殖基地。經(jīng)重慶市中藥研究院陳仕江研究員鑒定為日本醫(yī)蛭(H.nipponia)。

試驗(yàn)試劑有RNA提取試劑盒TRIzol Reagent(Invitrogen),RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄)試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa) ,熒光定量PCR試劑Luna?Universal qPCR Master Mix (NEB)。

試驗(yàn)儀器有RNA濃度測定儀 Nanodrop分光光度計(Thermo),熒光定量PCR儀BIO-RAD CFX ConnectTM。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計及取樣 將200尾健康無病、表面無傷痕、個體大小相近的日本醫(yī)蛭,單獨(dú)飼養(yǎng)在5 L的養(yǎng)殖網(wǎng)箱中。饑餓處理30 d后投喂新鮮健康豬血,觀察日本醫(yī)蛭的攝食情況,分別用攝食前(Before feeding,BF)、攝食中(During feeding,DF)、攝食后(After feeding,AF)表示,以攝食新鮮豬血為開始時間,此后24 h為第1天,以此類推第48、72、168、192 h代表攝食后第2、3、7、8天,分別用序號D1、D2、D3、D7、D8表示。以上每組取5～10條日本醫(yī)蛭(重復(fù)3次)于冰上解剖,分別取唾液腺(SG)、嗉囊(C)、精/卵巢(G)、腸(I)、皮膚(S)樣品。取樣后樣品迅速用液氮凍存,隨后轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 將不同攝食階段(BF、DF、D1、D2、D3、D7、D8)各組織(SG、C、G、I、S)的共計35個樣品,分別放置于研缽中加入液氮充分研磨,采用TRIzol試劑盒提取各樣品的總RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳及RNA濃度測定儀來檢測RNA提取質(zhì)量?？俁NA經(jīng)RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄)試劑盒得到各樣品的cDNA。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)課題組前期克隆得到水蛭素基因hirudin的mRNA全長序列(GenBank登錄號:MN116511)設(shè)計熒光定量PCR引物。選取內(nèi)參基因α-tubulin(GenBank登錄號:U67677.1)。引物設(shè)計采用軟件Primer Premier 5進(jìn)行,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列特征見表1。

1.2.4 水蛭素基因(hirudin)及內(nèi)參基因α-tubulin的PCR擴(kuò)增 以待測cDNA樣品為模板,使用表1中的引物擴(kuò)增內(nèi)參基因α-tubulin和目的基因hirudin。PCR擴(kuò)增體系為:cDNA(20 ng/μL)3 μL,TaKaRa LATaq(5 U/μL)0.5 μL,10×LATaqBuffer Ⅱ(Mg2+Plus)5 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL,上下游引物各2 μL,雙蒸水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的條帶切膠回收純化后送上海生工測序。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 所有cDNA樣品分別用水蛭素基因hirudin及內(nèi)參基因α-tubulin進(jìn)行熒光定量PCR,每個樣品3次重復(fù)。PCR反應(yīng)體系:cDNA 1.5 μL,Luna?Universal qPCR Master Mix 10 μL,Primer F 0.5 μL,Primer R 0.5 μL,Nuclease-free water 7.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。溶解曲線檢測條件為65 ℃ 1 min,95 ℃ 1 min,然后以0.5 ℃/s的速度提高到95 ℃,連續(xù)檢測熒光信號。采用2-△△Ct方法分析熒光定量結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計,用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法分析,顯著水平為P<0.05,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水蛭素基因(hirudin)及內(nèi)參基因α-tubulin的PCR擴(kuò)增結(jié)果

所有cDNA樣品及引物在熒光定量上機(jī)檢測前均會進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證內(nèi)參基因α-tubulin和目的基因hirudin引物的特異性及cDNA模板質(zhì)量。結(jié)果顯示,目的條帶特異單一,內(nèi)參基因111 bp(圖1-A),目的基因138 bp(圖1-B),大小符合預(yù)期。以上結(jié)果表明內(nèi)參基因α-tubulin及目的基因hirudin引物的特異性良好,且cDNA模板質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 水蛭素基因(hirudin)的時空表達(dá)結(jié)果

通過對水蛭素基因hirudin(圖2-A、2-C)和內(nèi)參基因α-tubulin(圖2-B、2-D)的熔解曲線、擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析,結(jié)果顯示各基因的熔解曲線均有良好的特異性,表現(xiàn)為無非特異性熒光峰的單峰(圖2-A、2-B);擴(kuò)增曲線也顯示引物擴(kuò)增效率良好(圖2-C、2-D)。

