益生菌發(fā)酵中草藥條件優(yōu)化及品質(zhì)鑒定

曹燕妮， 萬 里， 王 磊， 王朝鳳， 趙文俊，馬玉紅， 張 艷， 丁成翔， 周桂花， 吳國芳

（1.青海省高原家畜遺傳資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部高原畜禽遺傳育種重點實驗室，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016；2.互助縣畜牧獸醫(yī)站，青海海東 810599；3.互助縣八眉豬養(yǎng)殖技術(shù)服務(wù)中心，青海海東 810599；4.青海省互助八眉豬原種育繁場，青海海東 810599）

隨著飼料工業(yè)的迅速發(fā)展， 飼料安全問題越來越受到人們的重視。 發(fā)酵中草藥飼料添加劑具有天然、無污染、無抗生素、功能性強等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外研究的熱點（袁海，2020；楊洋和張崇志，2020）。 傳統(tǒng)中草藥發(fā)酵品質(zhì)與菌種、溫度、濕度、空氣密度等許多因素有關(guān)（楊新波，2022）。而現(xiàn)代中草藥發(fā)酵是利用微生物代謝分解植物大分子（呂井余，2021）， 發(fā)酵過程已被證明可以改善植物、蔬菜和草藥的生物學(xué)特性，而且微生物發(fā)酵還可以增強中草藥原有特性或者產(chǎn)生新的功效（駱雪和俞偉輝，2021；Li，2020）。 乳酸菌和酵母菌是最為常見的發(fā)酵菌種，有研究表明，乳酸菌可作為生長促進劑和抗病劑，具有降低腹瀉率、控制內(nèi)毒素以及提高機體免疫的功能（任磊，2021）。 另外，酵母菌作為酶、游離核苷酸和氨基酸的來源，不僅能增加肉質(zhì)風(fēng)味，還可提高其營養(yǎng)價值（鄒強強，2022）。 部分中草藥與益生菌有著相互促進作用，經(jīng)益生菌發(fā)酵后能產(chǎn)生有利于益生菌生長繁殖及提高機體免疫力的產(chǎn)物 （王林康，2019）。 趙唐（2019）發(fā)現(xiàn)，利用植物乳桿菌發(fā)酵中草藥后，總糖含量顯著提高。 陸承云等（2018） 用曲霉屬真菌GL625 對金銀花進行發(fā)酵后出現(xiàn)了兩種可以增強抑菌活力的物質(zhì)。 張棟健等（2017）將發(fā)酵前后的枳殼飲片進行對比發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵后，枳殼飲片產(chǎn)生圣草酚-7-O-葡萄糖苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷兩種單糖苷新物質(zhì)。 玫瑰和紅棗仁發(fā)酵后的鎮(zhèn)靜安神功效提高， 且新產(chǎn)生紅棗苷B （Zhang 等，2020）。還有研究表明，使用嗜酸乳桿菌發(fā)酵金線蓮可通過增加總酚含量來提高其抗氧化活性（Ng 等，2011）。為更好的評價發(fā)酵中草藥效果，本試驗通過對中草藥發(fā)酵過程中發(fā)酵條件（接種量、水料比、溫度、發(fā)酵時間）進行優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，為發(fā)酵中草藥的應(yīng)用提供一定的參考基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 中草藥原料 陳皮（1 kg）、茴香（1 kg）、八角（1 kg）、肉桂（1 kg）、枸杞（1 kg）、丁香（0.5 kg）、肉蔻（0.5 kg）、姜（0.5 kg）、山楂（0.5 kg）、蒜粉（0.5 kg）按照比例進行制備，均于福生堂藥材棧公司購買。

