酵母細胞壁對白羽肉雞腸道發(fā)育的影響

廖燦青， 周小輝， 陳中平， 謝智文，徐 杰， 戴晉軍， 王家鄉(xiāng)

（1.宜昌安琪生物農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北宜昌 443200；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000；3.長江大學，湖北荊州 434023）

酵母細胞壁（YCW）主要成分為甘露聚糖、葡聚糖、蛋白質(zhì)以及少量的脂類和幾丁質(zhì)等（朱延軍等,2009）。 研究表明酵母細胞壁能夠吸附腸道病原菌、 促進腸道有益菌群定植、 調(diào)節(jié)機體免疫功能、特異性吸附霉菌毒素等，作為酵母源生物飼料的重要組成部分，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖（周勝男,2017）。 歐盟將酵母細胞壁 納入（EU）NO68/2013 號法規(guī)，我國也已將酵母細胞壁納入了《飼料原料目錄（2013）》（戴晉軍等,2022）。 目前酵母細胞壁對肉雞免疫相關(guān)的研究較多， 在對腸道發(fā)育方面的研究較少，因此，本研究旨在評估日糧中添加酵母細胞壁對白羽肉雞腸道組織形態(tài)、 腸道pH 和腸道微生物多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 酵母細胞壁樣品由安琪酵母股份有限公司提供， 粗蛋白質(zhì)21% ～23%，β-葡聚糖25% ～27%，甘露聚糖26% ～28%，溶解率45% ～50%，可溶部分中分子量在14 萬～19 萬道爾頓的約占38.03%，9 萬～14 萬道爾頓的約占61.53%。

1.2 試驗動物及日糧 試驗動物選用科寶白羽肉雞，基礎(chǔ)日糧配方參考NY/T 33-2004，日糧營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 選擇1 日齡白羽肉雞200 羽，隨機分為4 個處理組，每個處理組5 個重復，每個重復10 羽，各組間試驗雞的平均體重差異不顯著（P ＞0.05）。 對照組A 飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組B、C、D 分別在基礎(chǔ)日糧中添加250、500、1000 g/t 的酵母細胞壁，試驗期6 周。 試驗肉雞自由采食、飲水，采用保溫燈取暖調(diào)控圈內(nèi)溫度，雞舍消毒使用聚維酮碘或稀戊二醛溶液，肉雞舍內(nèi)環(huán)境控制和飼養(yǎng)管理依照肉雞飼養(yǎng)管理標準進行。免疫程序： 在4 ～8 d 新支二聯(lián)疫苗免疫，11 ～15 d 進行法氏囊疫苗免疫，18 ～22 d 進行新城疫二免。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 腸道組織形態(tài)學測定 腸道長度和重量測定：在21 日齡和42 日齡晚上20：00 斷料12 h（僅供飲水）， 在試驗22 日齡和43 日齡上午8：00，每個重復稱取3 只接近平均體重的雞進行屠宰，用手術(shù)剪和手術(shù)刀將腹腔解剖露出腸道，用手術(shù)剪剪掉腸道連接肌胃的末端取出腸道，分離十二指腸（前端從肌胃末端剪斷，后端從膽管與十二指腸交接處剪短）、空腸（十二指腸與膽管交界處到卵黃囊憩室處）和回腸（卵黃囊憩室處到回盲交接處）。

小腸長度：用塑料尺測量十二指腸、空腸和回腸的長度。

腸道絕對長度=腸道長度（cm）；

腸道相對長度=腸道長度（cm）/活體重（kg）。

小腸重量：剝離各段小腸結(jié)締組織和腸系膜，根據(jù)家禽解剖學結(jié)構(gòu)， 在特定的位置用手術(shù)剪剪開腸段，然后用生理鹽水反復沖洗掉腸道內(nèi)食糜，用濾紙吸干水分，再分別稱重，計算十二指腸、空腸和回腸的相對重量。

消化器官絕對重量=消化器官重（g）；

消化器官相對重量=消化器官重 （g）/活體重（kg）。

腸道HE 檢測：試驗結(jié)束后，每個重復稱取3只接近平均體重的雞進行屠宰。 用手術(shù)剪剪下每只肉雞的十二指腸（離肌胃末端5 mm 處）、空腸中間段和回腸中間段約3 ～4 cm 的腸段組織，盡快放入10%的中性福爾馬林固定液中。 樣品經(jīng)固定、洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、修塊后，切成較厚石蠟切片，H-E 染色， 封片后用顯微攝影分析系統(tǒng)測量十二指腸、 空腸和回腸的絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度與隱窩深度比值。

