甘藍(lán)型油菜葉中控制葉綠素含量性狀的QTL定位及其候選基因鑒定

趙衛(wèi)國, 張 凱, 塔 娜, 朝紅波, 杜慧娟, 栗茂騰, 王 灝

(1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,陜西 安康 725000;2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,武漢 430074;3.鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,鄭州 450001;4.安康漢濱區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,陜西 安康 725000;5.陜西省雜交油菜研究中心,陜西 楊陵 712100)

【研究意義】甘藍(lán)型油菜是全世界重要的油料作物,也是我國第一大油料作物。甘藍(lán)型油菜作為人類食用植物油的主要來源,因其產(chǎn)量高、抗逆性強、環(huán)境適應(yīng)性廣等優(yōu)點在我國廣泛種植,年種植面積達(dá)6.67×1010m2以上。葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b,它是植物光合作用的重要光合色素,其含量高低對植物的生長發(fā)育具有重要影響[1]。已有研究表明,油菜葉綠素含量與光合速率呈顯著正相關(guān)[2-3],提高葉綠素含量是增強光合效率的有效途徑之一,從而最終促進(jìn)油菜產(chǎn)量提高。除此之外,Peng等[4]研究發(fā)現(xiàn)較高的葉綠素含量和光合速率是高產(chǎn)品種產(chǎn)量提高的主要原因。因此,對控制油菜葉綠素含量的數(shù)量性狀進(jìn)行QTL定位可有效揭示葉片葉綠素含量的遺傳機理。同時,挖掘QTL區(qū)間的候選基因,可以指導(dǎo)油菜高光效育種。【前人研究進(jìn)展】綠色植物葉綠素含量性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀,受基因和環(huán)境共同調(diào)控。研究數(shù)量性狀的方法包括QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析等。QTL定位作為一種有效、可靠的方法,已成功地應(yīng)用于多種作物重要農(nóng)藝數(shù)量性狀位點的鑒定。利用QTL定位方法已在水稻、小麥、大麥和大豆中對葉片葉綠素含量性狀進(jìn)行了深入研究[5-8]。 Jiang等[5]開展了水稻葉片葉綠素含量的QTL定位研究,在水稻分蘗期、抽穗期和成熟期分別檢測到22個控制葉綠素含量的QTL位點,其中 QTLqCTH4解釋的表型變異達(dá)61.42%。Zhang等[6]利用混合線性模型方法對小麥葉片葉綠素含量性狀進(jìn)行QTL研究,共鑒定到17個加性QTL,其中10個QTL在2個以上生長階段持續(xù)表達(dá)。Wang等[7]對大麥熱誘導(dǎo)葉綠素缺乏突變體的特性研究,發(fā)現(xiàn)該突變體由單個核基因控制,調(diào)控該性狀的位點被精細(xì)定位在0.428 Mb的物理區(qū)間,其中包括11個注釋基因。Dhanapal等[8]對大豆葉片葉綠素性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,分別檢測到14、7和10個位點分別與葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著相關(guān)。近幾年來,科研人員不僅對油菜含油量、產(chǎn)量等重要性狀進(jìn)行QTL定位,也對油菜葉片葉綠素含量性狀進(jìn)行了QTL定位,鑒定到一些性狀的重要位點。如Wang等[9]利用甘藍(lán)型油菜葉綠素缺失突變體“cdel”與中雙11構(gòu)建的F2群體,在C08染色體上定位到22個候選基因,預(yù)測可能與葉綠素含量相關(guān)。Lang等[10]利用甘藍(lán)型耐鹽品系2205和鹽敏感品系構(gòu)建的F2群體,通過復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行葉綠素含量定位,檢測到1個葉綠素的主效QTLqSPAD5,其置信區(qū)間鑒定到1個耐鹽相關(guān)基因Bra003640,通過定量分析發(fā)現(xiàn)該基因在2個親本中的表達(dá)量差異顯著。Choi等[11]對中國傳統(tǒng)白菜的葉片形態(tài)和葉色性狀進(jìn)行QTL分析,定位到2個控制葉色的主效QTLs,在其置信區(qū)間鑒定到與葉色緊密相關(guān)的候選基因SCO3、ABI3、FLU和CAB3等。代文東等[12]對甘藍(lán)型油菜葉片葉綠素含量進(jìn)行QTL定位,鑒定到位于7個連鎖群的8個(A03、A06、A07、A08、C01、C03、C06、C07)控制葉片葉綠素含量的QTLs,其候選基因PORB、HCF及NYC等可能與葉綠素含量相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】葉綠素含量對綠色植物的光合作用具有重要作用,也是油菜高光效育種的重要選擇指標(biāo)。但是目前對油菜葉綠素含量QTL定位的研究相對較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以甘藍(lán)型油菜KN DH群體在冬性環(huán)境和春性環(huán)境連續(xù)3個年份的葉片葉綠素含量性狀進(jìn)行QTL定位及候選基因鑒定,定位控制油菜葉綠素含量性狀的QTL位點并解析其分子遺傳機制,為控制油菜葉綠素含量相關(guān)基因的精細(xì)定位、基因克隆以及油菜高光效品種選育提供重要基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以KN double-haploid(DH)群體為研究對象,該DH群體由春性甘藍(lán)型油菜純系 KenC-8 為父本和冬性甘藍(lán)型油菜純系 N53-2 為母本通過小孢子培養(yǎng)構(gòu)建而成(構(gòu)建的群體名為KN),包含348份Double haploid(DH)系[13-14]。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計 KN DH群體及其親本于2011—2013年和2015—2017年分別在春油菜生態(tài)區(qū)甘肅張掖(編碼為ZY,100°46′ E、38°93′ N,年平均氣溫7.3 ℃,年平均降雨量130.4 mm)和冬油菜區(qū)陜西省雜交油菜研究中心楊陵(編碼為YL,108°08′ E、34°27′ N,年平均氣溫12.9 ℃,年平均降雨量635.1 mm)試驗田種植。KN DH 群體及其親本在陜西楊陵每年設(shè)3個重復(fù),在甘肅張掖每年設(shè)2個重復(fù)。KN DH群體采取完全隨機區(qū)組設(shè)計排列,每一DH系播種2行,行距40 cm,株距17 cm。

