蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

宋起萱 浦艷飛 余蓉培 瞿素萍 楊春梅 吳麗芳 汪國(guó)鮮 阮繼偉

摘要：建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，簡(jiǎn)稱CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，簡(jiǎn)稱ORSV）是蝴蝶蘭生產(chǎn)中的主要病毒病害，建立穩(wěn)定、靈敏的檢測(cè)體系是進(jìn)行病毒早期檢測(cè)和脫毒技術(shù)研究的前提。本研究首先對(duì)CymMV和ORSV 的外殼蛋白（coat protein，簡(jiǎn)稱CP）基因片段進(jìn)行克隆和序列比對(duì)，隨后設(shè)計(jì)特異性引物，分別構(gòu)建2種病毒的RT-qPCR（real time quantitative PCR，簡(jiǎn)稱RT-qPC）檢測(cè)體系，并對(duì)云南地區(qū)20份樣品進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，CymMV和ORSV CP基因序列與其他地區(qū)分離物中這2種病毒的核苷酸序列相似性分別為97.92%～98.66%和99.12%～99.56%，其CP基因序列具有保守性。CymMV和ORSV在RT-qPCR體系中最低檢出濃度分別為30.9、35.0 copies/μL，靈敏度較RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱 RT-PCR）提高10倍。利用RT-qPCR體系對(duì)20份溫室樣品進(jìn)行檢測(cè)，CymMV陽(yáng)性率為100%，ORSV陽(yáng)性率為90%，陽(yáng)性率均高于RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。本研究構(gòu)建的CymMV和ORSV RT-qPCR檢測(cè)體系將為蝴蝶蘭病毒病早期監(jiān)測(cè)和脫毒種苗的培育奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；建蘭花葉病毒；齒蘭環(huán)斑病毒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；病毒檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S436.8+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）15-0021-08

基金項(xiàng)目：云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃（編號(hào)：202102AE090052）；云南大學(xué)專業(yè)學(xué)位研究生實(shí)踐創(chuàng)新基金（編號(hào)：ZC-22222419）。

作者簡(jiǎn)介：宋起萱（1999—），女，四川攀枝花人，碩士研究生，研究方向?yàn)橛^賞植物研究。E-mail：songqixuan0218@126.com。

通信作者：余蓉培，博士，副研究員，研究方向?yàn)橛^賞植物研究，E-mail：yrongpei@126.com；瞿素萍，碩士，研究員，研究方向?yàn)榛ɑ芙M培繁育，E-mail：qsp@yaas.org.cn。

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）是一種原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)的附生蘭科植物，形態(tài)高雅、花期較長(zhǎng)，是世界重要的花卉種類之一［1-2］。商品銷售的蝴蝶蘭多采用組織培養(yǎng)方法繁殖，長(zhǎng)期無(wú)性繁殖使得病毒積累嚴(yán)重。目前，能夠感染蘭花的病毒有50多種，其中，建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，簡(jiǎn)稱CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，簡(jiǎn)稱ORSV）是蘭花中感染較為嚴(yán)重和普遍的2種病毒［3-4］。蝴蝶蘭植株感染CymMV和ORSV后，葉片分別會(huì)出現(xiàn)黃色環(huán)斑和條紋花斑，花朵出現(xiàn)褪色，使觀賞價(jià)值極大降低，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［5］。因此，亟待建立快速準(zhǔn)確的CymMV和ORSV檢測(cè)體系，為蝴蝶蘭帶病毒植株的早期鑒定以及種苗脫毒體系的構(gòu)建提供可靠的技術(shù)保障。

CymMV和ORSV是正義單鏈RNA病毒［（+）ssRNA］［3］。CymMV隸屬于線形病毒科（Flexiviridae）馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus），病毒粒體由外殼蛋白和正義單鏈RNA基因組組成，基因組全長(zhǎng)6.3 kb，包含5個(gè)開放閱讀框（ORF），ORF5編碼24 ku外殼蛋白［6-8］。ORSV隸屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），直桿狀顆粒，病毒粒體分散在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈晶格排列，基因組全長(zhǎng)6 618 bp，具有5個(gè)ORF，ORF5編碼18 ku外殼蛋白［3，9-10］。