1.1.2 菌種 選用3 株乳酸菌： 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus YLW001， 菌種保藏號CCTCC M 2018759）、 乳 酸 片 球 菌（Pediococcus acidilactici YLW002， 菌 種 保 藏 號CCTCC M 2018760）、 干 酪 乳 桿 菌 （Lactobacillus casei YLW003，菌種保藏號CCTCC M 2018761）；2 株酵母菌：釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae JZ9，菌種保藏號CCTCC M 2020844）、 畢赤酵母菌（Pichia yeast JZ10， 菌 種 保 藏 號 CCTCC M 2020843）。 所選用的菌種均由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨（10 g）、酵母提取物（5 g）、牛肉膏（10 g）、葡萄糖（20 g）、乙酸鈉（5 g）、檸檬酸三胺（2 g）、磷酸氫鉀（2 g）、四水硫酸錳（0.25 g）、七水硫酸鎂（0.58 g）、吐溫（1 mL），121 ℃高壓滅菌20 min。YPD 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨（20 g）、酵母提取物（10 g）、葡萄糖（20 g），121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法 中草藥原料→烘干粉碎→益生菌菌種→活化及活菌數(shù)測定→接種→攪拌均勻→裝桶→密封發(fā)酵。

1.2.1 菌種活化及擴培 用接種環(huán)分別蘸取乳酸菌和酵母菌解凍液進行平板劃線，于37 ℃和28 ℃分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后， 挑取單菌落分別接種于10 mL MRS 和YPD 液體培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基pH分別為6.3 和5.6， 乳酸菌37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，酵母菌28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h， 獲得種子液。 各取200 μL 種子液分別接種500 mL MRS 和YPD 液體培養(yǎng)基， 乳酸菌37 ℃靜置培養(yǎng)24 h， 酵母菌28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，獲得接種液，采用梯度稀釋和平板涂布法測定總活菌數(shù)。 測得3 株乳酸菌有效活菌數(shù)均≥6×1011CFU/mL，2 株酵母菌有效活菌數(shù)均≥1×108CFU/mL。

1.2.2 發(fā)酵 本試驗設(shè)置對照組（CK），即未發(fā)酵中草藥，再選取接種量（A）、水料比（B）、溫度（C）和發(fā)酵時間（D）進行4 因素3 水平正交設(shè)計，如表1 所示。 按照正交設(shè)計表算出所需接種量以及所用水的體積數(shù)（扣除菌液總體積），將菌液和水充分混勻后均勻噴灑中草藥， 拌勻之后分別裝入500 mL 絲口試劑瓶中，每組4 個重復(fù)，壓實密封后分別放入3 個不同溫度的培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

表1 L9（34）正交試驗設(shè)計

1.2.3 指標(biāo)測定 營養(yǎng)成分測定： 可溶性糖（SS）含量檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司，中性洗滌纖維（NDF）（GB/T20806-2006）、酸性洗滌纖維（ADF）（NY/T1459-2007）。

發(fā)酵品質(zhì)測定： 發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵中草藥全部取出混合均勻后，稱取5 g 樣品，用去離子水定容至50 mL 的離心管中，浸提2 h 進行pH（便攜式pH 計）測定。

有機酸：乳酸（LA）、乙酸（AA）利用液相色譜儀（安捷倫1200 型）測定。 利用氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸，LA 和AA 具體方法為色譜柱：（4.6 mm×250 mm×5.0 μm）； 流動相：0.1%磷酸水溶液等度洗脫；流速：1 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

活性指標(biāo)測定：總多糖、生物堿、類黃酮、總皂苷ELISA 檢測試劑盒，均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