1.2.2 油菜葉片葉綠素含量測定 冬油菜區(qū)陜西楊陵每年3月份油菜抽薹后至初花期前進(jìn)行表型鑒定,春油菜區(qū)甘肅張掖待植株高度達(dá)到30 cm進(jìn)行表型鑒定。利用SPAD-502plus葉綠素儀對油菜成熟的長柄葉葉綠素含量進(jìn)行測定。測定方法:選取植株長柄葉片作為葉綠素含量的測定目標(biāo)葉片,每個植株選取3片葉子,每1葉片選取除了葉脈和葉緣部分的8個點作為測量點,每1葉片以8個點SPAD值的平均值作為該葉片中葉綠素含量(葉綠素含量指標(biāo)SPAD值)。

葉片葉綠素含量的QTL定位:KN高密度遺傳連鎖圖譜已構(gòu)建,該遺傳連鎖圖譜總長3072.7 cM,標(biāo)記之間平均遺傳距離為 1.0 cM[15]。結(jié)合KN高密度遺傳連鎖圖和不同生態(tài)區(qū)的葉綠素含量性狀表型,利用WinQTL Cart 2.5 QTL掃描軟件的符合區(qū)間作圖法(CIM)進(jìn)行QTL定位。以P=0.05進(jìn)行1000次排布測驗方法來確定顯著QTL的LOD閾值。初步鑒定的QTL定義identified QTL,以“q+性狀縮寫+年份+地點編號+染色體號+第幾個位點編號”命名,如qCC.13ZY6-2表示葉綠素含量QTL是在2013年甘肅張掖油菜生態(tài)區(qū)鑒定到位于A06染色體上第2個QTL。利用BioMercator 4.2數(shù)據(jù)處理軟件將初步鑒定的identified QTL置信區(qū)間進(jìn)行整合[16],整合后的QTL定義為一致性QTL(consensus QTL),一致性QTL命名法以consensus QTL的首字母“cq+葉綠素含量性狀縮寫[Chlorophyll content(CC)]+染色體號+第幾個位點編號”命名,如cqCC.A6-1。如果1個 consensus QTL能夠在2個及以上種植環(huán)境被鑒定到,其被定義為環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL,如果1個 consensus QTL僅在1個種植環(huán)境鑒定到,其被定義為環(huán)境特異表達(dá)QTL。