2.2.1 在不同組織中的表達(dá) 由圖3可見,水蛭素基因(hirudin)在各組織(唾液腺、嗉囊、精/卵巢、腸和皮膚)中均有表達(dá),其中在唾液腺中的表達(dá)量極高,與其他組織中的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05);水蛭素基因(hirudin)在嗉囊、腸、精/卵巢組織中也有較高的表達(dá)量,在皮膚中的表達(dá)量次之。

2.2.2 在不同攝食階段的表達(dá) 攝食前后不同階段唾液腺中hirudin表達(dá)量的檢測結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),攝食后第2天(D2)的表達(dá)量最高,與其他階段的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05);嗉囊中的表達(dá)量在攝食后第1天(D1)較高,攝食后第7天(D7)、第8天(D8)表達(dá)量呈顯著性下降(P<0.05);腸中的表達(dá)量在攝食后第2天(D2)最高,后隨著停食時間的延長,表達(dá)量呈顯著下降趨勢(P<0.05);皮膚組織中的表達(dá)量隨著停食時間的延長呈先升后降趨勢,最高峰出現(xiàn)在攝食后第2天(D2)(P<0.05);精/卵巢在攝食階段(DF)的表達(dá)量最高,與其他階段的表達(dá)量呈顯著差異(P<0.05)。

表1 試驗(yàn)所用引物序列

M.Marker DL 2000;以“攝食階段-組織”命名各樣品,如DF-SG、DF-G、DF-C、DF-I、DF-S分別為攝食中唾液腺、精卵巢、嗉囊、腸、皮膚組織樣品;以此類推,“BF-”為攝食前各組織樣品;“D1-, D2-, D3-, D7-, D8-”分別為攝食后第1、2、3、7和8天各組織樣品。

圖2 水蛭素基因hirudin和內(nèi)參基因α-tubulin的熔解曲線及擴(kuò)增曲線

3 討 論

水蛭是我國經(jīng)典的活血化瘀類藥材,傳統(tǒng)研究認(rèn)為水蛭素主要來源于水蛭頭部的唾液腺,其他器官或組織如腸、嗉囊、性腺等不會分泌水蛭素;攝食行為及食物刺激會影響水蛭的抗凝活性。本研究中,目的基因擴(kuò)增結(jié)果及熒光定量結(jié)果一致顯示,除唾液腺以外,日本醫(yī)蛭的腸、皮膚、嗉囊、精/卵巢中均有水蛭素基因(hirudin)表達(dá),尤其唾液腺中水蛭素基因hirudin的表達(dá)量顯著高于其他組織。證明日本醫(yī)蛭除唾液腺這一主要分泌器官外,其他組織也極有可能分泌水蛭素,是水蛭藥材高效抗凝活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

不同小寫字母表示同一時間不同組織的表達(dá)差異顯著,不同大寫字母表示同一組織不同時間的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。

自然界中由于環(huán)境及季節(jié)等因素的影響,存在食物分布不均的現(xiàn)象,導(dǎo)致蛭類動物遭受饑餓脅迫[26-27],因此研究水蛭在饑餓脅迫下的行為、形態(tài)和生理反應(yīng)過程及特點(diǎn),從而揭示水蛭適應(yīng)饑餓脅迫的機(jī)理機(jī)制,對水蛭養(yǎng)殖及水蛭藥材藥用價值的挖掘等均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究中,日本醫(yī)蛭唾液腺在攝食期間(DF)的水蛭素基因(hirudin)表達(dá)量高于饑餓條件下(攝食前,BF),攝食后第2天(D2)又顯著升高,之后隨著攝食時間的延長而呈下降趨勢。究其原因,一方面是饑餓脅迫有可能激活日本醫(yī)蛭體內(nèi)的一系列免疫反應(yīng),唾液腺的水蛭素基因(hirudin)表達(dá)水平發(fā)生顯著變化[28];另一方面,取食行為誘導(dǎo)唾液腺的腺體分泌[29],攝食期間和攝食后短期內(nèi),唾液腺通過合成大量的抗凝劑、舒張血管物質(zhì)及麻醉劑等蛋白類活性物質(zhì),確保順利取食及攝食血液的長期儲存[30-31]。隨著攝食行為的結(jié)束,唾液腺分泌水蛭素的作用日趨減弱,因此水蛭素基因表達(dá)總體呈下降趨勢。當(dāng)日本醫(yī)蛭長期未攝食,處于饑餓脅迫的唾液腺中hirudin基因表達(dá)量下調(diào),恢復(fù)喂食后,hirudin基因很快顯著上調(diào)。

