不同配伍比例“黃芪-黃連”藥對干預(yù)對2型糖尿病胰島β、α細胞的影響

李 捷,鄭雅峰,徐云生

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250014;2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,山東 濟南 250001)

2021年國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示,目前全球確診成年糖尿病已有5.366億人,預(yù)估到2045年將上升至7.837億,其中中國患者有1.409億,發(fā)病人數(shù)位居世界首位[1]。2型糖尿病占全部糖尿病的90%以上,其防治形勢十分嚴峻,給患者個人、家庭和社會都帶來了巨大經(jīng)濟負擔(dān)。作為影響國民健康的重大慢性非傳染性疾病,2型糖尿病的防控研究是國務(wù)院《中國防治慢性病中長期規(guī)劃(2017-2025年)》和科技部重大專項重點支持的研究項目。2型糖尿病的病理基礎(chǔ)為胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗(IR)。胰島細胞主要為胰島β、α細胞,兩者維持動態(tài)平衡。其中胰島β細胞維持正常形態(tài)和數(shù)量是機體分泌足夠胰島素的必要條件,其功能受損主要表現(xiàn)為β細胞分泌胰島素的功能下降和細胞數(shù)量的減少,進而導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[2]。胰島α細胞約占所有胰島細胞的20%,分泌胰高血糖素,具有很強的促進糖原分解和糖異生作用,可使機體血糖明顯升高。2型糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇,為中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢病種,基本病機為陰津虧損、燥熱偏盛,“熱毒”是關(guān)鍵病因之一[3-4]。結(jié)合“脾脆善病消癉”“脾虛致消”的主流觀點,2型糖尿病的治則應(yīng)以健脾益氣清熱為主。黃芪味甘、性微溫,可健脾氣,助運化,斂脾精,止消渴;黃連味苦、性寒,可清熱燥濕解毒,清脾胃伏火。黃芪、黃連配伍,寒溫并用,共奏健脾益氣清熱之效,臨床上治療2型糖尿病療效確切[5-7],但目前對其不同配伍比例來治療2型糖尿病的相關(guān)研究鮮有報道。本研究以2型糖尿病雄性大鼠為研究對象,觀察不同比例黃芪-黃連配伍對大鼠胰島β、α細胞影響,以期為臨床應(yīng)用“黃芪-黃連”藥對治療2型糖尿病提供理論支撐和實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 40只SPF級4周齡Wistar雄性大鼠,體重(130±10)g,購自北京維通利華公司,動物許可證編號:SCXK2016-0006。所有大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物屏障中心,自由攝食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。本實驗嚴格按照國家實驗動物福利倫理的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2主要藥物和試劑 黃芪、黃連使用道地藥材,為甘肅產(chǎn)品,購自山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院專家鑒定符合《中國藥典》相應(yīng)要求。按照大鼠與成人體表面積換算法,取“黃芪-黃連”1∶1配伍比例(黃芪30 g、黃連30 g)、“黃芪-黃連”3∶1配伍比例(黃芪45 g、黃連15 g)藥材煎煮,中藥均先浸泡1 h,水煎2次(每次煮沸30 min),合并2次煎液,4層紗布過濾,濃縮至1 g/mL,放置室溫備用。拜糖蘋(阿卡波糖片,德國拜耳,國藥準字H19990205,規(guī)格:50 mg/片);鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma,批號:18883-66-4);胰島素一抗(批號:GB13121,中國Servicebio);胰高血糖素一抗(批號:GB13097,中國Servicebio);大鼠胰高血糖素酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批號:CSB-E12800r,中國武漢華美);高糖高脂飼料(批號:19093212,中國北京科澳協(xié)力);檸檬酸鈉(批號:2018010203,中國天津致遠);檸檬酸(批號:2018-09-16,中國天津鼎盛鑫)。