目前，CymMV和ORSV的檢測(cè)方法主要有電鏡法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法［11-12］。其中，分子生物學(xué)方法是從核酸水平來(lái)檢測(cè)病毒，可以進(jìn)行大批量的樣品檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［11］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱RT-qPCR）是分子生物學(xué)檢測(cè)法中一種高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)未知模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析［13］。靈敏度是RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱RT-PCR）的10～1 000 倍［14-17］。該技術(shù)在蔬菜、花卉、果樹等園藝植物病毒檢測(cè)中有廣泛應(yīng)用［18-21］。但目前對(duì)于蝴蝶蘭CymMV和ORSV的RT-qPCR檢測(cè)方法尚缺乏深入報(bào)道。

本研究分別對(duì)CymMV和ORSV外殼蛋白（coat protein，簡(jiǎn)稱CP）編碼基因設(shè)計(jì)特異性引物，克隆CP基因片段序列，構(gòu)建CymMV和ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)而分別建立CymMV和ORSV的RT-qPCR檢測(cè)體系，并應(yīng)用于云南溫室栽培蝴蝶蘭的CymMV和ORSV檢測(cè)。該體系將為蝴蝶蘭規(guī)模化生產(chǎn)中CymMV和ORSV準(zhǔn)確高效檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

使用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉研究所九溪基地保存的CymMV和ORSV感病植株作為植物材料，于2022年3月在云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CymMV和ORSV的外殼蛋白基因片段克隆。用于檢測(cè)的溫室植株亦種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所九溪基地。

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用艾德萊生物的多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒進(jìn)行蝴蝶蘭葉片總RNA提取。用ND2000-超微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度、D260 nm/280 nm，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的完整性。

使用PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix試劑盒（TaKaRa）對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在RNase Free管中加入2 μL模板RNA、2 μL Primescript IV cDNA synthesis Mix、6 μL ddH2O配制混合液?；旌弦涸?2 ℃孵育20 min后，70 ℃孵育15 min，得到cDNA溶液保存于-20 ℃冰箱中，可用于PCR和RT-qPCR。

1.3 CymMV和ORSV的CP基因片段克隆與序列分析

在NCBI上查找CymMV和ORSV的CP基因序列，使用NCBI的Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物（表1），并由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。以感染CymMV和ORSV植株的cDNA為模板，使用諾唯贊Green Taq Mix試劑盒和表1中的引物對(duì)CP基因片段克隆。反應(yīng)體系如下：0.5 μL模板cDNA，上、下游引物（10 μmol/L） 各0.5 μL，5 μL Green Taq Mix，3.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

將CymMV和ORSV的CP基因片段克隆得到的PCR產(chǎn)物使用全式金公司的Easy Pure Quick Gel Extration Kit進(jìn)行切膠回收并純化。將回收純化后的產(chǎn)物與pEASY-T3 Cloning Kit進(jìn)行載體連接，隨后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 h后，將菌液均勻涂于含有50 mg/L氨芐青霉素LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，隨后挑取單菌落于50 mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。將得到的菌液進(jìn)行PCR，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定，選取條帶明亮且正確的菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

選擇測(cè)序結(jié)果正確的菌液，使用全式金公司Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit分別提取質(zhì)粒，并放置于-20 ℃保存，將其作為CymMV和ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用。運(yùn)用公式C=A×10-9×B-1×6.02×1023（A為質(zhì)粒濃度，ng/μL；B為質(zhì)粒DNA分子量；C為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，copies/μL；6.02×1023 為摩爾分子數(shù)）計(jì)算出CymMV和ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為 3.09×1011、3.50×1011 copies/μL。

1.5 CymMV和ORSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的構(gòu)建

1.5.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)CymMV和ORSV的CP基因克隆片段測(cè)序結(jié)果，使用NCBI上的Primer-BLAST分別設(shè)計(jì)RT-qPCR引物（表2），引物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.5.2 RT-qPCR反應(yīng)體系構(gòu)建