1.2.4 QTL區(qū)間的候選基因鑒定 根據(jù)Cai等[17]的方法將甘藍(lán)型油菜“Darmor-bzh”參考基因組中SNP探針作為同源位點。通過對甘藍(lán)型油菜“Darmor-bzh”參考基因組使用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST,以50 mer探針的序列搜索同源位點(E值閾值設(shè)定為1e-10)。KN高密度遺傳連鎖圖與甘藍(lán)型油菜“Darmor-bzh”參考基因組具有高度線性關(guān)系[15]。利用Chao等[13]對QTL置信區(qū)間候選基因的認(rèn)定辦法:單個SNP比對到參考基因組多個同源位點,僅選擇與該位點一致的連鎖群位點,如單個SNP在同一連鎖群上有多個同源位點,可通過該位點上下游物理位置手動確認(rèn)。將與QTL置信區(qū)間對應(yīng)一致的基因組區(qū)域內(nèi)的所有基因認(rèn)定為該QTL區(qū)域內(nèi)的候選基因[18]。同時,結(jié)合擬南芥數(shù)據(jù)庫對QTL區(qū)間的候選基因進(jìn)行同源基因鑒定和功能注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生態(tài)區(qū)域油菜葉片葉綠素含量表型分析

從表1可知,在冬性環(huán)境陜西楊陵母本N53-2的葉綠素含量遠(yuǎn)高于父本 KenC-8,兩親本的葉綠素含量在2016年相差最大,SPAD值差異為11.0,其次是2015年,SPAD值差異為8.8,2017年的葉綠素含量差異最小,SPAD值差異僅為5.8。在春性環(huán)境甘肅張掖KN DH 群體母本N53-2的葉綠素含量同樣高于父本KenC-8,但兩親本葉綠素含量差異較小,SPAD值變化范圍為0.8～2.2。KN DH群體在冬性環(huán)境連續(xù)3年的葉綠素含量SPAD值為50.2～53.8,SPAD值變化范圍為3.6;KN DH群體在春性環(huán)境連續(xù)3年的葉片葉綠素含量SPAD值為39.3～42.2。KN DH群體葉綠素含量在不同生態(tài)環(huán)境表現(xiàn)出較大差異,但是受到種植生態(tài)區(qū)域的影響,無論是在冬性環(huán)境陜西楊凌還是在春性環(huán)境甘肅張掖,KN DH群體葉綠素含量在不同種植年份之間卻表現(xiàn)出相對穩(wěn)定。KN DH群體葉綠素含量在冬性的表型變異范圍最大,SPAD值相差29.2(36.5 ～ 65.7),在春性環(huán)境的葉綠素含量表型變異范圍低于冬性環(huán)境,SPAD值相差23.3(30.0 ～ 53.3)。油菜葉綠素含量的廣義遺傳力在春性環(huán)境較高(70.2%),在冬性環(huán)境較低(30.2%),表明油菜葉綠素含量在春性環(huán)境相對穩(wěn)定遺傳,而在冬性環(huán)境遺傳力較低,容易受到種植環(huán)境條件的影響。此外,KN DH群體在兩個生態(tài)區(qū)域中不同年份葉綠素含量的表型頻數(shù)表現(xiàn)出近似的正態(tài)分布,表明葉綠素含量性狀屬于多基因控制的數(shù)量性狀,受到基因和環(huán)境的共同作用(圖1)。

表1 油菜KN DH 群體和親本在冬性和春性環(huán)境的葉綠素含量表型分析

2.2 不同種植生態(tài)區(qū)域油菜葉綠素含量的環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)和環(huán)境特異表達(dá)QTL定位

