YTH基因家族在腎癌中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值

麥麥提江·阿布杜克熱木 張瑞麗,阿不來提·買買提明 艾尼瓦爾·艾木都拉

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 新疆烏魯木齊 830054

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿生殖系統(tǒng)常見的腫瘤之一,以高轉(zhuǎn)移率和高死亡率以及高度異質(zhì)性為臨床特點(diǎn)的惡性腫瘤[1]。目前早期診斷和及時(shí)手術(shù)仍是局限期RCC主要的治療方式。而對(duì)于局部晚期 RCC的治療則以靶向和免疫治療為主,但是其有效率低以及耐藥性等問題導(dǎo)致預(yù)后較差[2]。因此,尋找RCC特異性的生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)是精準(zhǔn)治療的關(guān)鍵。

n6 -甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見的內(nèi)部mRNA調(diào)控方式。它是通過改變RNA結(jié)構(gòu)或招募m6A“閱讀器”蛋白來發(fā)揮其生物學(xué)功能,被認(rèn)為與人類致癌相關(guān)的新靶點(diǎn)[3]。m6A“閱讀器”蛋白含有一個(gè)進(jìn)化保守的YTH(YT521-B同源)結(jié)構(gòu)域,可以直接與m6A結(jié)合并通過調(diào)控pre-mRNA剪接、RNA輸出,促進(jìn)mRNA翻譯或衰減來控制信使RNA (mRNA)的表達(dá),參與腫瘤的增殖、耐藥及預(yù)后等過程[4-5],但是YTH家族蛋白在腎癌方面的研究較少。 本文就通過對(duì)多種公共數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析,探索腎癌中YTH家族蛋白的表達(dá)、預(yù)后、生物學(xué)功能等,為腎癌治療中的潛在作用提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 利用ULCAN數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)分析表達(dá)差異。

1.2 利用Kaplan-Meierplotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析YTH基因的表達(dá)與腎癌患者預(yù)后間關(guān)系。

1.3 使用cBioPortal分析YTH基因改變頻率和類型。

1.4 通過WebGestalt平臺(tái)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.5 從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.com)獲得了腎癌的RNAseq數(shù)據(jù)(level3)和相應(yīng)的臨床信息并使用Spearman法分析相關(guān)性。

1.6 DiseaseMeth分析YTH基因在腎癌和正常組織中的甲基化水平。

2 結(jié)果

2.1 在腎癌中YTH基因的表達(dá)差異

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)分析YTH基因在腎癌中的表達(dá)差異。YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1在腎癌組織中相對(duì)低表達(dá),YTHDC2則明顯高表達(dá)(P<0.001),而YTHDF1mRNA在腎癌組織中的表達(dá)與鄰近正常組織相比無明顯差異(P<0.05)(見圖1)。

注:YTH基因的mRNA表達(dá)差異(ULCAN),*P<0.05,***P<0.0001。圖1 腎癌中YTH基因表達(dá)

2.2 YTH家族基因表達(dá)與腎癌患者預(yù)后間關(guān)系

通過Kaplan-Meier plotter分析YTH基因的表達(dá)與腎癌患者總的生存率(OS)和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示:YTHDF2(P<0.01),YTHDF3(P<0.01),YTHDC1(P<0.01),YTHDC2(P<0.01)低表達(dá)的腎癌患者OS低于高表達(dá)群體(見圖2A);YTHDF1(P<0.01),YTHDF2(P<0.05),YTHDF3的低達(dá)與腎癌患者較差的RFS顯著相關(guān)(P<0.05)(見圖2B)。上述結(jié)果提示,YTHDF2和YTHDF3是預(yù)測(cè)腎癌預(yù)后有一定的參考價(jià)值。

注:2A:YTH基因表達(dá)與腎癌患者的總體生存率(OS);2B:YTH基因的表達(dá)與腎癌患者的無復(fù)發(fā)生存率(RFS)。圖2 YTH基因表達(dá)與腎癌患者生存預(yù)測(cè)(Kaplan-Meier plotter)

