快速免疫熒光染色技術(shù)在肺部感染性疾病中的應(yīng)用

景竹春 陳寧 羅煥超

【摘要】? 目的? ? 探討快速免疫熒光染色技術(shù)在肺部炎癥性病變病原體鑒別診斷中的應(yīng)用價值。方法? ? 對明確病原微生物類型的30例肺部感染性疾病患者的臨床病理資料進行回顧性分析，并結(jié)合文獻復(fù)習(xí)。結(jié)果? ? 30份支氣管肺泡灌洗液標本中，放線菌5例，肺炎鏈球菌2例，念珠菌8例，曲霉菌4例，毛霉菌8例，隱球菌1例，抗酸分枝桿菌2例。鏡下形態(tài)：放線菌呈放射狀，硫磺顆粒樣；肺炎鏈球菌，呈雙球菌，矛頭狀，可表現(xiàn)為單個或短鏈狀；念珠菌為有隔且分枝不規(guī)則的假菌絲，厚膜孢子是其特征；曲霉菌絲呈有隔且有45°分枝狀，分生孢子頭是其特征；毛霉菌菌絲呈無隔或少隔且有90°分枝狀，球形孢子囊是其特征；抗酸分枝桿菌，特征是抗酸性，細菌形態(tài)呈金黃色，細長，略彎曲狀。結(jié)論? ? 快速免疫熒光染色檢測技術(shù)能快速準確區(qū)分病原微生物種類，在肺部炎性疾病的精準治療及早期治療中均有一定的應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】? 肺部炎癥性疾?。豢焖倜庖邿晒馊旧?；真菌；菌絲

中圖分類號：R446.51? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）11-0101-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.034

肺部感染性疾病主要病原微生物有細菌、病毒或真菌，對慢性感染的炎性疾病，特別是缺乏特異的臨床表現(xiàn)而且在影像學(xué)上表現(xiàn)為腫塊的肺部疾病，明確病因，及時治療，對改善預(yù)后尤為重要。本文探討了免疫熒光染色檢測技術(shù)在明確肺部感染性疾病病原微生物中的應(yīng)用價值。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 材料? ? 2021年9月—2022年5月期間就診于北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科的肺部感染性疾病患者30例，臨床表現(xiàn)為非急性感染，影像學(xué)上顯示肺部腫塊，留取支氣管肺泡灌洗液并送檢，病理診斷報告中明確給出微生物分類。

1.2? ? 儀器與試劑? ? Nikon 80i普通顯微鏡、熒光模塊、免疫顯色試劑Ⅰ型、組織細胞熒光染色試劑和拭子均購于江蘇諾鬲生物科技有限公司，載玻片和蓋玻片購于廣鑫生物工程公司。

1.3? ? 方法

1.3.1? ? 制片? ? 將新鮮的支氣管肺泡灌洗液標本使用離心機3 000 r/ min離心5 min后，取出倒掉上清液，用棉拭子蘸取試管底部富集物沉渣的細胞，在載玻片下1/3處涂抹，采用旋轉(zhuǎn)推動形成同心圓狀的細胞層，將制好的玻璃片置于烤片機上烤2 min。一共制3張玻璃片備用。

1.3.2? ? 染色? ? 細菌染色方法：取1張載玻片，采用滴染的方法，滴加1滴紫紅色的免疫顯色試劑Ⅰ型試劑于玻璃片的細胞層上，輕微晃動，保證試劑與樣品充分混合，染色持續(xù)30 s，用蓋玻片封片。

組織細胞染色方法：取第2張玻片，選組織細胞熒光染色試劑A液，滴加1滴，晃動使染色液淹沒整個樣本，持續(xù)30 s后傾倒，然后選組織細胞熒光染色試劑B液，滴加1滴，染色30 s后傾倒，用蓋玻片封片。

抗酸分枝桿菌染色方法：取第3張載玻片，選抗酸分枝桿菌熒光染液A液，滴加一滴，染色15 min后傾倒，用滴管沖洗，然后選用抗酸分枝桿菌熒光染液B液（脫色液），滴加一滴，1 min后用純水清洗，蓋玻片封片。

1.3.3? ? 鏡下觀察? ? B波段用于觀察細菌，細菌呈桔黃色。U/V波段用于觀察真菌和抗酸分枝桿菌，真菌的菌絲和孢子呈略透亮的淡藍色，抗酸分枝桿菌呈桔黃色或金黃色。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 微生物分類? ? 30份支氣管肺泡灌洗液標本中，放線菌5例，肺炎鏈球菌2例，念珠菌8例，曲霉菌4例，毛霉菌8例，新型隱球菌1例，抗酸分枝桿菌2例。