水蛭的消化道主要由口、食管、嗉囊、腸道和肛門組成[6]。水蛭在攝食血液后儲存在嗉囊中,經(jīng)過最佳的投喂時間(2～5 d)[32],通過腸道組織消化吸收后排出體外[6]。腸道中具有大量黏膜組織,向上突起形成褶皺狀結(jié)締組織,增加了血液與腸道的接觸面積,同時腸道褶皺還能延長血液與腸道的接觸時間,從而加快水蛭消化吸收速率[33]。該儲存和消化過程與本研究水蛭素在嗉囊和腸道中的表達(dá)模式高度吻合,即日本醫(yī)蛭嗉囊和腸中的水蛭素基因(hirudin)表達(dá)量分別在攝食后第1天(D1)和第2天(D2)達(dá)到最高值,之后在攝食后第7天(D7)、第8天(D8)呈顯著下降趨勢。證明攝食后的新鮮血液對嗉囊和消化道的刺激導(dǎo)致水蛭素大量分泌[23],隨著攝食時間延長,消化道刺激減弱,水蛭素表達(dá)量呈減少趨勢。

水生動物口咽部均含有豐富的粘液細(xì)胞,不僅可以粘著水中浮游生物,還可以減少吞咽食物的摩擦力對口腔咽部的損傷,具有一定抑菌作用[34]。水蛭的消化道組織細(xì)胞中存在大量的粘液細(xì)胞,可以將某些營養(yǎng)物質(zhì)吸收到肌肉組織或排泄到身體外[35]。本研究在日本醫(yī)蛭皮膚組織中檢測到水蛭素基因(hirudin)的表達(dá),推測水蛭在吸食血液后刺激消化道分泌水蛭素,可能通過粘液細(xì)胞吸收到皮膚組織中。

水蛭屬于雌雄同體動物,一般在越冬結(jié)束后,精卵細(xì)胞同步成熟[36]。研究表明,養(yǎng)殖水體溫度是影響水蛭性腺發(fā)育的主要因素[37]?？鼓钚缘认嚓P(guān)物質(zhì)在水蛭性腺組織中的分泌表達(dá)研究極其匱乏。本研究發(fā)現(xiàn),在日本醫(yī)蛭的精/卵巢中檢測到水蛭素基因(hirudin)表達(dá),該基因在攝食中(DF)階段表達(dá)量顯著升高,其他階段無顯著性差異,類似報道僅有1例[38],具體原因不明,尚需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示,水蛭素基因(hirudin)表達(dá)具有組織特異性,在唾液腺中存在優(yōu)勢表達(dá),同時在饑餓脅迫下也有表達(dá)量的差異變化,說明水蛭素基因(hirudin)參與了水蛭的生長發(fā)育進(jìn)程及在饑餓脅迫下的積極響應(yīng)。后續(xù)將進(jìn)一步圍繞水蛭素這一關(guān)鍵抗凝活性成分,在蛋白水平上探討其含量與水蛭藥材之間的關(guān)系。

4 結(jié) 論

基于熒光定量方法首次證明,日本醫(yī)蛭除唾液腺以外的組織,如腸、嗉囊、精/卵巢、皮膚等也能大量表達(dá)水蛭素基因hirudin,且隨著攝食時間推移,水蛭素基因呈現(xiàn)不同的時空表達(dá)模式。水蛭攝食期間,唾液腺通過合成大量的水蛭素,確保順利取食及攝食血液的長期儲存。攝食后的新鮮血液對存儲和消化器官的刺激,使嗉囊和消化道大量分泌水蛭素,隨著攝食后時間延長,消化道刺激減弱,水蛭素表達(dá)量日趨減少。

本研究可為深入研究日本醫(yī)蛭的抗凝機(jī)制提供基礎(chǔ)資料,同時為水蛭藥材的科學(xué)采收加工、提取部位的科學(xué)選取提供參考,對水蛭藥材資源的可持續(xù)利用、安全用藥及推動水蛭藥材的現(xiàn)代化開發(fā)利用等具有重要價值。