通過Wincart 2.5軟件掃描分析,共鑒定到34個控制油菜葉綠素含量identified QTLs,分布在11條染色體上(除了A02、A04、A05、A06、A08、C02、C03、C04)。單個QTL解釋的表型變異為3.9% ～12.0%,其中qCC.17YL1-3解釋表型變異最高,為12.0%;qCC.17YL3解釋表型變異最小,僅為3.92%,identified QTL的加性效應(yīng)為-1.8～1.0(表2)。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)22個identified QTLs位于甘藍(lán)型油菜A基因組,12個位于甘藍(lán)型油菜C基因組。其中,15個identified QTLs在春性生態(tài)環(huán)境被鑒定到,占identified QTL總數(shù)的44.1%;19個identified QTL在冬性生態(tài)環(huán)境被鑒定到,占identified QTL總數(shù)的55.9% (圖2)。

圖1 KN群體在甘肅張掖和陜西楊陵的葉綠素含量表型分布

利用BioMercator 4.2軟件對初步鑒定的identified QTL進(jìn)行整合,獲得31個控制葉綠素含量consensus QTLs (表2,圖2)。QTLcqCC.A1-4由冬性環(huán)境QTLqCC.16YL1-2和qCC.17YL1-3整合,屬于冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL;cqCC.A7-3由冬性環(huán)境QTLqCC.16YL7-3和春性環(huán)境qCC.12ZY7-1整合,cqCC.A7-5由冬性環(huán)境QTLqCC.16YL7-4和春性環(huán)境QTLqCC.12ZY7-2整合,這2個QTLs在冬性和春性生態(tài)環(huán)境都能夠鑒定到,屬于在冬性環(huán)境和春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。其余28個控制葉綠素含量consensus QTLs,其中15個僅在冬性環(huán)境鑒定到,13個在春性環(huán)境鑒定到,皆屬于環(huán)境特異表達(dá)QTL。更為重要的是在A01染色體上發(fā)現(xiàn)的QTLcqCC.A1-4,它在2個種植環(huán)境中的表型變異平均達(dá)到10.67%,屬于控制油菜葉綠素含量性狀的主效QTL。該主效QTLcqCC.A1-4的加性效應(yīng)皆為負(fù)值,表明其加性效應(yīng)主要來自母本 N53-2的貢獻(xiàn)。此外,主效QTLcqCC.A1-4僅在冬性環(huán)境檢測到,屬于冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)主效QTL。總之,主效QTL作為葉綠素含量重要QTL位點,可用于下一步葉綠素含量性狀的精細(xì)定位。

2.3 油菜葉綠素含量QTL區(qū)間候選基因鑒定

根據(jù)KN 高密度遺傳連鎖圖和甘藍(lán)型油菜“Darmor-bzh”參考基因組之間的線性關(guān)系,在31個控制油菜葉片葉綠素含量QTL置信區(qū)間,其中在24個QTL置信區(qū)間鑒定到66個甘藍(lán)型油菜基因及53個擬南芥同源基因 (表3),這些潛在的候選基因在葉綠素的生物合成與降解、光合作用路徑中具有重要調(diào)控作用。通過對候選基因進(jìn)行功能注釋,BnaA01g14880D(ACD1-LIKE)和BnaA03g22780D(TIC55-II)分別位于cqCC.A1-1和cqCC.A3-1置信區(qū)間,其功能編碼脫鎂葉綠酸加氧酶PAO(Pheophorbide a oxygenase)來降解原葉綠素內(nèi)酯;BnaA01g22870D(NYE1)位于cqCC.A1-3置信區(qū)間,主要與葉綠素降解相關(guān);BnaA07g29990D(AtWSCP)分別位于cqCC.A7-3和cqCC.A7-4置信區(qū)間,是葉綠素生物合成緊密關(guān)聯(lián)基因;BnaA09g32370D和BnaC08g23140D(CHLG)位于cqCC.A9-1和cqCC.C8-1置信區(qū)間,BnaA10g08760D(CAO)和BnaA10g07300D(PORA)位于cqCC.A10-1置信區(qū)間,BnaC01g10870D(CHLI1)位于cqCC.C1置信區(qū)間,這些基因都可控制葉綠素的生物合成。BnaC09g01520D(LHCB2.3)位于cqCC.C9-1置信區(qū)間,是光系統(tǒng)II捕光復(fù)合物基因,主要參與藍(lán)光響應(yīng)、紅光響應(yīng)、遠(yuǎn)紅光響應(yīng)及光合作用的調(diào)控。