2.2? ? 熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)結(jié)果? ? 放線菌：呈分枝狀的無隔菌絲，排列形成放射狀，菌絲末端膨大，硫磺顆粒樣；肺炎鏈球菌：雙球菌，矛頭狀，菌體寬端相對，尖端向外，多成雙排列，也可單個或短鏈狀；念珠菌：菌體呈圓形或橢圓形，藕節(jié)狀有橫隔的假菌絲，菌絲較細，分枝不規(guī)則，菌絲中間或頂端可見厚膜孢子，厚膜孢子是其特征（見封三圖1、圖2）；曲霉菌：菌體呈圓形，有隔菌絲，菌絲可分枝，呈45°或呈鈍角，可見其特征性的菊花樣的分生孢子頭（見封三圖3、圖4）；毛霉菌：是一種結(jié)合菌，菌體呈圓形，多為無隔菌絲，菌絲比曲霉菌和念珠菌粗大，可見分枝，呈90°或鈍角，較粗的菌絲梗上可見球形孢子囊（見封三圖5、圖6）；抗酸分枝桿菌：菌體呈金黃色、細長、略彎曲、單個、分枝狀（見封三圖7）；隱球菌：菌體為圓形或橢圓形，外周有一層肥厚的莢膜，鏡下似空暈，厚度是菌體的1～3倍（見封三圖8）。

3? ? 討論

快速現(xiàn)場細胞學(xué)評估（rapid on site evolution，ROSE）技術(shù)是運用細胞學(xué)的快速診斷特點，將現(xiàn)場所取得的標本制片后鏡下觀察，形成診斷意見。近幾年來，由于各種微創(chuàng)技術(shù)，如支氣管鏡技術(shù)、經(jīng)支氣管鏡超聲技術(shù)、電磁導(dǎo)航支氣管鏡技術(shù)等的飛速發(fā)展，快速現(xiàn)場細胞學(xué)評估技術(shù)又重新回歸到臨床，成為介入呼吸病學(xué)的主要技術(shù)之一。ROSE技術(shù)主要包括兩大部分：快速現(xiàn)場細胞學(xué)評價（C-ROSE），快速現(xiàn)場微生物學(xué)評價（M-ROSE）。目前，C-ROSE技術(shù)應(yīng)用比較廣泛，主要臨床應(yīng)用是指導(dǎo)肺部疾病的診斷，評估肺部疾病的治療效果，判斷介入呼吸道疾病的治療效果，指導(dǎo)中央型肺癌患者治療后的隨訪?？焖佻F(xiàn)場微生物學(xué)評價（M-ROSE）也有相當重要的意義，如提供病原微生物的形態(tài)學(xué)意見，同一部位可多次重復(fù)取樣并送檢，還可對療效進行評估[1]。有研究表明，現(xiàn)場細胞學(xué)評估在肺穿剌活檢中能指導(dǎo)醫(yī)生取材，提高活檢成功率[2]；在CT引導(dǎo)下肺穿刺結(jié)合現(xiàn)場細胞學(xué)評估技術(shù)，診斷準確率達89.66%[3]；現(xiàn)場細胞學(xué)評估聯(lián)合超聲支氣管鏡技術(shù)，對腫大淋巴結(jié)或病灶穿剌獲取的針吸細胞學(xué)標本評估，發(fā)現(xiàn)細胞學(xué)可疑查見惡性腫瘤細胞的陽性率為78.8%，作為金標準的組織學(xué)活檢確診惡性腫瘤陽性率為66.7%，二者相比無統(tǒng)計學(xué)差異。二者聯(lián)合能減少穿刺數(shù)量，降低穿剌引起并發(fā)癥的發(fā)生率，縮短操作時間。細胞學(xué)標本制片后，根據(jù)需要有以下快速染色方法：改良瑞氏染色、改良乳酸染色、改良的快速巴氏染色、甲苯胺藍染色、支原體DNA霍氏熒光染色、金-羅耐酸菌熒光染色、試劑盒化快速革蘭染色等?，F(xiàn)場細胞學(xué)的染色方法之一快速熒光染色法，主要用于真菌的檢查，能快速檢測人體樣本中的真菌細胞壁多糖，臨床上用于淺部真菌和深部真菌感染的診斷。由于M-ROSE技術(shù)良好的特異性和敏感性，需求范圍在不斷增加，如皮膚真菌疾病、耳鼻咽喉炎性疾病、肺部感染性疾病等，均需要明確微生物種類，比如，要區(qū)分細菌或真菌或抗酸分枝桿菌，明確病原體類型，才能選擇最佳的治療方案。在彌散性外耳道炎和中耳炎的病原學(xué)診斷中應(yīng)用廣泛，外耳道感染中最多見的是曲霉菌，其次是毛霉菌和念珠菌，熒光顯微鏡下見典型的具有鑒別診斷意義的孢子，如曲霉菌的分生孢子頭，毛霉菌的球孢子囊，念珠菌的厚膜孢子等可對微生物進行分類。在抗酸分枝桿菌檢測方面，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)免疫熒光染色法有較好的應(yīng)用，楊江華等[4]研究發(fā)現(xiàn)，29例痰涂片抗酸染色結(jié)果為陰性者，重復(fù)制片用快速免疫熒光法染色后再次鏡檢，發(fā)現(xiàn)有15例為抗酸分枝桿菌陽性，表明免疫熒光染色法在結(jié)核分枝桿菌中能提高痰液中陰性肺結(jié)核的診斷率。劉銀萍等[5]研究結(jié)果顯示，在痰液標本抗酸分枝桿菌檢測中，快速免疫熒光染色法的檢出率為25.7%，而萋-尼染色法為13.8%，兩者比較差異顯著（P<0.05）。表明快速免疫熒光染色法能提高抗酸分支桿菌的陽性檢出率?，F(xiàn)場微生物學(xué)評估不僅在呼吸病學(xué)中有良好的應(yīng)用價值，在甲狀腺疾病、尿路惡性腫瘤診斷、陰道分泌物病原體檢測及胃黏膜活檢中也得到了重視。尹小毛等對39例陰道炎性疾病的病原體檢測研究中發(fā)現(xiàn)[6]，用濕片法和免疫熒光染色法對比，前者檢出線索細胞（加德納菌感染）15例，后者檢出9例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；兩種方法在念珠菌檢測中的檢出率分別為38.46%和35.9%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。說明在陰道炎的病原微生物加德納菌和念珠菌的檢查中，可以應(yīng)用快速免疫熒光法。