1.4.2 腸道內(nèi)容物pH 測定 43 日齡， 在潔凈環(huán)境下屠宰肉雞， 并收集回腸和盲腸中食糜50 ～100 g，用于檢測腸道內(nèi)容物的pH（用pH 計）。

1.4.3 盲腸微生物菌落多樣性測定 43 日齡，在潔凈環(huán)境下屠宰肉雞， 并收集回腸和盲腸中食糜50 ～100 g，用16S 檢測腸道內(nèi)容物的微生物豐度。盲腸微生物量用ASV/OTU 豐度表制作韋恩圖。Alpha 多樣性分析軟件：QIIME2 （2019.4）。 LEfSe分析軟件：Python LEfse 包，R ggtree，ggplot2 包等。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel進行預處理，以“平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS statistic 22 統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA 進行單因素方差分析， 差異顯著性用Duncan 氏多重比較法，以P < 0.05 作為差異顯著性的判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 酵母細胞壁對白羽肉雞腸道組織形態(tài)學的影響

2.1.1 酵母細胞壁對白羽肉雞小腸各段長度的影響 21 日齡時小腸各段長度結(jié)果見表2， 與對照組相比，添加250 g/t 酵母細胞壁和1000 g/t 酵母細胞壁的十二指腸長度減少1.78%和1.45%，添加500 g/t 酵母細胞壁組十二指腸長度比對照組提高1.94%，各組間差異不顯著（P > 0.05）；與對照組相比，各試驗組空腸長度都有所增加，其中添加500 g/t 酵母細胞壁組的空腸長度顯著提高17.93%（P < 0.05）；與對照組相比，試驗組回腸長度都有所減少，各組間差異不顯著（P > 0.05）。

表2 酵母細胞壁對肉雞小腸各段長度的影響 cm

42 日齡小腸各段長度結(jié)果見表2， 與對照組相比， 添加酵母細胞壁組十二指腸長度都有所下降， 添加1000 g/t 酵母細胞壁組的十二指腸長度最小，比對照組降低19.42%，各組間無顯著差異（P > 0.05）；與對照組相比，試驗組空腸長度都有所增加， 其中添加1000 g/t 酵母細胞壁組提高17.73%，各組間差異不顯著（P > 0.05）；與對照組相比， 試驗組回腸長度都有所提高， 其中添加1000 g/t 酵母細胞壁組提高10.45%， 各組間差異不顯著（P > 0.05）。

2.1.2 酵母細胞壁對白羽肉雞小腸各段相對長度的影響 21 日齡小腸各段相對長度結(jié)果見表3，與對照組相比， 添加250 g/t 酵母細胞壁和1000 g/t 酵母細胞壁的十二指腸相對長度有所減少，添加500 g/t 酵母細胞壁組十二指腸相對長度比對照組和其他試驗組顯著提高（P < 0.05）；與對照組相比試驗組空腸相對長度都有所增加， 其中添加500 g/t 酵母細胞壁組的十二指腸相對長度與對照組和其他試驗組相比顯著提高（P < 0.05）；與對照組相比，添加250 g/t 酵母細胞壁和1000 g/t 酵母細胞壁的回腸相對長度有所減少，添加500 g/t酵母細胞壁組回腸相對長度提高4.47%， 差異不顯著（P > 0.05），試驗組之間添加500 g/t 酵母細胞壁組的回腸相對長度比250 g/t 酵母細胞壁組顯著提高21.97%（P < 0.05）。

表3 酵母細胞壁對肉雞小腸各段相對長度的影響 cm/kg

42 日齡小腸各段相對長度結(jié)果見表3， 與對照組相比， 添加酵母細胞壁的十二指腸相對長度都有所減少，各組間差異不顯著（P > 0.05）；與對照組相比， 添加酵母細胞壁組空腸相對長度都有所增加， 其中添加1000 g/t 酵母細胞壁組的空腸相對長度提高15.66%， 各組間差異不顯著 （P >0.05）；與對照組相比，添加酵母細胞壁的回腸相對長度有所增加， 添加1000 g/t 酵母細胞壁組回腸相對長度提高8.19%，差異不顯著（P > 0.05）。