霉菌毒素含量測定： 黃曲霉毒素B1（AFB1）、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮毒素（ZEN）ELISA檢測試劑盒，均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 正交設(shè)計結(jié)果采用方差分析，其他數(shù)據(jù)用Excel 2010 整理，再使用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析， 結(jié)果用平均數(shù)表示，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌發(fā)酵對中草藥營養(yǎng)成分的影響 如表2 和表3 所示，從因素A、B、C、D 對SS 的F 值和P 值來看，4 個因素對SS 含量影響主次順序為A>D>B>C，因素A、D 對SS 含量影響顯著，B、C 影響均不顯著， 且在A2、D3水平下SS 含量較高，因此SS 優(yōu)化組和為A2B2C2D3； 影響NDF 含量因素主次順序為C>D>A>B，因素A、C、D 對NDF 含量影響顯著，B 影響均不顯著， 且在A1、C3、D2水平下含量較低， 因此NDF 的優(yōu)化組合為A1B1C3D2，同理得到對ADF 含量影響因素的主次順序為C>D>A>B，優(yōu)化組合為A2B1C2D3。 對于A 因素，A 作為影響SS 含量的第一因素， 并且顯著影響其含量，因此，確定A2為最佳發(fā)酵條件；對于B 因素，SS、NDF 和ADF 含量均影響不大， 但按主次序可看出，確定B2為最佳發(fā)酵條件；對于C 因素來說，SS 含量受C 影響不大，NDF 和ADF 都受C 影響，且C 均為第一影響因素，因此C2和C3無法再分，C2為25 ℃，而酵母菌生長所需最適溫度為28 ℃，乳酸菌為37 ℃，C3為35 ℃，位于兩者之間，兩者都能生長，因此，確定C2~ C3為最佳發(fā)酵條件；而對D 因素來說，D 作為影響SS、NDF 和ADF 含量的第二因素，綜合考慮D3為最佳發(fā)酵條件。與CK組相比，在此條件下可提高SS 含量，降低NDF 和ADF 含量。 綜合考慮以上指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件為A2、B2、C2~ C3、D3。

表2 正交試驗極差分析

表3 正交試驗方差分析

2.2 益生菌發(fā)酵對中草藥發(fā)酵指標(biāo)的影響 如表4 和表5 所示， 同2.1 分析可得，LA 影響因素主次順序為C>A>B>D，其優(yōu)化組為A1B2C2D2；AA影響因素主次順序為A>B>D>C，AA 的優(yōu)化組為A2B3C1D3，pH 影響因素主次順序為A>D>B>C，pH的優(yōu)化組為A1B3C2D2， 結(jié)果顯示，LA 和AA含量均極顯著受因素A、B、C 和D 的影響，而pH 含量僅極顯著受因素A 的影響。 與CK 組相比，在此條件下可提高LA 和AA 含量，降低pH。 綜合考慮以上指標(biāo)，從而確定最佳條件為A1~A2、B3、C2、D2。

表4 正交試驗極差分析

表5 正交試驗方差分析

2.3 益生菌發(fā)酵對中草藥活性指標(biāo)的影響 如表6 和表7 所示，同2.1 分析可得，總多糖影響因素主次順序為C>D>B>A，優(yōu)化組為A1B3C2D1；生物堿影響因素主次順序為D>B>A>C，優(yōu)化組為A1B2C2D1； 類黃酮影響因素主次順序為B>C>A>D，類黃酮優(yōu)化組為A3B3C2D2；總皂苷影響因素主次順序為D>B>C>A， 總皂苷優(yōu)化組為A1B3C2D2，其中總多糖和總皂苷均顯著受因素B、C 和D 影響。 與CK 組相比，在此條件下可提高總多糖、生物堿和類黃酮含量，但可略微降低總皂苷含量。 根據(jù)顯著影響情況，確定最佳發(fā)酵條件為A1、B3、C2、D1~ D2。

表6 正交試驗極差分析

表7 正交試驗方差分析

2.4 益生菌發(fā)酵對中草藥毒素指標(biāo)的影響 如表8 和表9 所示，同2.1 分析可得，DON 毒素影響因素主次順序為A>C>B>D，AFB1毒素影響因素主次順序為B>C>D>A，ZEN 毒素影響因素主次順序為A>B>C>D，DON 毒素優(yōu)化組為A1B3C1D2，AFB1毒素優(yōu)化組為A2B3C1D1，ZEN 毒素優(yōu)化組為A1B2C1D2，DON 毒素和ZEN 毒素均主要受因素A、B 和C 的影響，AFB1毒素主要受因素B 的影響，與CK 組相比，在此條件下可降低DON 毒素、AFB1毒素和ZEN 毒素含量。 綜合三種毒素降低情況，從而確定最佳發(fā)酵條件為A1、B3、C1、D1。