圖2 控制油菜葉綠素含量QTL在KN遺傳連鎖圖上的分布

表2 不同種植環(huán)境油菜葉綠素含量一致性QTL和初步鑒定QTL

葉綠素含量不僅受到參與葉綠素生物合成和降解相關(guān)基因調(diào)控,還受到光合電子傳遞上相關(guān)基因的調(diào)控(表3)。如BnaA01g22670D(LHCA3)位于cqCC.A1-4置信區(qū)間,BnaC08g18620D(LHCA6)位于cqCC.C8-1置信區(qū)間,BnaA10g07350D(LHCB3)位于cqCC.A10-1置信區(qū)間,BnaC08g38660D(LHCB6)位于cqCC.C8-2置信區(qū)間,這3個候選基因和光合系統(tǒng)II的蛋白合成緊密相關(guān);如BnaA09g48920D和BnaC08g43200D(PSAO)位于cqCC.A9-2、cqCC.A9-3、cqCC.C8-3置信區(qū)間,PSBP-1的同源基因BnaA10g04360D位于cqCC.A10-1置信區(qū)間,BnaC06g26560D(PSBY) 位于cqCC.A7-3置信區(qū)間,BnaC06g20160D(PSBR) 和BnaC08g22200D(PSBO2) 分別位于cqCC.C6和cqCC.C8-1置信區(qū)間,BnaC01g09810D(Photosystem II reaction center PSB28 protein,PSB28)位于cqCC.C1置信區(qū)間,這些候選基因參與光合作用的電子傳遞過程。BnaA07g28860D(CRR23)位于cqCC.A7-5置信區(qū)間,BnaA01g28110D(NDF4) 位于cqCC.A1-5置信區(qū)間,這2個基因都是通過響應(yīng)電子傳遞鏈間接調(diào)控葉綠素的生物合成;BnaC06g28800D(FTSH1) 和BnaA07g27460D(STN7)位于cqCC.A7-3置信區(qū)間,BnaA01g24440D(ELIP1) 位于cqCC.A1-4置信區(qū)間,這些基因都參與光合作用過程;BnaC01g09400D(HCF164)位于cqCC.C1置信區(qū)間,BnaA03g51600D(HCF153) 和BnaC05g43320D(HCF152) 分別位于cqCC.A3-3和cqCC.C5-2置信區(qū)間,這些基因通過形成細(xì)胞色素b6f復(fù)合體蛋白來促進(jìn)光合作用中電子從質(zhì)體氫醌傳遞到質(zhì)體藍(lán)素。同時,BnaA07g11270D和BnaC08g19460D分別位于cqCC.A7-2和cqCC.C8-1區(qū)間,其同源基因SAUL1的功能為泛素蛋白連接酶活性,參與葉綠素生物合成與分解代謝的調(diào)控、葉片衰老和ABA生物合成過程。綜上所述,這些潛在候選基因通過影響光合作用中電子傳遞過程來調(diào)控光合作用效率,從而影響光合產(chǎn)物的生物合成與代謝。