2.1.3 酵母細胞壁對白羽肉雞小腸各段重量的影響 21 日齡小腸各段重量結(jié)果見表4， 與對照組相比， 添加酵母細胞壁組的十二指腸重量有所增加， 添加1000 g/t 酵母細胞壁組十二指腸重量顯著提高47.02%（P < 0.05）； 與對照組相比空腸重量都有所增加， 其中添加1000 g/t 酵母細胞壁組的重量最高，比對照組提高27.26%，各組間差異不顯著（P > 0.05）；與對照組相比，添加酵母細胞壁組的回腸重量都有所增加， 其中添加1000 g/t酵母細胞壁組回腸重量提高1.94%， 各組間差異不顯著（P > 0.05）。

表4 酵母細胞壁對肉雞小腸各段重量的影響g

42 日齡小腸各段重量結(jié)果見表4，與對照組相比， 添加酵母細胞壁組的十二指腸重量有所降低，添加250 g/t 酵母細胞壁組十二指腸重量降低12.66%，各組間差異不顯著（P>0.05）；與對照組相比，試驗組空腸重量都有所減少，其中添加500 g/t酵母細胞壁組的空腸重量最小， 比對照組降低19.08%，各組間差異不顯著（P>0.05）；與對照組相比， 添加酵母細胞壁組的回腸重量都有所降低，其中添加1000 g/t 酵母細胞壁組回腸相重量最低，比對照組降低23.22%，各組間差異不顯著（P>0.05）。

2.1.4 酵母細胞壁對白羽肉雞小腸各段相對重量的影響 21 日齡小腸各段相對重量結(jié)果見表5，與對照組相比， 添加酵母細胞壁組的十二指腸相對重量有所增加， 添加1000 g/t 酵母細胞壁組十二指腸相對重量比對照組和添加250 g/t 酵母細胞壁組顯著提高46.96%和33.38%（P < 0.05）；與對照組相比，試驗組的空腸相對重量都有所增加，其中添加1000 g/t 酵母細胞壁組的相對重量最高，比對照組提高27.53%，各組間差異不顯著（P >0.05）；與對照組相比，添加250 g/t 酵母細胞壁組的回腸相對重量降低9.28%， 差異不顯著 （P >0.05），添加500 g/t 酵母細胞壁組和添加1000 g/t酵母細胞壁組的回腸相對重量都有所增加， 比對照組分別提高8.01%和2.54%，與添加250 g/t 酵母細胞壁組相比，500 g/t 酵母細胞壁組的回腸相對重量顯著提高19.06%（P < 0.05）。

表5 酵母細胞壁對肉雞小腸各段相對重量的影響 g/kg

42 日齡小腸各段相對重量結(jié)果見表5， 與對照組相比， 添加酵母細胞壁組的十二指腸相對重量有所降低，添加250 g/t 酵母細胞壁組十二指腸相對重量最低，比對照組降低18.98%，各組間差異不顯著（P > 0.05）；與對照組相比，試驗組空腸相對重量都有所減少， 各組間差異不顯著 （P >0.05）；與對照組相比，添加酵母細胞壁組的回腸絕對重量都有所降低，其中添加250 g/t 酵母細胞壁組回腸相絕對重量最低， 比對照組降低26.74%，各組間差異不顯著（P > 0.05）。

2.1.5 酵母細胞壁對白羽肉雞小腸各段腸絨毛高度和腸隱窩深度的影響 42 日齡白羽肉雞小腸各段腸絨毛高度和腸隱窩深度的結(jié)果見表6，與對照組相比， 試驗組十二指腸絨毛高度和隱窩深度都有所下降，各組間無顯著差異（P > 0.05）；與對照組相比， 添加酵母細胞壁組空腸絨毛高度有所增加， 隱窩深度有所下降， 各組間無顯著差異（P > 0.05）；與對照組相比，添加250 g/t 酵母細胞壁組的回腸絨毛高度下降，添加500 g/t 酵母細胞壁組和添加1000 g/t 酵母細胞壁組的回腸絨毛高度有所增加，各組間差異不顯著（P > 0.05）。

表6 酵母細胞壁對42 日齡肉雞小腸各段腸絨毛高度和腸隱窩深度的影響

2.2 酵母細胞壁對白羽肉雞腸道食糜pH 的影響 各組肉雞腸道食糜pH 結(jié)果見表7，與對照組相比，試驗組pH 都有所下降，差異不顯著（P >0.05），因此，說明該酵母細胞壁對肉雞腸道環(huán)境有改善作用，可以降低肉雞腸道pH，當添加量為500 g/t 時，可以使肉雞腸道處于弱酸性。