1.3主要儀器 Axio Vert.熒光顯微鏡,德國Zeiss公司;ST8型離心機,美國Thermo Scientific公司;穩(wěn)豪型血糖儀及配套血糖試紙,美國強生公司;ME235P電子分析天平,德國賽多利斯公司;-80℃超低溫冰箱,日本SANYO公司;OLYMPUSAU2700全自動血生化儀,日本OLYMPUS公司;石蠟切片機及石蠟包埋機,德國LEICA公司;Multiskan GO 1510酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific公司;Eppendorf5424R低溫高速冷凍離心機,美國Eppendorf5424R公司;NanoDrop One分光光度計,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4實驗方法 隨機選6只大鼠作為空白組,余大鼠給予12周高糖高脂飼料(67%大小鼠維持飼料+20.0%蔗糖+10.0%豬油+2.5%膽酸鈉+2.5%膽固醇)喂養(yǎng)以誘導(dǎo)IR,隨后禁食12 h后稱重,腹腔注射35 mg/kg STZ。72 h后大鼠尾靜脈取血,采用羅氏血糖儀測量空腹血糖,非同日測得3次均≥16.7 mmol/L認定為2型糖尿病造模成功。剔除1只體重驟降和1只不成模的大鼠,將造模成功的大鼠隨機分為模型組、“黃芪-黃連”1∶1組、“黃芪-黃連”3∶1組、拜糖蘋組,每組8只。根據(jù)《人和動物間按體表面積折算的等效劑量》計算得出給藥劑量,“黃芪-黃連”1∶1組給予黃芪、黃連各30 g水煎液灌胃,“黃芪-黃連”3∶1組給予黃芪45 g、黃連15 g水煎液灌胃,拜糖蘋組給予拜糖蘋60 mg/(kg·d)懸液灌胃,空白組和模型組給予等量蒸餾水灌胃,均1次/d,干預(yù)8周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠一般狀態(tài) 觀察記錄各組大鼠造模后及灌胃干預(yù)后精神狀態(tài)、活動、飲水、飲食等情況。

1.5.2空腹血糖、糖化血紅蛋白及血清胰高血糖素水平 實驗結(jié)束后各組大鼠禁食,采用戊巴比妥鈉麻醉,無菌條件下解剖,腹主動脈取血5 mL,離心取上層血清,檢測空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰高血糖素水平。

1.5.3免疫熒光雙染觀察胰島β、α細胞分布情況及β/α細胞比值 大鼠取血后,無菌條件下取出適量胰腺組織,制備石蠟切片,常規(guī)預(yù)處理后進行抗原修復(fù),加入自發(fā)熒光淬滅劑,血清白蛋白液封閉,在切片上滴加一抗(胰島素和胰高血糖素)孵育過夜,洗滌,加相應(yīng)二抗孵育,洗滌,滴加DAPI復(fù)染,使用抗熒光淬滅封片劑封片,通過生物熒光顯微鏡采集圖像(胰島素代表β細胞,胰高血糖素代表α細胞),觀察胰島β、α細胞分布情況,根據(jù)免疫熒光強度計算胰島素與胰高血糖素的比值,即β/α細胞比值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài) 與空白組比較,造模后各組大鼠精神萎靡,活動減少,毛發(fā)光澤度差且脫落嚴重,食量、飲水量、小便量明顯增加,大便質(zhì)稀。灌胃干預(yù)后,“黃芪-黃連”1∶1組、“黃芪-黃連”3∶1組、拜糖蘋組大鼠一般情況較模型組大鼠均有不同程度的好轉(zhuǎn),其中“黃芪-黃連”3∶1組大鼠一般狀況恢復(fù)最好并接近于空白組。

2.2各組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白及血清胰高血糖素水平 模型組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白及血清胰高血糖素水平均明顯高于空白組(P均<0.05); “黃芪-黃連”1∶1組、“黃芪-黃連”3∶1組、拜糖蘋組空腹血糖水平,“黃芪-黃連”3∶1組、拜糖蘋組糖化血紅蛋白水平及“黃芪-黃連”3∶1組血清胰高血糖素水平均明顯低于模型組(P均<0.05);“黃芪-黃連”1∶1組糖化血紅蛋白和“黃芪-黃連”1∶1組、拜糖蘋組血清胰高血糖素水平也有下降趨勢,但與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 空白組和2型糖尿病各組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清胰高血糖素水平

2.3各組大鼠胰腺組織β、α細胞分布情況 空白組大鼠胰島β細胞聚集在胰島中心,分布均勻且數(shù)量較多;α細胞分布以胰島細胞周邊為主,分布均勻且數(shù)量較少。與空白組相比,模型組大鼠胰島形態(tài)破壞嚴重,胰島中β細胞數(shù)量明顯減少,而α細胞數(shù)量明顯增加,且胰島內(nèi)部出現(xiàn)大量α細胞,提示胰島結(jié)構(gòu)紊亂。與模型組相比, “黃芪-黃連”1∶1組、“黃芪-黃連”3∶1組及拜糖蘋組胰島內(nèi)部β細胞數(shù)量增加,α細胞數(shù)量減少,且排列變得規(guī)則有序。見圖2。

紅色熒光為胰島素染色,代表β細胞;綠色熒光為胰高血糖素染色,代表α細胞圖2 空白組和2型糖尿病各組大鼠胰腺組織免疫熒光染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠胰腺組織β/α細胞比值 模型組β/α細胞比值明顯低于空白組(P<0.05);“黃芪-黃連”1∶1組、“黃芪-黃連”3∶1組、拜糖蘋組β/α細胞比值均明顯高于模型組(P均<0.05), “黃芪-黃連”1∶1組、“黃芪-黃連”3∶1組、拜糖蘋組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 空白組和2型糖尿病各組大鼠胰腺組織中β/α細胞比值

