茄子Ⅳ型查爾酮異構(gòu)酶基因SmCHI2的克隆與分析

周 露,崔群香,劉同金,班秋妍,袁穎輝,寧 坤,范俊俊,張 敏,沈慧玲

(金陵科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,南京 210038)

【研究意義】茄子(SolanummelongenaL.)屬茄科茄屬,因其種植適應(yīng)范圍廣且產(chǎn)量高,在蔬菜生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。紫色茄子果皮中含有豐富的類(lèi)黃酮化合物-花青素?；ㄇ嗨刈鳛橐环N水溶性的植物色素,它可以賦予植物豐富的顏色。此外,花青素具有吸引昆蟲(chóng)傳粉,保護(hù)植物免受病原微生物侵染等生物學(xué)功能[1-2]。同時(shí),花青素還能有效降低患冠心病、中風(fēng)和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3]?；ㄇ嗨匾蛟谥参锷砗腿祟?lèi)健康上具有上述功能而使其備受關(guān)注。查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase,CHI)作為花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,探究其蛋白信息及表達(dá)特性對(duì)完善茄子花青素生物合成調(diào)控具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在類(lèi)黃酮合成途徑中,查爾酮異構(gòu)酶可催化黃色查爾酮形成無(wú)色柚皮素。根據(jù)功能和同源關(guān)系可將其分為4個(gè)亞家族(I型、II型、III型和IV型)[4],其中I型和II型CHI具有CHI酶催化活性,可通過(guò)催化查爾酮分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)形成類(lèi)黃酮及異黃酮等[5],而III型和IV型CHI則不具備查爾酮環(huán)化活性[6]。雖然IV型缺乏CHI環(huán)化活性,但它仍可促進(jìn)植物中類(lèi)黃酮化合物的產(chǎn)生[7-9]。目前研究者已從康乃馨[10]、煙草[11]、蘋(píng)果[12]、茄子[13]等多種植物中克隆獲得查爾酮異構(gòu)酶基因。相比黃果草莓,紅果草莓中FaCHI基因表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)量與花青素含量呈正相關(guān)[14]。在海南龍血樹(shù)和煙草中過(guò)表達(dá)DcCHI1基因和DcCHI4基因可增加類(lèi)黃酮積累[15]。在擬南芥中異源表達(dá)茄子SmCHI基因可顯著增加轉(zhuǎn)基因植株的花青素含量[13]。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái),關(guān)于茄子花青素生物合成調(diào)控已取得一些研究進(jìn)展,包括SmCHS、SmCHI、SmF3H和SmDFR[13]等結(jié)構(gòu)基因以及SmMYB113[16]、SmMYB75[17]、SmMYB86[18]等調(diào)節(jié)基因在花青素合成途徑中的功能已被驗(yàn)證。然而,部分結(jié)構(gòu)基因在茄子中存在多個(gè)同源基因,通過(guò)探究這些基因的功能,有助于篩選與之結(jié)合的調(diào)控基因,從而進(jìn)一步完善茄子花青素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在茄子中克隆獲得另一個(gè)CHI同源基因SmCHI2,通過(guò)分析其蛋白水平(理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)分析和亞細(xì)胞定位)和表達(dá)水平(基于qRT-PCR的組織特異性表達(dá)分析),為研究CHI基因功能,完善茄子花青素生物合成途徑和品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

種植于南京市金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝站的紫長(zhǎng)型茄子栽培種。采集根、莖、葉、果肉、花瓣、萼片、紫色果皮以及套袋處理后的白色果皮,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中,用于RNA提取。

1.2 茄子總RNA提取及SmCHI2基因的克隆

利用植物總RNA提取試劑盒(諾唯贊,南京)提取茄子紫色果皮RNA,隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA,北京)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用茄子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net/和http://eggplant.kazusa.or.jp/)BLAST程序查找茄子中CHI蛋白的同源基因并將其命名為SmCHI2。使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)SmCHI2基因的特異引物SmCHI2-F/R(表1)。以上述cDNA為模板,擴(kuò)增獲得SmCHI2基因序列。

PCR反應(yīng)液體系包括1 μL cDNA模板、25 μL PrimeSTAR Max Premix酶、10 μmol/L正反引物各1 μL及22 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃變性10 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,利用凝膠回收試劑盒(諾唯贊,南京)獲得目的片段,將其連接到pEASY-Blunt克隆載體(全式金,北京)上后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,挑選PCR檢測(cè)陽(yáng)性的單克隆送至生物公司(生工,上海)進(jìn)行測(cè)序,獲得Blunt-SmCHI2重組載體,并利用柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.3 茄子SmCHI2基因的生物信息學(xué)分析