采用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為：2.0 μL模板cDNA，上、下游引物各1.0 μL，12.5 μL TB Green Premix Ex TaqⅡ，8.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s。熔解曲線分析溫度范圍為65～95 ℃。反應(yīng)在CF-X96熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.5.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將 CymMV與ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用TaKaRa的EASY Dilution稀釋液按10倍梯度逐級(jí)稀釋，形成終濃度為105～109 copies/μL的5個(gè)梯度，分別進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3次重復(fù)，并根據(jù)結(jié)果計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 靈敏度檢測(cè)

按10倍梯度對(duì) CymMV與ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，終濃度分別為3.09×100～3.09×109 copies/μL和3.50×100～3.50×109 copies/μL，隨后以稀釋后各梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別對(duì)2種病毒進(jìn)行RT-PCR和 RT-qPCR檢測(cè)，比較2種方法的靈敏度。RT-PCR檢測(cè)所用的引物和反應(yīng)體系參照“1.3”節(jié)中CymMV和ORSV的CP基因片段克隆方法。

1.6 溫室樣品檢測(cè)

對(duì)種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所九溪基地的LL29、初戀、大辣椒和藍(lán)寶石等4個(gè)蝴蝶蘭品種，每個(gè)品種5株，共20份樣品，分別提取葉片總RNA，采用RT-PCR和RT-qPCR體系進(jìn)行CymMV和ORSV病毒檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CymMV、ORSV的CP基因片段克隆及序列分析

本研究以感染CymMV和ORSV蝴蝶蘭植株的cDNA為模板，使用表1中引物分別對(duì)CymMV和ORSV的CP基因片段進(jìn)行克隆，所使用的引物特異性較好，獲得了目的片段條帶（圖1）。經(jīng)測(cè)序獲得 534 bp CymMV的CP基因片段序列，以及235 bp ORSV的CP基因片段序列。

利用DNAMAN軟件對(duì)克隆到的CymMV CP基因片段序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示，本研究CymMV的CP基因片段序列與已登錄的CymMV 的CP基因相應(yīng)序列（GenBank：U62963.1）有12個(gè)核苷酸差異，1個(gè)氨基酸差異，核苷酸相似性為98.21%，氨基酸相似性為99.55%，表明克隆出的目的條帶正確。與其他地區(qū)分離物中CymMV的CP基因（巴西GenBank：KX960737.1；河南GenBank：KU873000；云南GenBank：AM055640.2；西藏GenBank：KP137368.1）進(jìn)行比對(duì)分析， 結(jié)果顯示，本研究CymMV CP基因片段序列與上述地區(qū)分離物中CymMV CP基因序列核苷酸相似性為97.92%～98.66%，氨基酸相似性為95.52%～99.55%，表明來(lái)自不同地區(qū)分離物中的CymMV CP基因序列存在保守性。

本研究克隆獲得的ORSV CP基因片段序列與已登錄的ORSV的CP基因相應(yīng)序列（GenBank：AJ606105.1）有7個(gè)核苷酸差異，5個(gè)氨基酸差異，核苷酸相似性為98.53%，氨基酸相似性為96.84%，表明克隆出的目的條帶正確（圖3）。與廣州（GenBank：KF836079.1）、印度（GenBank：MN027919.1）、貴州（GenBank：KF225471.1）、臺(tái)灣（GenBank：AF455274.1）等其他地區(qū)分離物中的ORSV CP基因相應(yīng)序列的核苷酸相似性為99.12%～99.56%，氨基酸相似性為98.73%～99.37%，表明來(lái)自不同地區(qū)分離物中的ORSV CP基因序列存在保守性。

2.2 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本研究首先對(duì)RT-qPCR引物特異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，表1中引物用于蝴蝶蘭CymMV和ORSV CP基因序列RT-qPCR檢測(cè)時(shí)，熔解曲線為單一峰，引物特異性較好（圖4-A、圖4-B）。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍梯度逐級(jí)稀釋后，CymMV選取3.09×105～3.09×109 copies/μL等5個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，ORSV選取3.50×105～3.50×109 copies/μL等5個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別建立RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，2種病毒質(zhì)粒模板濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)定量（Cq）值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，CymMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.459x+43.98，r2=0.999，擴(kuò)增效率（E）為94.6%（圖5-A）；ORSV的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.427x+48.42，r2=0.984 1，擴(kuò)增效率為95.8%（圖5-B），其中，y均為Cq值，x為模板濃度（C）的對(duì)數(shù)值（lgC=x）。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于后期病毒濃度的計(jì)算。