在QTL定位中,鑒定到控制葉綠素含量的主效QTLcqCC.A1-4在陜西楊陵連續(xù)2年(2016年和2017年)重復(fù)檢測到,屬于冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL(圖3),該主效QTL有益于下一步控制油菜葉片葉綠素含量性狀的基因精細(xì)定位。通過候選基因鑒定和功能注釋,cqCC.A1-4置信區(qū)間包含2個候選基因BnaA01g24440D(ELIP1) 和BnaA01g25400D(PSBTN),BnaA01g24440D的擬南芥同源基因ELIP1為光系統(tǒng)II亞單位,編碼早期的光誘導(dǎo)蛋白,定位于葉綠體類囊體膜上[19]。葉綠體中類囊體膜是葉綠素捕獲和吸收光能,合成ATP和NADPH以及電子傳遞的場所,該基因表達(dá)受到抑制將減少葉綠素的生物合成以及延遲萌發(fā)種子子葉中質(zhì)體類囊體膜的發(fā)育[20],從而進(jìn)一步調(diào)控光合作用的電子傳遞和ATP合成。BnaA01g25400D(PSBTN)的擬南芥同源基因編碼光系統(tǒng)II 5kD蛋白亞基PSII-T,位于細(xì)胞色素b559亞單位Psbe附近,主要在植物光合作用中調(diào)節(jié)PSII適應(yīng)光移位或強光照。PSBTN基因功能的缺失會降低氧的釋放速率和PSII核心磷酸化水平,增加光系統(tǒng)II對光抑制和活性氧生成的敏感性[21]。因此,主效QTL的候選基因通過影響光合作用中光系統(tǒng)II的電子傳遞和光合磷酸化從而影響光合產(chǎn)物的合成。主效QTL置信區(qū)間的候選基因精細(xì)定位、圖位克隆及功能驗證是下一步的研究重點。

表3 油菜葉綠素含量QTL區(qū)間候選基因及擬南芥同源基因

圖3 油菜A01染色體上葉綠素含量QTL及QTL區(qū)間候選基因

油菜屬于異源四倍體作物,同一基因在油菜不同基因組上存在著多拷貝。通過對位于不同QTL區(qū)域的基因多拷貝進(jìn)行分析(表3),如CHLG在油菜基因組上存在2個拷貝,分別位于春性環(huán)境特異表達(dá)QTLcqCC.A9-1和冬性環(huán)境特異表達(dá)QTLcqCC.C8-1置信區(qū)間,其在葉綠素的生物合成和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中催化合成葉綠素a和葉綠素b。同樣發(fā)現(xiàn)FTSH1和UK1油菜基因組上也存在著多個拷貝,位于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTLcqCC.A7-3、冬性環(huán)境特異表達(dá)QTLcqCC.A7-4和cqCC.C6置信區(qū)間,這些基因的功能與植物光合作用密切相關(guān)。

3 討 論

葉綠素是葉綠體的重要組成部分,包括葉綠素a和葉綠素b,其以電子傳遞及共振傳遞的方式參與光合作用中的光反應(yīng)。深入了解甘藍(lán)型油菜葉綠素生物合成相關(guān)基因有助于提高植物的光合能力和進(jìn)行作物高光效育種。葉綠素含量的QTL分析是鑒定葉綠素生物合成相關(guān)基因的重要環(huán)節(jié)。在前人的研究中,與葉綠素生物合成相關(guān)的基因已經(jīng)在水稻[5]、大麥[7]、大豆[8]和甘藍(lán)[11]等作物中被鑒定到。本研究中甘藍(lán)型油菜KN DH群體的葉綠素含量在不同生態(tài)條件下差異較大,且表型頻數(shù)呈近似正態(tài)分布,表明油菜葉綠素遺傳屬于數(shù)量性狀遺傳,受到基因和種植環(huán)境的共同作用。