使用Prot Param tool 網(wǎng)站分析編碼蛋白的理論等電點(diǎn)、分子量、蛋白質(zhì)水溶性等;利用在線網(wǎng)站SOPMA分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);通過(guò)SWISS MODEL在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu);利用ClustalX 1.7和GeneDoc 2.7.0軟件進(jìn)行蛋白序列比對(duì);利用ClustalX 1.7和Mega 6.0軟件進(jìn)行蛋白進(jìn)化樹(shù)分析。

表1 本研究所用引物

1.4 茄子SmCHI2蛋白的亞細(xì)胞定位

以上述Blunt-SmCHI2質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)PHB-SmCHI2-F/R引物(表1)擴(kuò)增SmCHI2的CDS片段,利用TAKARA公司的In-Fusion HD Cloning Plus同源重組酶將其構(gòu)建至含有黃色熒光蛋白的植物表達(dá)載體PHB-YFP上,測(cè)序正確后獲得重組載體PHB-SmCHI2-YFP。將其轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌菌株中,隨后接種于含有卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)使其D600達(dá)到0.6～0.8,離心后去上清,并使用懸浮液(含有蔗糖、乙酰丁香酮和MES的MS液體培養(yǎng)基)進(jìn)行重懸,靜置2～3 h后注射至本氏煙草的葉片背面。利用尼康激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)YFP蛋白的熒光信號(hào)。

1.5 茄子SmCHI2基因的表達(dá)模式分析

提取光敏型紫茄的根、莖、葉、花瓣、萼片、果肉、紫色果皮、遮光后白色果皮的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定。以SmAPRT為內(nèi)參,設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。參照TB Green Premix ExTaqTMⅡ(TAKARA,北京)說(shuō)明書(shū),使用20 μL體系在ABI7500熒光定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè),每個(gè)組織進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算得到基因相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)水平。根據(jù)已發(fā)表的茄子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19],分析光敏型和非光敏型紫茄在套袋-光照處理0、0.5、4.0和8.0 h后SmCHI2基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子SmCHI2基因的克隆

利用茄子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net/和http://eggplant.kazusa.or.jp/)中BLAST程序查找茄子中CHI蛋白的同源基因。Jiang等[13]已報(bào)道一個(gè)位于茄子第10號(hào)染色體上的SmCHI基因(SMEL4.1_10g016630.1),本研究克隆獲得位于第5號(hào)染色體上的一個(gè)CHI同源基因,將其命名為SmCHI2(SMEL4.1_05g001480.1)。通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行SmCHI2基因擴(kuò)增(圖1),將其連接到克隆載體pEASY-Blunt上,測(cè)序后獲得全長(zhǎng)633 bp的SmCHI2基因CDS序列(圖2),將其上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),獲得GenBank登錄號(hào)ON911770,說(shuō)明成功克隆了茄子SmCHI2基因。

2.2 茄子SmCHI2蛋白的特性分析

使用ExPASY在線工具將SmCHI2基因序列翻譯成蛋白序列,其共編碼210個(gè)氨基酸(圖3),其中谷氨酸(Glu,E)的含量最高,占12.4%。利用在線軟件對(duì)SmCHI2蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,該蛋白質(zhì)分子式為C1083H1689N269O330S7,相對(duì)分子質(zhì)量為23.98 kDa,理論等電點(diǎn)為4.81,不穩(wěn)定系數(shù)(II)為44.81,屬不穩(wěn)定蛋白,脂溶指數(shù)為90.84,總親水性平均系數(shù)為-0.260,為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中的概率最大,為45%,說(shuō)明SmCHI2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。

M: DL 2000;1: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 茄子SmCHI2基因的CDS序列

圖3 茄子的SmCHI2氨基酸序列

使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)SmCHI2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4),其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最大,為45.24%,其次為隨機(jī)卷曲,占26.67%,延伸鏈占22.38%,β-轉(zhuǎn)角占5.71%。說(shuō)明SmCHI2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、隨機(jī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成。以擬南芥AtCHI晶體結(jié)構(gòu)為模板,利用SWISS-MODEL在線分析工具對(duì)茄子SmCHI2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,SmCHI2與AtCHI蛋白一致性為65.2%,主要結(jié)構(gòu)為α-螺旋(圖5)。說(shuō)明三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)相符。

2.3 茄子SmCHI2蛋白的序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)茄子、葡萄、蘋(píng)果、甜橙、草莓、大豆、辣椒等17種植物的CHI蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖6可知,茄子SmCHI2屬于Ⅳ型CHI蛋白,且與LcCHI(枸杞AIC33515.1)、LrCHI蛋白(黑枸杞AQZ26680.1)、CaCHI2(辣椒XP_016573438.1)和StCHI3蛋白(馬鈴薯XP_006365329.1)等屬于同一分支,親緣關(guān)系較近。而與AtCHI3(擬南芥AAM61303.1)、GmCHI3(大豆AAT94361.1)和SlCHI3(番茄AAQ55182.1)等Ⅲ型蛋白同源關(guān)系較遠(yuǎn)。