2.3 RT-qPCR和RT-PCR靈敏度的比較

將母液濃度為3.09×1011 copies/μL的CymMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和3.50×1011 copies/μL的ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別按10倍等比稀釋，以終濃度為3.09×100～3.09×109 copies/μL的CymMV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和3.50×100～3.50×109 copies/μL的ORSV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和普通RT-PCR檢測(cè)。[JP+1]結(jié)果如圖6、 圖7所示， RT-PCR能檢測(cè)出的CymMV和ORSV最低濃度分別為 3.09×102、3.50×102 copies/μL；RT-qPCR能檢測(cè)出的CymMV和ORSV最低濃度分別為3.09×10、3.50×10 copies/μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR比普通PCR檢測(cè)的靈敏度提高10倍。

2.4 蝴蝶蘭溫室栽培植株CymMV及ORSV檢測(cè)

同時(shí)采用RT-PCR和RT-qPCR 2種方法對(duì)LL29、初戀、大辣椒和藍(lán)寶石等4個(gè)蝴蝶蘭品種進(jìn)行CymMV與ORSV檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，2種檢測(cè)方法對(duì)病毒檢測(cè)的靈敏度存在差異。對(duì)20份樣本的RT-PCR結(jié)果顯示，15份樣品攜帶CymMV，6份樣品攜帶ORSV，陽(yáng)性率分別為75%和30%。RT-qPCR結(jié)果則顯示，20份樣品均攜帶CymMV，陽(yáng)性率為100%，病毒含量在3.75×101～1.47×1011 copies/μL之間；18份樣品攜帶ORSV，陽(yáng)性率為90%，病毒含量在9.79×102～8.16×108 copies/μL 之間，藍(lán)寶石中有2株不攜帶OSRV。總體上看，RT-qPCR檢測(cè)的靈敏性更高。

盡管溫室栽培的蝴蝶蘭樣品普遍攜帶CymMV與ORSV，但是從病毒拷貝數(shù)來(lái)看，不同的品種攜帶病毒的情況不同，大辣椒和藍(lán)寶石攜帶CymMV與ORSV的情況較輕，而初戀攜帶病毒的情況較為嚴(yán)重，且CymMV和ORSV復(fù)合感染的情況較為嚴(yán)重。

3 討論與結(jié)論

本研究從蝴蝶蘭感病植株中克隆得到CymMV和ORSV的CP基因片段。測(cè)序后將所得CymMV CP基因序列與其他地區(qū)CymMV分離物CP基因序列進(jìn)行比對(duì)，得到核苷酸序列與氨基酸序列相似性分別為97.92%～98.66%和95.52%～99.55%。與此相似，CymMV廣東分離物與30個(gè)其他地區(qū)的CymMV分離物比對(duì)，核苷酸序列與氨基酸序列相似性分別為89.73%～98.66%和97.31%～100.00%［22］。Rao等通過(guò)多序列比較，發(fā)現(xiàn)89個(gè)CymMV CP序列核苷酸與氨基酸相似性分別為84.6%～100.00%和89.5%～100.00%［23］，本研究結(jié)果與之相似。本研究中ORSV CP基因片段測(cè)序后與其他地區(qū)ORSV分離物序列進(jìn)行對(duì)比，得到核苷酸序列與氨基酸序列相似性分別為99.12%～99.56%和98.73%～99.37%。與此相似，ORSV廣東分離物與37個(gè)其他地區(qū)的ORSV分離物比對(duì)，核苷酸序列與氨基酸序列相似性分別為96.65%～100.00%和93.67%～100.00%［22］。吳偉文等所得ORSV江蘇分離物與141個(gè)其他地區(qū)ORSV分離物CP基因核苷酸序列相似性在94%以上［24］，本研究結(jié)果與之相似。由此可見(jiàn)，CymMV和ORSV的CP基因核苷酸序列及編碼蛋白氨基酸序列在來(lái)自不同地區(qū)的分離物間存在保守性，這2種病毒的CP基因片段可作為模板，構(gòu)建穩(wěn)定的病毒檢測(cè)體系，用于檢測(cè)不同地區(qū)的蝴蝶蘭植株。