QTL定位是研究數(shù)量性狀的有效方法,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻、大豆、玉米、油菜等作物性狀的QTL研究。在甘藍(lán)型油菜研究中通過該方法已經(jīng)鑒定到重要性狀QTLs位點,如種子含油量[13]、產(chǎn)量[14]、 開花期[22]和黑莖病[23]等。QTL定位也是基因精細(xì)定位的前提條件,通過對一些貢獻(xiàn)率大、環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL進(jìn)行精細(xì)定位達(dá)到鑒定關(guān)鍵基因的目的。Jiang等[5]利用114個SSR標(biāo)記對水稻94個重組自交系群體從分蘗到抽穗控制葉綠素含量進(jìn)行QTL鑒定,獲得了22 個控制葉綠素含量的QTLs,并對位于第4條染色體上的qCTH4進(jìn)行精細(xì)定位;Dhanapal 等[8]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法分別鑒定到14、7和10個位點與葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素含量性狀顯著關(guān)聯(lián);Wang等[7]通過對大麥進(jìn)行熱誘導(dǎo),獲得了1個由單個核苷酸控制的熱誘導(dǎo)葉綠素缺失突變體,并對控制該突變體的葉綠素基因進(jìn)行精細(xì)定位。在蕓苔屬植物中,關(guān)于葉綠素含量性狀QTL定位的研究逐年增多。黃杰恒等[24]對甘藍(lán)型重組自交系群體種胚中的葉綠素含量利用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL分析,獲得了10個控制葉綠素含量QTLs;Ge等[25]通過對白菜F2定位群體進(jìn)行超過2年的葉綠素a和葉綠素b表型測定,并結(jié)合238個分子標(biāo)記構(gòu)建的遺傳連鎖圖進(jìn)行白菜的葉綠素a和葉綠素b的QTL分析,在8個遺傳區(qū)間鑒定到10個葉綠素QTLs,其解釋的表型變異最高達(dá)17%;Choi等[11]對白菜DH群體和RIL群體進(jìn)行了葉形性狀的QTL定位,分別鑒定到158和80個QTLs,其中QTL區(qū)域的候選基因與葉綠素的生物合成、細(xì)胞伸長和體積增大密切相關(guān)。代文東等[12]利用甘藍(lán)型紫葉油菜和綠葉油菜構(gòu)建的BC1群體進(jìn)行葉綠素含量QTL定位分析,在7條連鎖群上鑒定到8個控制葉片葉綠素含量QTLs。在這些研究中,由于定位群體小、種植年份短、不同種植生態(tài)區(qū)域少等不足,通過該群體和相應(yīng)遺傳連鎖圖進(jìn)行控制葉綠素含量的QTL定位,結(jié)果不夠全面,且QTL置信區(qū)間相對較大。

在本研究中,甘藍(lán)型油菜KN DH群體包括348份DH純系,連續(xù)多年種植群體表型較為穩(wěn)定。KN遺傳連鎖圖譜總長達(dá)3072.7 cM,共有標(biāo)記2914個,標(biāo)記之間平均遺傳距離為0.96 cM[15],種植生態(tài)區(qū)包括冬性和春性生態(tài)區(qū)域,分別連續(xù)種植3年。通過對KN群體的葉片葉綠素含量性狀進(jìn)行QTL定位,共鑒定到31個葉綠素含量一致性QTLs,包括3個環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL和28個環(huán)境特異表達(dá)QTL。冬性環(huán)境特異表達(dá)cqCC.A1-4能夠在2個年份重復(fù)檢測到,cqCC.A7-3和cqCC.A7-5在冬性環(huán)境陜西楊陵和春性環(huán)境甘肅張掖都能檢測到,屬于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)的QTL。通過對甘藍(lán)型油菜其他性狀的QTL定位研究發(fā)現(xiàn),一些QTL也能夠在多個環(huán)境檢測到,如Huang等[26]對油菜根莖潰瘍病菌進(jìn)行QTL定位,鑒定到17個與該性狀有關(guān)的QTLs,并且6個屬于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL;Shen等[27]定位到控制油菜分枝角度環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL,其中3個屬于主效QTLs;張佳南等[28]對3個年份6個不同播期的大豆生育期性狀進(jìn)行QTL定位分析,獲得的32個QTLs能夠在不同環(huán)境重復(fù)檢測到,都屬于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。本研究在A01染色體上鑒定到1個油菜葉綠素含量主效QTLcqCC.A1-4,該QTL能夠在冬性生態(tài)環(huán)境連續(xù)2年被重復(fù)檢測到。位于A07染色體上的cqCC.A7-3和cqCC.A7-5在冬性和春性生態(tài)環(huán)境都能鑒定到,屬于環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。在本研究中大部分QTL的表型變異較小,屬于微效QTL。雖然微效QTL不易通過分子標(biāo)記的加密進(jìn)行基因精細(xì)定位,然而通過生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法獲得的一些基因也可提供相關(guān)性狀新的具有價值的生物信息[29]。