序列比對(duì)顯示,SmCHI2與Ⅳ型CHI蛋白StCHI3(馬鈴薯XP_006365329.1)、CaCHI2(辣椒XP_016573438.1)、LcCHI(枸杞AIC33515.1)、LrCHI(黑枸杞AQZ26680.1)和PdCHI2(滇牡丹QDZ06023.1)具有相同的活性位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn)(圖7)。說(shuō)明CHI蛋白在物種間高度保守。

圖4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 茄子SmCHI2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Sm:茄子;Lc:枸杞;Lr:黑枸杞;Ca:辣椒;St:馬鈴薯;Pd:滇牡丹;Cs:甜橙;Fa:草莓;Vv:葡萄;At:擬南芥;Ac:洋蔥;Ch:陸地棉;Zm:玉米;Lj:百脈根;Gm:大豆;Ms:紫花苜蓿;Pl:葛根;Sl:番茄;Dc:海南龍血樹(shù);下同。SmCHI:ANN02871.1;LcCHI:AIC33515.1;LrCHI: AQZ26680.1;CaCHI2: XP_016573438.1;StCHI3: XP_006365329.1;PdCHI1: QDZ06022.1;PdCHI2: QDZ060 23.1;CsCHI:BAA36552.1;FaCHI1:Q4AE11.1;VvCHI1:P51117.1;AtCHI:P41088.2;AtCHI3:AAM61303.1;AtCHIL: NP_568154.1;AcCHI: AAU11843.1;ChCHI:ABM64798.1;ZmCHI: CAA80441.1;ZmCHIL: NP_001151452.1;LjCHI: CAD69022.1;LjCHI2:Q8H0G1.1;GmCHI1A:AAT94358.1;GmCHI1B1:AAT943 59.1;GmCHI2:AAT94360.1;GmCHI3:AAT94361.1;GmCHI4:AAT94362.1;MsCHI1: P28012.1;PlCHI: Q43056.1;SlCHI3: AAQ55182.1;DcCHI4: QTF65959.1;DcCHI5: QTF65960.1。

紅框表示Ⅳ型CHI蛋白識(shí)別位點(diǎn)。

圖8 茄子SmCHI2蛋白的亞細(xì)胞定位

2.4 茄子 SmCHI2蛋白的亞細(xì)胞定位

為了明確SmCHI2蛋白的亞細(xì)胞定位,構(gòu)建融合蛋白PHB-SmCHI2-YFP,在本氏煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果顯示,SmCHI2蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(圖8)。

2.5 茄子SmCHI2基因的表達(dá)模式分析

如圖9所示,雖然SmCHI2基因在各組織中均有表達(dá),但主要在紫色組織,包括葉、花瓣、萼片和紫色果皮中表達(dá)。相對(duì)于套袋遮光后的白色果皮,SmCHI2基因在紫色果皮中表達(dá)顯著增加。說(shuō)明SmCHI2基因參與茄子花青素的生物合成。

為了進(jìn)一步探究光照對(duì)SmCHI2基因表達(dá)和茄子花青素生物合成的影響,對(duì)已有的茄子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]進(jìn)行分析,依據(jù)SmCHI和SmCHI2基因表達(dá)情況繪制熱圖(圖10)。對(duì)光敏型(PS)和非光敏型(NPS)茄子果實(shí)進(jìn)行套袋-開(kāi)袋處理0、0.5、4.0和8.0 h,結(jié)果表明,2個(gè)SmCHIs基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致,光照可以促進(jìn)光敏型茄子中SmCHI2基因的表達(dá),對(duì)非光敏型茄子中SmCHI2基因的表達(dá)也有一定影響。

3 討 論

本研究從茄子中克隆獲得位于第5號(hào)染色體上CHI同源基因SmCHI2,其CDS全長(zhǎng)633 bp,編碼210個(gè)氨基酸,分子量為23.98 kDa,理論等電點(diǎn)為4.81,不穩(wěn)定系數(shù)(II)為44.81,是不穩(wěn)定蛋白,總親水性平均系數(shù)為-0.260,為親水性蛋白,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其位于細(xì)胞質(zhì)中。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示SmCHI2蛋白結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、隨機(jī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角。序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析表明SmCHI2蛋白與枸杞AIC33515.1、黑枸杞AQZ26680.1、辣椒XP_016573438.1和馬鈴薯XP_006365329.1等Ⅳ型CHI蛋白屬于同一分支,且具有相同的活性和識(shí)別位點(diǎn)。表達(dá)分析顯示,SmCHI2基因在白色果皮中表達(dá)量顯著低于紫色果皮,推測(cè)其參與茄子花青素的生物合成。