2.3 YTH基因在腎癌中的遺傳學(xué)改變

遺傳突變性是腎癌發(fā)病原因之一。本研究利用cBioPortal平臺(tái)分析YTH基因在腎癌中突變頻率和類型。結(jié)果提示YTD基因變異率有所差異,最高的是YTHDC2(占11%),YTHDF2基因變異率則YTH家族中最低(占0.4%)其他依次分別為0.7%(YTHDF1,YTHDC1),0.9%(YTHDF3)。448例腎癌患者中,YTH成員遺傳變異率為13.6%(占61/448)(見圖3A),主要遺傳變異類型包括:基因擴(kuò)增、基因缺失、截短突變,剪接突變和深度缺失等(見圖3A)。YTHDF3與YTHDF1和YTHDF2有許多相似的靶點(diǎn),58%的YTHDF3靶點(diǎn)被YTHDF1識(shí)別,60%被YTHDF2識(shí)別,這表明YTHDF3蛋白在共同靶點(diǎn)上具有潛在的協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)YTHDF3通過與YTHDF1相互作用促進(jìn)靶mRNA的翻譯[6]。本研究利用GEPIA2平臺(tái)分析探索YTH基因間的關(guān)系。圖3B提示YTHDF3和YTHDC2和YTHDC1之間關(guān)系較為密切。

注:3A:腎癌中YTH基因突變率 (cBioPortal);3B:YTH基因間的相互作用(GEPIA2) 。圖3 YTH基因在腎癌中的變異及之間相關(guān)性

2.4 YTH基因相關(guān)分子的生物學(xué)功能分析

通過cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)分析出91個(gè)相互作用基因,并利用Cytoscape平臺(tái)進(jìn)一步構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI),圖 4A 顯示YTH基因的功能密切相關(guān)基因有MPHOSPH8、RAD21、HNRNPDL、DDX46、CAND1和RAD21。WebGestalt平臺(tái)GO分析提示YTH基因涉及生物調(diào)控、代謝、繁殖、細(xì)胞成分的組織、多細(xì)胞生物過程、發(fā)育過程、應(yīng)激反應(yīng)、多器官生物過程、細(xì)胞信息傳遞以及細(xì)胞定位等環(huán)節(jié)。細(xì)胞核、細(xì)胞漿、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞支架、細(xì)胞膜、膜密封腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)膜系統(tǒng)等細(xì)胞及細(xì)胞外成分中YTH相關(guān)基因高度富集。主要分子功能包括核酸,蛋白質(zhì)和核苷酸的結(jié)合以及水解酶活性、離子結(jié)合等(見圖 4B)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)與YTH家族相關(guān)的信號(hào)通路有轉(zhuǎn)化啟動(dòng)、mRNA代謝調(diào)控過程、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞酰胺代謝過程調(diào)控等(見圖4C)。

注:4A:腎癌中YTH基因共享差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(cBioPortal,Cytoscape);4B:YTH家族相關(guān)的生物過程、細(xì)胞成分、分子功能 (WebGestalt);4C: YTH基因相關(guān)的信號(hào)通路(WebGestalt)。圖4 YTH基因功能及通路富集分析

圖5 YTH基因與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

圖6 GSDM基因各成員在腎癌組織和正常腎組織中的DNA甲基化水平分析 (DiseaseMeth),*P<0.05,***P<0.0001

2.5 YTH基因與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

目前免疫治療已成為腎癌主要的治療方法,YTH基因是癌癥免疫治療的潛在新靶點(diǎn)。所以本研究利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析YTH基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示所有YTH基因的表達(dá)均與CD4+T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)呈顯著性正相關(guān),與NK細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。除YTHDF1外,其余4個(gè)YTH基因與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)。YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3和YTHDC1與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。YTHDF2,YTHDF3與B細(xì)胞浸潤(rùn)呈顯著性正相關(guān)。

2.6 腎癌中YTH基因的甲基化水平

本研究利用ULCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析腎癌中YTH基因甲基化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):腎癌中YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3的甲基化水平明顯高于正常腎組織,而YTHDC2甲基化水平則明顯低正常組織。YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1在腎癌組織中的異常低表達(dá)和YTHDC2高表達(dá)均考慮與它們的甲基化調(diào)控機(jī)制有關(guān)。在腎癌組織YTHDF1甲基化程度明顯高于正常組織,但是YTHDF1mRNA表達(dá)無顯著性差異

3 討論

N6甲基腺嘌呤(m6A)被認(rèn)為是最普遍、最豐富和最保守的RNA內(nèi)部修飾方式,但是關(guān)于RNA m6A甲基化和腫瘤生物學(xué)之間關(guān)的研究甚少。YTH基因作為重要的甲基“識(shí)別蛋白”,屬于YT521-B同源結(jié)構(gòu)域蛋白(YTH)的兩個(gè)亞型,即含YTH結(jié)構(gòu)域蛋白的YTHDF1/2/3和YTHDC1/2,其中YTHDF1/2位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中,YTHDC1/2位于體細(xì)胞的細(xì)胞核中[7]。