目前，肺部疾病通常是經(jīng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，腫瘤及肺炎占60.0%[7]。腫瘤及肺炎性病變的影像學(xué)表現(xiàn)相似，明確性質(zhì)對治療方案選擇很重要。肺部疾病的細胞學(xué)診斷在整體細胞學(xué)診斷中占有重要的地位，根據(jù)獲取標本的方法不同，主要分兩類。一類為脫落細胞學(xué)標本，包括痰液、胸水、心包積液、支氣管鏡刷檢、支氣管灌洗和支氣管肺泡灌洗液，另一類為細針穿刺標本。細胞病理學(xué)檢查，不僅能明確疾病是腫瘤還是炎癥，在炎癥性疾病的診斷中也有重要作用，尤其是鑒別化膿性感染如肺炎鏈球菌和特異性感染疾病如結(jié)核及常見真菌感染等。病原微生物主要分非細胞型微生物，如病毒；原核細胞型微生物，如細菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、放線菌；真核細胞型微生物，如真菌。細菌是原核生物界的一種單細胞微生物，按外形分球菌、桿菌、螺形菌，球菌分為葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、奈瑟菌屬。分枝桿菌屬分為結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌，分枝桿菌屬的共同特點是細胞壁中含有大量脂質(zhì)，細菌難以被一般染料染色，需用助染劑并加溫使之著色，著色后又不宜以含有3%鹽酸的乙醇脫色，故也稱抗酸桿菌。真菌按形態(tài)結(jié)構(gòu)分為單細胞真菌和多細胞真菌。單細胞真菌，圓形或卵圓形，如酵母型和類酵母型真菌，酵母型真菌不產(chǎn)生菌絲，由母細胞以芽生方式繁殖；類酵母型真菌母細胞以芽生方式繁殖出芽，產(chǎn)生的芽生孢子持續(xù)延長，但不斷裂不與母細胞脫離，產(chǎn)生相互連接成藕節(jié)狀較長的細胞鏈，稱假菌絲[8]。多細胞真菌包括曲霉菌、毛霉菌、新型隱球菌等。病原微生物感染后要用抗生素治療，不同種類的微生物有不同的敏感藥物。鏈球菌引起的炎癥可選用青霉素G，新型隱球菌感染可以兩性霉素B與氟胞嘧啶聯(lián)合用藥，念珠菌的全身用藥主要是兩性霉素B、酮康唑、米卡芬凈，曲霉菌病治療主要是兩性霉素B與曲康唑[9]，因此明確病原微生物種類可以指導(dǎo)臨床用藥。