圖9 不同組織中SmCHI2基因的相對(duì)表達(dá)量

圖10 SmCHIs基因在光敏和非光敏茄子中表達(dá)情況

花青素作為類(lèi)黃酮代謝途徑的主要產(chǎn)物,對(duì)植物著色、口感和抗性等具有重要影響。CHI作為花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶,催化查爾酮轉(zhuǎn)化為黃烷酮[6]。在Del/Ros1過(guò)表達(dá)番茄中異源表達(dá)洋蔥CHI基因,可顯著增加轉(zhuǎn)基因植株的果皮和果實(shí)中花青素含量[20]。在擬南芥tt5突變體中過(guò)表達(dá)甘薯IbCHI基因可完全互補(bǔ)其著色突變表型,包括種皮、子葉和下胚軸,表明IbCHI蛋白對(duì)花青素和原花青素合成具有調(diào)節(jié)作用[21]。前期研究表明,CHI蛋白可分為I型、II型、III型和IV型,其中IV型CHI蛋白在其催化位點(diǎn)上有幾個(gè)氨基酸存在替換,因而沒(méi)有CHI蛋白的催化活性[6]。后期研究表明,IV型CHI蛋白可以作為增強(qiáng)子在類(lèi)黃酮合成途徑中起作用,如擬南芥的CHIL蛋白[22]。在海南龍血樹(shù)中,IV型CHI蛋白DcCHI4雖然缺乏大多數(shù)的關(guān)鍵催化殘基,且體外重組DcCHI4不能催化柚皮素查爾酮形成柚皮素,但轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)表明其可能參與類(lèi)黃酮積累,且在海南龍血樹(shù)和煙草中過(guò)表達(dá)DcCHI4基因可以增加類(lèi)黃酮合成[15]。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明本研究中的SmCHI2蛋白具有IV型CHI蛋白的保守位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn),屬于IV型CHI蛋白,而前期研究報(bào)道的SmCHI蛋白則屬于I型CHI,兩者同源關(guān)系較遠(yuǎn),但轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,兩者均受光調(diào)控,并且都可能參與茄子花青素的生物合成。表達(dá)分析顯示,相對(duì)于套袋遮光后的白色果皮,SmCHI2基因在紫色果皮和其他紫色組織中表達(dá)顯著增加,表明SmCHI2基因可能促進(jìn)茄子花青素的生物合成。關(guān)于IV型CHI蛋白參與類(lèi)黃酮途徑的作用機(jī)理,研究表明,IV型CHI蛋白似乎可能作為CHI蛋白及查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的激活子與它們進(jìn)行互作[8, 22]。也有研究者認(rèn)為,IV型CHI蛋白的作用是促進(jìn)CHS催化產(chǎn)生2’,4’,4’,6’-四羥基查耳酮,抑制反應(yīng)過(guò)程中副產(chǎn)物4-香豆酰三乙酸內(nèi)酯的產(chǎn)生,從而促進(jìn)類(lèi)黃酮生物合成[9]。

蛋白分析表明茄子SmCHI2蛋白為不穩(wěn)定蛋白和親水性蛋白。而芍藥CHI蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40,總親水性平均系數(shù)為-0.105,為穩(wěn)定蛋白和親水性蛋白[23]。滇水金鳳中,IuCHI1蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為47.57,為不穩(wěn)定蛋白,而IuCHI2蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為39.53,為穩(wěn)定蛋白[24]。對(duì)SmCHI2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其主要包含α-螺旋(45.24%)、隨機(jī)卷曲(26.67%)、延伸鏈(22.38%)和β-轉(zhuǎn)角(5.71%)。甘草[25]和芍藥[23]CHI蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)也含有α-螺旋、隨機(jī)卷曲、延長(zhǎng)鏈和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位表明,茄子SmCHI2蛋白分布于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中,研究者對(duì)紫心甘薯查爾酮異構(gòu)酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位也獲得相似的結(jié)果[26]。本研究通過(guò)同源克隆獲得茄子SmCHI2基因序列,對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)、序列、亞細(xì)胞定位以及轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究SmCHI2蛋白在花青素合成通路中的的功能和選育富含花青素的茄子新品種提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

茄子SmCHI2蛋白具有典型的Ⅳ型查爾酮異構(gòu)酶蛋白的結(jié)構(gòu)特征,且與Ⅳ型CHI蛋白具有較高的同源性,SmCHI2基因主要在紫色組織中表達(dá),為進(jìn)一步探究Ⅳ型CHI蛋白在花青素生物合成途徑中的功能具有十分重要的意義。