靈敏度是影響病毒早期診斷的關(guān)鍵因素［25］。本研究構(gòu)建的RT-qPCR檢測(cè)體系能檢測(cè)出CymMV和ORSV的最低濃度分別為3.09×10、3.50×10 copies/μL。與此相似，溧芳等在使用 RT-qPCR 對(duì)河南蝴蝶蘭的檢測(cè)中，可檢測(cè)出CymMV最低濃度為2.66×10 copies/μL［26］。宋蒙等在百合中使用RT-qPCR檢測(cè)車前草花葉病毒（Plantago asiatica mosaic virus，簡(jiǎn)稱PlAMV），可檢出最低濃度為 1.3×10 copies/μL［27］，本研究結(jié)果與之類似，檢測(cè)下限均處于10 copies/μL數(shù)量級(jí)。然而，Eun等以Taq Man探針為檢測(cè)體系中的熒光指示劑，使用RT-qPCR對(duì)蘭科植物中CymMV和ORSV進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)出CymMV和ORSV最低為104 copies［28］，本研究結(jié)果與之存在差異，這可能是檢測(cè)體系中所用熒光指示劑不同導(dǎo)致的。在本研究中，RT-qPCR對(duì)CymMV和ORSV檢測(cè)的靈敏性較RT-PCR提高10倍，這與使用RT-PCR和 RT-qPCR 檢測(cè)西瓜種子中黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的靈敏度比較結(jié)果［14］相同。然而，使用RT-qPCR對(duì)百合中PlAMV檢測(cè)靈敏度較RT-PCR高100倍［27］，靈敏性略高于本研究，這可能是因?yàn)楸狙芯康腞T-PCR擴(kuò)增效率較高。

CymMV和ORSV是蘭科植物病毒中危害最嚴(yán)重的2種病毒，且二者經(jīng)常復(fù)合侵染蘭科植物［29-30］。本研究對(duì)20份云南地區(qū)溫室栽培的蝴蝶蘭樣品進(jìn)行檢測(cè)，CymMV陽(yáng)性率為100%，ORSV陽(yáng)性率為90%，2種病毒復(fù)合感染陽(yáng)性率為90%，蝴蝶蘭攜帶病毒較多，復(fù)合感染的情況較為普遍。與此相似，柳愛(ài)春等采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）檢測(cè)法對(duì)浙江地區(qū)蝴蝶蘭進(jìn)行檢測(cè)，CymMV陽(yáng)性率為70%，ORSV病毒陽(yáng)性率為60%，2種病毒復(fù)合感染率為56.7%，表明這2種病毒對(duì)浙江省蝴蝶蘭侵染率較高［31］。與本研究不同，謝林娜等采用ELISA檢測(cè)法對(duì)來(lái)自廣東、江蘇省大型蝴蝶蘭生產(chǎn)基地的45個(gè)蝴蝶蘭樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CymMV陽(yáng)性率為20.0%，ORSV病毒陽(yáng)性率為71.1%，2種病毒復(fù)合感染陽(yáng)性率為17.8%［32］。周國(guó)輝等采用雙重RT-PCR對(duì)廣東順德153份蘭花樣品進(jìn)行檢測(cè)，CymMV陽(yáng)性率為49.7%，ORSV病毒陽(yáng)性率為34.0%，2種病毒復(fù)合感染率為1.3%［33］。本研究結(jié)果與上述研究存在差異，這可能與不同地區(qū)蝴蝶蘭品種和栽培環(huán)境差異以及檢測(cè)方法靈敏度不同有關(guān)。

綜上所述，蝴蝶蘭受CymMV和ORSV危害較為普遍，未來(lái)需進(jìn)一步開展種苗脫毒技術(shù)研究以此推動(dòng)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

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