多項(xiàng)研究顯示m6A甲基“識(shí)別蛋白”在人類癌癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,并有望成為治療靶點(diǎn)。如:YTHDF2與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤密切相關(guān)[8],作為GSC特異性依賴識(shí)別蛋白,YTHDF2通過穩(wěn)定MYC轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)GSC中的葡萄糖代謝。YTHDC1/m6A/MCM4/DNA復(fù)制軸在白血病發(fā)生中起著關(guān)鍵作用,敲除YTHDC1對(duì)AML細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用[9]。此外YTHDF1以m6A依賴的方式促進(jìn)Wnt關(guān)鍵受體frizzled7 (FZD7)的翻譯,導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路過度激活,促進(jìn)胃癌發(fā)生[10]。另外一項(xiàng)研究顯示YTHDF1和YTHDF3對(duì)乳腺癌的預(yù)后分層和治療靶點(diǎn)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。YTHDF1和YTHDF3頻繁擴(kuò)增促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展,同時(shí)YTHDF1和YTHDF3過表達(dá)與乳腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)[11]。肺癌方面,YTHDC2通過其識(shí)別m6A的YTH結(jié)構(gòu)域與m6A修飾的SLC7A11 mRNA結(jié)合,抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[12]。

上述一系列研究證實(shí)了YTH家族5個(gè)成員在不同腫瘤生物學(xué)過程中發(fā)揮的重要作用,但是在腎癌發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確。因此,本研究我們利用公共測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析來進(jìn)一步了解YTH家族基因在腎癌中的生物學(xué)作用。

本研究分析結(jié)果顯示,腎癌中YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1mRNA低表達(dá),考慮為抑癌基因,YTHDC2的表達(dá)在腎癌中顯著升高,考慮具有腎癌致癌基因的潛力。腎癌中YTHDF2和YTHDF3的低表達(dá)患者總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS)低于高表達(dá)患者,可以考慮為腎癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為其作為腎癌治療的新靶點(diǎn)提供更多的試驗(yàn)依據(jù)。

本研究顯示,腎癌中YTH相關(guān)基因總變異率為13.6%,其中,變異幅度最高的為YTHDC2(占11%)。基因擴(kuò)增為主要遺傳變異類型,YTH基因主要的癌癥相關(guān)功能為生物合成及分解代謝。功能富集分析發(fā)現(xiàn)YTH蛋白主要涉及生物調(diào)控和代謝等過程。腎癌作為異質(zhì)性明顯的腫瘤,具有明確的組織學(xué)和基因?qū)W改變,所以不同的患者對(duì)治療有不同的反應(yīng)。腎癌發(fā)生相關(guān)基因(VHL、FLCN、TFE3、FH或SDHB)的突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)氧、鐵、營(yíng)養(yǎng)或能量水平變化的失控,這進(jìn)一步證實(shí)腎癌是一種代謝改變驅(qū)動(dòng)的癌癥[13]。用GeneMANIA和激酶BCR、MIR-202 (ATAGGAA)相關(guān)基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)表明,這些基因集主要負(fù)責(zé)凋亡信號(hào)通路和負(fù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。比如YTHDF2通過BCR激酶和MIR-202參與凋亡信號(hào)通路,負(fù)向調(diào)控生長(zhǎng),說明YTH家族蛋白通過影響mRNA代謝、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞酰胺代謝等生物學(xué)過程,調(diào)控腎癌的發(fā)生和發(fā)展[14]。本研究GO富集分析結(jié)果也證實(shí),YTH家族基因大多與RNA代謝通路或細(xì)胞生物學(xué)功能相關(guān)。

RNA甲基化及其下游相關(guān)信號(hào)通路參與眾多的生物學(xué)過程。研究報(bào)道基因的甲基化狀態(tài)與其表達(dá)之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系[17]。比如:胃癌中多功能蛋白聚糖基因(VCAN基因)的甲基化狀態(tài)與VCAN表達(dá)之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系[18]。食胃結(jié)合部腺癌(adenocarcinomas of the esophagogastric junction,AEG)Caveolin-1基因CpG島的甲基化水平與該基因的低表達(dá)有關(guān)[19]。因此,RNA甲基化可能作為癌癥診斷和個(gè)性化治療的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果提示,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1和YTHDC2在腎癌組織中異常表達(dá)可能與它們不同的甲基化水平有關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)YTH基因家族(尤其是YTHDF2、YTHDF3)在腎癌中差異表達(dá)并與預(yù)后有關(guān),考慮為腎癌檢測(cè)分子靶點(diǎn)和藥物靶標(biāo)提供了理論依據(jù)和線索。