表7 酵母細胞壁對白羽肉雞腸道食糜pH 的影響

2.3 酵母細胞壁對白羽肉雞盲腸微生物的影響2.3.1 肉雞盲腸微生物群落OTUs、等級豐度曲線和稀釋曲線分析 圖1 是各組OTU 的韋恩圖，從圖上可以看出，A、B、C 和D 四個組共有的OUT為21294 個， 每個組分別有的OUT 為： 6052、6679、6594 和5746 個； 四組總共獨有的OUT 為19005 個， 分別獨有的OTU 為4642、5108、4973和4282 個；兩組共有的OUT 總數(shù)為5737 個，A、B 組共有的為926 個，A、C 組共有的為961 個，A、D 組共有的為846 個，B、C 組共有的為1046個，B、D 組共有的為968 個，C、D 組共有的為990個；四組共有的OTU 為472 個；由此可以進一步說明，隨著酵母細胞壁添加量的加大，盲腸ASV/OTU 總數(shù)目和獨有數(shù)目會減少。

圖1 各組ASV/O 的韋恩圖

從圖2 等級豐度曲線可以看出， 隨著測序數(shù)量的增加而趨于平緩， 說明腸道菌群數(shù)量并沒有隨著測序序列的增加而增加， 測序量足以反映樣本的物種多樣性。 從圖3 稀釋曲線可以看出，隨著測序深度的增加曲線趨于平緩， 說明測序深度基本滿足試驗要求。

圖2 等級豐度曲線

圖3 稀釋曲線

2.3.2 肉雞盲腸微生物Alpha 多樣性分析 由表8 可知，各組的Goods coverage 指數(shù)均在0.993 左右，說明測序數(shù)據(jù)覆蓋99.3%的微生物，覆蓋度較好。圖4 是盲腸微生物Alpha 多樣性分析，從圖上可以看出，與對照組相比添加250 g/t 酵母細胞壁組 的Chao1、Observed species、Shannon、Pielou 和Faith_pd 值都較大，因此添加250 g/t 酵母細胞壁組的微生物菌落多樣性和菌落豐富度表現(xiàn)最佳，各組間無顯著差異（P > 0.05）。

圖4 盲腸微生物Alpha 多樣性分析

表8 各組肉雞盲腸微生物Alpha 多樣性的測定結(jié)果

2.3.3 肉雞盲腸微生物LEfSe 分析 圖5 （a 和b）是LEfSe 分析圖，基于分類等級樹的組間差異分類單元展示， 從圖上可以看出，A 組與C 組差異顯著。 群落中從門到屬的所有分類單元列表，LEfSe 逐一分析，與空白組相比，500 g/t 添加組差異顯著。說明添加500 g/t 酵母細胞壁能顯著降低盲腸微生物豐度。

圖5 盲腸微生物Alpha 多樣性分析

3 討論

酵母細胞壁中的甘露寡糖結(jié)構(gòu)與病原菌在腸壁上的結(jié)合受體結(jié)構(gòu)相似， 可以競爭性地同病原菌結(jié)合，阻礙病原菌在腸壁上的吸附,干擾腸道病原體的定植,從而有效抑制感染。 同時，甘露聚糖還能夠通過分子間作用力（如氫鍵和范德華力等）牢固吸附多種霉菌毒素，形成多糖與毒素復合體，抑制腸道吸收毒素（邵強，2017）。另外，酵母細胞壁重甘露聚糖作為酵母細胞壁的主要免疫多糖，進入機體消化道后，不易被消化酶消化，進入消化道后段成為有益菌的代謝原料， 可激發(fā)大量有益菌增殖，從而抑制有害菌繁殖（侯瑛倩等2013）。 腸道中的菌群可以利用甘露聚糖來發(fā)酵， 主要產(chǎn)生CO2、CH4和有機酸，降低了腸道pH，能有效改善腸道酸性環(huán)境，抑制有害菌群的繁殖（弓芃等，2021）。有研究表明，酵母細胞壁可改善仔豬腸道小腸黏膜形態(tài)學結(jié)構(gòu)，調(diào)控微生物菌群結(jié)構(gòu)，緩解仔豬斷奶應(yīng)激，提高腸道免疫功能（賀琴，2017）。 因此酵母細胞壁能改善體機腸道微生物菌群環(huán)境，影響腸道微生物代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物，來調(diào)節(jié)動物體新陳代謝和免疫應(yīng)答，降低體機消化道患病率。