熒光素標記抗體直接與病原體結(jié)合后顯色，具備免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重優(yōu)點，熒光顯微鏡下形態(tài)觀察，可區(qū)分細菌與真菌。本研究中發(fā)現(xiàn)的細菌有放線菌，放線菌正常寄居在人和動物的口腔、上呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道，對人類致病性較強的是衣氏放線菌，可引起內(nèi)源性感染。肺部放線菌多發(fā)生于農(nóng)村，常見于免疫功能低下者。放線菌呈絲狀，常形成無隔菌絲，需要與真菌鑒別。另外，由于放線菌具有弱抗酸性，需與抗酸分枝桿菌鑒別。實際工作中，延長鹽酸酒精脫色時間，使放線菌變?yōu)榭顾彡幮?。抗酸分枝桿菌在本研究中也發(fā)現(xiàn)2例，熒光染色后顯金黃色。需要注意的是，結(jié)核分枝桿菌易通過飛沫傳播，標本制片過程中需要滅活。有兩種方法：（1）結(jié)核分枝桿菌在75%乙醇內(nèi)數(shù)分鐘即死亡，因此可在制片后放入5 min來滅菌，（2）結(jié)核分枝桿菌對熱敏感，可通過加熱方法滅菌。肺細菌感染中肺炎鏈球菌常見，其寄居于正常人的鼻咽腔中，多數(shù)不致病，僅少數(shù)有致病力。肺炎鏈球菌與A群鏈球菌形態(tài)上都是球菌，兩者的鑒別點主要是：A群鏈球菌由球形或橢圓形的菌體連接而成，表現(xiàn)為長短不一的鏈狀；肺炎鏈球菌的菌體呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外，多數(shù)表現(xiàn)為雙球菌，成雙排列，但在肺組織病變中可呈短鏈狀。近年來，隨著大劑量腎上腺皮質(zhì)激素、細胞毒性免疫抑制劑、導(dǎo)管插管、器官移植化療以及介入治療等新診療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，加上長期大量濫用廣譜抗生素、嚴重的基礎(chǔ)疾病、艾滋病、糖尿病、腫瘤等易感人群的增多，念珠菌病發(fā)病率呈明顯上升趨勢。念珠菌至少有20余種可致人類疾病，廣泛存在于自然界的土壤、醫(yī)院環(huán)境、各種物品表面及水果中。同時，在人體皮膚、口腔、胃腸道和陰道等處也能分離出來。念珠菌病的臨床表現(xiàn)無特異性，較難與細菌感染相鑒別，可發(fā)生局部感染及深部感染，局部以皮膚、黏膜感染為主，如口腔念珠菌病、念珠菌性唇炎、念珠菌性口角、念珠菌性陰道炎、念珠菌性包皮炎；深部感染如呼吸系統(tǒng)念珠菌病、消化系統(tǒng)念珠菌病、食管和腸道感染、泌尿系念珠菌病、念珠菌菌血癥、念珠菌性心內(nèi)膜炎、念珠菌性腦膜炎等，一旦發(fā)生這些深部的侵襲性念珠菌病，病死率很高，一般成人15%～25%，最高達47%，新生兒及兒童略低，大約10%～15%。念珠菌為單細胞類酵母型真菌，菌體呈圓形或卵圓形，直徑4～6μm，芽生方式繁殖，細菌體能發(fā)育伸長成細絲狀的假菌絲，有橫隔，不規(guī)則的分枝，可見芽生孢子和厚膜孢子，厚膜孢子是其特征之一。本文研究中發(fā)現(xiàn)曲霉菌引起的肺炎4例。最常見的曲霉菌是煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉，曲霉屬于絲狀真菌，是條件性致病真菌，通過氣道吸入大量孢子后，如機體不能及時清除，則會導(dǎo)致曲霉病，主要表現(xiàn)為侵襲性感染和變態(tài)反應(yīng)綜合征。發(fā)病原理是孢子在宿主體內(nèi)發(fā)育為菌絲后，細菌體的致病因子成分得以暴露，巨噬細胞可識別這些成分并分泌炎癥介質(zhì)，引發(fā)炎癥。曲霉菌可引起過敏、肺部感染、皮膚感染和肺外傳播，最常累及的部位是支氣管和肺臟，還可侵犯鼻竇和皮膚。消化系統(tǒng)也可受累，以肝臟受累最為多見，其次是小腸、胃、食管、舌。曲霉菌為多細胞真菌，芽管方式繁殖，菌絲有橫隔，分枝呈45°或鈍角，分生孢子梗的頂端或側(cè)面可形成分生孢子，呈菊花狀。毛霉菌病起始病灶常位于鼻腔，很快擴散到鼻竇和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，再擴散到肺和胃腸道。毛霉菌屬結(jié)合菌門，結(jié)合孢子，菌絲寬大，無橫隔或少橫隔，分枝呈90°或鈍角，菌絲末端形成一種囊狀結(jié)構(gòu)叫球孢子囊，倒置的燒瓶狀。在肺泡灌洗液標本中發(fā)現(xiàn)1例新型隱球菌感染引起的肺炎。新型隱球菌是隱球菌屬中唯一致病的真菌，人體通常是通過吸入環(huán)境中氣溶膠化的新型隱球菌孢子而感染，病原體主要存在于鴿糞、水果和土壤中，但在健康人的皮膚、黏膜和糞便中也可分離出。新型隱球菌引起的深部真菌病可累及腦膜、肺、皮膚、骨骼和血液等器官和部位，隱球菌性腦膜炎為最常見的臨床類型。新型隱球菌的形態(tài)呈圓形或卵圓形，直徑為5～10 μm，外周圍繞著一層寬厚的多層莢膜，為主要的毒力因子。新型隱球菌可用免疫熒光染色方法查找，也可用墨汁涂片直接鏡檢，發(fā)現(xiàn)出芽的酵母樣菌，外周有透亮的厚壁莢膜。還有一種方法是用黏蛋白胭脂紅染色，酵母樣菌的莢膜呈深玫瑰紅色。本文采用免疫熒光染色法查見的新型隱球菌體為圓形或橢圓形，外周有一層肥厚的莢膜，鏡下似空暈，厚度是菌體的1～3倍，比較典型。本研究發(fā)現(xiàn)肺部感染性疾病中真菌主要類型是念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、新型隱球菌，沒有發(fā)現(xiàn)其他真菌如肺球孢子菌、組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉菌和耶氏肺孢子菌等引起的肺炎；可能是這些真菌性肺炎多發(fā)生于免疫缺陷患者或者南方或野外工作者，該院就診的患者上述人群罕見，所以沒有發(fā)現(xiàn)這些類型的真菌。