通過定位群體QTL信息、遺傳連鎖圖及其參考基因組進(jìn)行比對和基因功能注釋,可獲得位于QTL區(qū)間的潛在候選基因[13,22]。如薦紅舉等[30]采用全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選到23個與擬南芥同源的基因,其中5個候選基因的功能參與葉綠素合成。同樣,通過該方法對控制葉綠素含量QTL區(qū)間候選基因進(jìn)行查找和功能注釋,鑒定到甘藍(lán)型油菜基因的擬南芥同源基因CHLI1、PORA、CAO(CHLOROPHYLLAOXYGENASE)、CHLG、AtWSCP、NPQ4、ACD1-LIKE、TIC55-II、NYE1、SAUL1、LHCA3、LHCA6、LHCB3、LHCB5和LHCB6,其功能主要涉及葉綠素的生物合成與降解、光合作用調(diào)控等路徑。此外,通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)部分候選基因在不同染色體上具有多個拷貝,如CHLG存在于油菜A09 和C08染色體上,功能涉及植物葉綠素的生物合成和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中葉綠素a和葉綠素b的催化,FTSH1和UK1都存在于油菜A7 和C6染色體上,涉及植物的光合作用。同樣,Li等[22]對甘藍(lán)型油菜開花期QTL進(jìn)行候選基因鑒定時,也發(fā)現(xiàn)少量候選基因在基因組中存在多拷貝。由于位于不同染色體上同一基因的不同拷貝可能存在著功能上的差異,從而會增加葉綠素含量調(diào)控機理研究的難度。

QTL區(qū)域的候選基因(CHLI1、PORA、CAO和CHLG)在控制葉綠素含量中起到重要調(diào)控作用。cqCC.C1置信區(qū)間的候選基因CHLI1主要是在葉綠素生物合成過程中將Mg2+插入到原卟啉IX[34],cqCC.A10-1置信區(qū)間的CAO主要是將葉綠素a催化為葉綠素b[32];PORA位于cqCC.A10-1的置信區(qū)間,其功能是將原葉綠素內(nèi)酯催化為葉綠素a[33];環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)cqCC.A7-3和春性環(huán)境特異表達(dá)cqCC.A7-4置信區(qū)間的AtWSCP涉及葉綠素生物合成過程中的關(guān)鍵基因[34]。特別是ELIP1和PSBTN位于主效QTLcqCC.A1-4置信區(qū)間,這2個候選基因調(diào)控了類囊體膜的發(fā)育,從而提高植物在強光照環(huán)境的適應(yīng)性以及光的移位,導(dǎo)致光合作用的影響[20-21]。QTL候選基因的鑒定與功能注釋對于下一步油菜葉片葉綠素含量的遺傳改良、基因功能驗證和特異種質(zhì)資源的培育具有重要作用。

4 結(jié) 論

甘藍(lán)型油菜葉綠素含量的廣義遺傳力在春性環(huán)境較高,而在冬性環(huán)境相對較低,表現(xiàn)出油菜葉綠素含量在春性環(huán)境較為穩(wěn)定。油菜葉綠素含量性狀符合數(shù)量性狀遺傳的特點,受到多基因的調(diào)控和種植環(huán)境的影響。油菜葉綠素含量的31個consensus QTLs,其中cqCC.A1-4在冬性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá),屬于油菜葉綠素含量主效QTL;cqCC.A7-3和cqCC.A7-5為冬性和春性環(huán)境穩(wěn)定表達(dá)QTL。在甘藍(lán)型油菜葉綠素含量QTL置信區(qū)間鑒定到66個候選基因,包括BnaA01g14880D(ACD1-LIKE)、BnaA07g29990D(AtWSCP)、BnaA01g22670D(LHCA3)、BnaC08g43200D(PSAO)、BnaC06g28800D(FTSH1) 和BnaC08g19460D(SAUL1)等,其功能涉及葉綠素的生物合成和降解、光合作用中的光信號和植物激素信號等。在候選基因中,部分基因存在多拷貝,如CHLG和AtWSCP在葉綠素含量的QTL區(qū)間存在2個拷貝,FTSH1和UK1在油菜葉綠素含量的QTL區(qū)間存在3個拷貝,葉綠素基因多拷貝也增加了葉綠素調(diào)控的復(fù)雜性。甘藍(lán)型油菜控制葉片葉綠素含量主效QTL可為下一步葉綠素含量基因的精細(xì)定位、基因克隆以及培育高光效油菜品種提供重要基因資源和參考依據(jù)。