表8 正交試驗極差分析

表9 正交試驗方差分析

3 討論

接種量、水料比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時長對中草藥發(fā)酵效果均有較大影響。 接種量的高低會直接影響后期發(fā)酵效果， 過低會造成發(fā)酵緩慢、 效率低、感染雜菌率大，過高會導(dǎo)致菌種生長、營養(yǎng)消耗及細(xì)胞老化過快。 研究表明，當(dāng)菌種濃度為107～108CFU/mL 時， 接種量通常為中草藥質(zhì)量的5% ～20%（黃樹平等，2017； 譚顯東等，2015、2014），因此，在本試驗中接種量為10% ～20%。若水分過低，則會限制細(xì)菌的正常生長，過高則造成透氣性和傳熱性差，均不利于細(xì)菌的生長。由于判定標(biāo)準(zhǔn)不同，文獻報道的水分差異較大，但是多數(shù)為60%左右 （孫會輕，2014； 譚顯東等，2013、2013）。 故此，本試驗水料比為45% ～60%。 酵母菌最適繁殖溫度為18 ～25 ℃，乳酸菌為26 ～30℃，結(jié)合兩種菌的最適生長溫度，本試驗發(fā)酵溫度選擇15 ～35 ℃。 綜合生產(chǎn)實際需要和發(fā)酵效果，中草藥發(fā)酵時長大多為3 ～7 d（袁明貴等，2020；孫曉燕等，2017；武洪志等，2016）。 因而本次試驗發(fā)酵時長與上述天數(shù)一致。

作為有益菌， 乳酸菌和酵母菌均具有抑制致病菌、 提高機體免疫力和防治腹瀉等多種益生作用（牟志勇等，2021；曹振輝等，2015）。而中草藥富含粗纖維，有效成分多存在于植物的根、莖、葉，結(jié)構(gòu)緊密， 在飼喂動物方面具有不易消化和適口性差的缺點（張狀彪等，2016）， 故利用價值大大降低。利用益生菌在生長代謝中產(chǎn)生的酶類代謝物，可破壞植物的細(xì)胞壁，促進有效成分釋放，并能將中草藥中的糖類、 蛋白質(zhì)、 纖維等成分進一步分解，加大藥用價值；同時可降低毒性，分解中草藥中的有毒物質(zhì)， 并產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物 （鮑菊等，2021）。SS 可為乳酸菌的代謝提供能量，在一定范圍內(nèi)， 其含量越高， 發(fā)酵效果越好 （潘佳慧等，2021）。 在本試驗中，SS 含量相較于未發(fā)酵前顯著升高，與周慶民等（2016）結(jié)論一致。升高原因可能是益生菌通過破壞植物的細(xì)胞壁， 將中草藥中粗纖維等物質(zhì)進一步分解（衣福青等，2022）。發(fā)酵條件的優(yōu)化應(yīng)主要考慮發(fā)酵對粗纖維降解效果和物理感官的影響。 蘇家宜等（2017）利用復(fù)合菌劑對山楂、 陳皮、 甘草等組成的中草藥渣進行發(fā)酵后，NDF 和ADF 分別降低7.39%和22.87%，在本次試驗中NDF、ADF 與其一致，其纖維含量顯著降低。