真菌和細菌的檢查方法有多種，如痰培養(yǎng)，直接鏡檢，活檢組織切片查找。細菌培養(yǎng)可以出現(xiàn)假陽性或者假陰性，通常培養(yǎng)陽性率只有10%～30%。染色方法也有多種，如HE、PAS法、六胺銀染色法和快速免疫熒光染色法[10]。真菌用HE方法時，染色著色不佳；PAS和六胺銀特染可用來顯示念珠菌、新型隱球菌、曲霉菌、毛霉菌和放線菌等，效果較佳，但是網(wǎng)狀纖維和纖維素也被著色，在診斷中易與真菌混淆。丁如[11]的研究指出，真菌快速熒光染色法的優(yōu)點是快速性、專一性、實用性、高靈敏性。肺孢子菌肺炎是耶氏肺孢子菌引起的一種機會性感染，多發(fā)生在免疫功能缺陷綜合征的人群。有研究者發(fā)現(xiàn)[12]，流式細胞術(shù)可用于耶氏肺孢子菌檢測，敏感性和特異性可達100%。流式細胞術(shù)是近年來發(fā)展的新技術(shù)，但是不足之處是價格高，耗時長，操作復(fù)雜，技術(shù)含量高，臨床推廣困難。在病原微生物診斷中，可聯(lián)合應(yīng)用快速免疫熒光法結(jié)合PCR、流式細胞術(shù)、基因序列分析等幾種高新技術(shù)。

快速免疫熒光染色技術(shù)利用熒光素特異性標記細菌多糖抗原，形成強的熒光復(fù)合物，在熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)，快速有效鑒別病變性質(zhì)是腫瘤還是病原微生物感染，并且根據(jù)形態(tài)能進一步明確細菌和真菌的具體類型。本研究證明快速免疫熒光染色方法能良好地顯示細菌和真菌的形態(tài)，有較高的臨床應(yīng)用價值。目前存在的問題是，病理學(xué)者對微生物學(xué)欠重視，細胞學(xué)專家更愿意致力于細胞學(xué)評估，在微生物評估中投入精力不足，對微生物學(xué)的基本知識了解不夠，判斷分析微生物形態(tài)缺少嚴密的邏輯能力。因此，在現(xiàn)實工作中，要提升細菌、真菌等病原菌形態(tài)學(xué)認識水平，同時結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)資料、流行病學(xué)史等，綜合分析作出正確的判斷?？傊?，相較其他檢測方法，快速免疫熒光法制片簡單，30 min內(nèi)可出結(jié)果，鏡下形態(tài)特點易掌握，而且有極高的靈敏度和特異性，無假陽性，值得在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2023-01-26）