3.1 酵母細胞壁對白羽肉雞腸道組織形態(tài)學的影響 通過本研究結(jié)果表明，21 日齡， 與對照組相比，試驗組對空腸和回腸相對長度有所提高，其中500 g/t 添加量時效果最佳。 試驗組之間添加500 g/t 酵母細胞壁組的回腸相對長度比250 g/t酵母細胞壁組顯著提高21.97%。 添加1000 g/t 酵母細胞壁組十二指腸重量比對照組顯著提高47.02%； 添加1000 g/t 酵母細胞壁組十二指腸相對重量比對照組和添加250 g/t 酵母細胞壁組顯著提高46.96%和33.38%；與添加250 g/t 酵母細胞壁組相比，500 g/t 酵母細胞壁組的回腸相對重量有顯著提高19.06%。飼糧中添加酵母細胞壁可通過降低腸道氧化應(yīng)激、保護腸道結(jié)構(gòu)完整性，提高肉雞生產(chǎn)性能（Jing 等,2023）。

42 日齡小腸各段相對長度和相對重量無顯著差異， 說明添加酵母細胞壁對肉雞生長前期有一定的效果， 對白羽肉雞生長后期腸道影響較?。‥lijah 等，2022）。42 日齡白羽肉雞小腸各段絨毛高度和隱窩深度的結(jié)果表明各組間無顯著差異；這與Jianmin 等（2000）報道相近，飼糧添加1000 g/t YCW 對腸道形態(tài)無顯著影響。 表明小分子釀酒酵母細胞壁對白羽肉雞后期的腸道絨毛高度和隱窩深度改善效果有限。

3.2 酵母細胞壁對白羽肉雞腸道內(nèi)容物pH 的影響 與對照組相比，試驗組pH 都有所下降，差異不顯著，因此，說明該酵母細胞壁對肉雞腸道環(huán)境有改善作用，可以降低肉雞腸道pH，當添加量為500 g/t 時，可以使肉雞腸道處于弱酸性。 夏超篤（2016）報道， 添加酵母細胞壁對黃羽肉雞回盲腸pH 具有降低的作用， 但是對家禽腸道內(nèi)容物pH 無顯著影響。 這可能是酵母細胞壁通過影響腸道微生物代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物，降低了腸道pH，能有效改善腸道酸性環(huán)境（弓芃等,2021）。因此酵母細胞壁能改善體機腸道微生物菌群環(huán)境，降低體機消化道患病率。

3.3 酵母細胞壁對白羽肉雞盲腸微生物多樣性的影響 隨著酵母細胞壁添加量的增加， 微生物多樣性分析數(shù)值呈現(xiàn)下降趨勢，由此可推斷，高添加劑量的酵母細胞壁對盲腸微生物的影響呈負相關(guān)或者是由于不同工藝酵母細胞壁產(chǎn)品產(chǎn)生出不同的影響，這與田書會（2011）報道的相近，添加酵母培養(yǎng)物劑量越大菌群結(jié)構(gòu)越低，同時總菌圖譜多樣性分析結(jié)果表明， 添加酵母培養(yǎng)物組豬回腸食糜的多樣性指數(shù)與對照組相比， 沒有顯著性差異。 高震（2021）利用酵母細胞壁在仔豬上研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在Sobs、Ace、Chao 指數(shù)均有上升趨勢。 仔豬糞樣菌群區(qū)系獨有的OUT 增多。 表明日糧中添加酵母培養(yǎng)物類產(chǎn)品可能對盲腸食糜總菌多樣性影響不大，可能是促進有益菌的增殖，改變了菌群結(jié)構(gòu)，這有待進一步研究和探索

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明： 酵母細胞壁對白羽肉雞生長前期腸道形態(tài)學結(jié)構(gòu)發(fā)育有一定效果， 對生長后期腸道改善效果有限。飼糧中添加500 g/t 酵母細胞壁能降低腸道pH。酵母細胞壁對腸道微生物有一定的調(diào)控作用，添加250 g/t 酵母細胞壁組的微生物多樣性表現(xiàn)最好， 隨著酵母細胞壁添加劑量的加大，盲腸內(nèi)菌落總數(shù)有下降的趨勢。