3 討 論

目前2型糖尿病患者臨床表現(xiàn)大多沒有“三多一少”的明顯癥狀,而以體態(tài)肥胖(尤其腹型肥胖)、神疲乏力、不耐勞作等為主要表現(xiàn)。綜觀現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對2型糖尿病的理論認識并結(jié)合中醫(yī)臨床診療經(jīng)驗,筆者導(dǎo)師徐云生教授(岐黃學(xué)者)提出2型糖尿病核心病機特點為脾虛濕熱,認為2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及其并發(fā)癥與脾胃的功能失調(diào)有密切關(guān)系,其治療關(guān)鍵為健脾啟樞清熱,恢復(fù)中焦氣機的升降。

黃芪、黃連配伍具有良好的健脾氣、清濕熱之效,二者分別及協(xié)同治療2型糖尿病的相關(guān)研究已有文獻報道。本項目組前期應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合基礎(chǔ)實驗初步明確了黃芪、黃連干預(yù)2型糖尿病的有效活性成分、作用靶點、參與的生物學(xué)過程及相關(guān)信號通路,其中黃芪可通過調(diào)控13個關(guān)鍵靶點(EGFR、KDR、SRC、ERBB2、FYN、ESR1、AR、HSP90AA1、PTGS2、ABCG2、AB1、MMP2、CYP1),提高酪蛋白激酶活性、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、增強IR等途徑來調(diào)控胰島素信號通路,從而發(fā)揮治療2型糖尿病的作用[8];黃連抗2型糖尿病過程中最顯著的核心靶點為IL6、VEGFA和TNF,分子對接研究表明IL6、VEGFA和TNF能與黃連的所有活性化合物穩(wěn)定結(jié)合,細胞實驗結(jié)果進一步證實黃連可抑制IL-6和TNF-α的表達,增強胰島細胞活力[9]。虞艷瑋等[10]建立IR-HepG2細胞模型,加入“黃芪-黃連”含藥血清進行觀察,結(jié)果表明“黃芪-黃連”配伍可有效降低HepG2細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)mRNA表達水平。Mao等[11]研究也證實黃芪多糖和小檗堿聯(lián)合應(yīng)用可通過調(diào)節(jié)糖異生信號通路來減輕HepG2細胞的IR。Li等[12]采用16S rRNA基因測序技術(shù)檢測驗證黃芪可降低2型糖尿病小鼠血糖與體重,顯著增加小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性,顯著誘導(dǎo)乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度增加。一項基于醫(yī)院的回顧性隊列研究表明,黃連顆粒治療2型糖尿病的有效劑量為0.08 g/(kg·d),可明顯降低患者血糖及三酰甘油、總膽固醇水平,且安全性良好[13]。Guo 等[14]研究顯示黃連全組分顆?？山档透咧嬍痴T導(dǎo)的糖尿病大鼠血清單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)水平及腎核因子-κB (NF-κB)表達水平。He等[15]實驗證實黃連中的梔子堿對db/db小鼠具有抗肥胖、提高胰島素敏感性的作用,可顯著降低db/db小鼠體重、血脂水平和附睪脂肪重量;組織切片結(jié)果顯示,該藥能顯著改善肝臟脂質(zhì)代謝。但是目前關(guān)于黃芪、黃連不同配伍比例治療2型糖尿病的研究很少。本研究結(jié)果顯示,“黃芪-黃連”3∶1組大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清胰高血糖素水平及“黃芪-黃連”1∶1組空腹血糖水平均明顯低于模型組,提示“黃芪-黃連”配伍比例為3∶1時療效更佳,推測是由于黃芪可以健運脾氣,而黃連比例過大時對機體來說過于苦寒傷及脾胃的緣故,這也進一步驗證了顧護脾氣在臨床上治療2型糖尿病的重要性。免疫熒光檢測顯示,模型組大鼠胰島中標(biāo)記胰高血糖素的熒光強度顯著增強,標(biāo)記胰島素的熒光強度明顯減弱,β、α細胞排列紊亂,比例失衡;“黃芪-黃連”兩種配伍比例的中藥水煎液干預(yù)8周后,大鼠胰島中標(biāo)記胰高血糖素的熒光強度明顯減弱,標(biāo)記胰島素的熒光強度明顯增強,β、α細胞恢復(fù)正常的排列順序和比例,提示“黃芪-黃連”兩種配伍比例均能夠改善β、α細胞的失衡狀態(tài),恢復(fù)胰島細胞功能,不同配伍比例未顯示出明顯差異,推測為干預(yù)時間過短的原因。今后將進一步完善相關(guān)研究,探討黃芪、黃連配伍調(diào)節(jié)胰島功能的具體機制,為中醫(yī)藥臨床治療2型糖尿病提供更加科學(xué)有力的證據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。