pH 和有機酸是評價發(fā)酵品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，其中發(fā)酵品質(zhì)與LA 含量成正比（陳志龍等，2020）。 在本試驗中通過發(fā)酵使LA 含量升高，從而提高發(fā)酵中草藥利用率，這與Mariele（2019）等的研究結(jié)果一致。 AA 具有抑制有害菌生長和繁殖的能力，可為乳酸菌生長繁殖提供有利環(huán)境，從而促進乳酸發(fā)酵，提高發(fā)酵飼料質(zhì)量（牟愛生等，2022）。 徐祗瑞等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵濕豆渣后，pH 降低， 改善了其飼料品質(zhì)。 魏愛彬等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌發(fā)酵飼料后pH 呈明顯下降趨勢，4.2 左右趨于穩(wěn)定。 由于本次試驗與青貯發(fā)酵工藝類似， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA 含量上升，pH 下降與張立冬（2021）試驗結(jié)果一致。

AFB1、ZEN 和DON 毒素最為常見，AFB1毒素主要會造成飼料中有效成分的流失（白薩茹拉等，2021），ZEN 毒素主要影響動物的繁殖性能（Tsakmakidis 等，2006）， 而DON 毒素會使動物出現(xiàn)厭食、腹瀉、生產(chǎn)性能降低等中毒癥狀（白薩茹拉等，2021）。 研 究 表 明，AFB1、ZEN 毒 素 易 被 乳 酸 菌（Taheur 等，2017） 和酵母菌（錢潘攀等，2017）吸附。 而益生菌發(fā)酵中草藥可通過微生物的轉(zhuǎn)化作用將有毒物質(zhì)分解， 或者對藥材中的毒性成分進行修飾使其毒性減低或者消除（王興紅等，2001）。Mokoena 等（2005）報道，乳酸菌在發(fā)酵的第3 天就可以使加入的ZEN 降低68%，在第4 天就可以降低75%， 然而ZEN 也可被部分酵母菌降解，酵母菌代謝產(chǎn)生的丙酮酸和鹽類物質(zhì)通過促進乳酸菌生長代謝，產(chǎn)生乳酸，抑制霉菌生成（侯然然，2007）， 而且酵母細(xì)胞具有可吸附AFB1、ZEN 等霉菌毒素的特殊空間結(jié)構(gòu)（田吉鵬，2017）。 王曉敏等 （2021） 等研究發(fā)現(xiàn)， 復(fù)合益生菌可降解AFB1、ZEN 和DON 這三種霉菌毒素。 本試驗中與未發(fā)酵組中草藥相比， 發(fā)酵后三種毒素均有不同程度的下降趨勢。 最適水含量條件下顆粒間存在合適的疏松度， 利于氧氣的溶入和二氧化碳的排出，促進了微生物菌體生長，提高發(fā)酵品質(zhì)（段婭寧等，2012）。 因此可以認(rèn)為益生菌發(fā)酵可以降低霉菌毒素的含量。 王旭哲（2016）研究表明， 毒素含量與發(fā)酵過程中緊實度有著很大的關(guān)系，且隨著處理緊實度提高而減少。

總多糖（黃純瑩等，2020）、生物堿、類黃酮及總皂苷是中草藥的主要活性成分， 具有增強免疫機能、抑制細(xì)菌、提高抗病能力（艾素等，2019）等作用。多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效。 劉洋等（2017）用益生菌發(fā)酵王不留行和益母草粗多糖含量提高了127.28%。有研究表明，生物堿可作為治療劑和抗增殖劑， 從而抑制細(xì)菌生長（Liew等，2014）。 杜 晨 暉 等 （2016） 利 用 釀 酒 酵 母ATCC9763 和GIM2.9 對葛根芩連湯進行發(fā)酵后總生物堿含量均顯著升高。 皂苷和黃酮類化合物具有降脂、降壓、抗菌消炎等功效。 賈艷姝（2012）將黃芪進行發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)， 黃芪總皂苷與總黃酮含量分別提高約22%、13.6%，說明發(fā)酵能更深入釋放黃芪中的有效成分。 Shim 等（2013）研究表明，與未發(fā)酵Hwangryun-haedok-tang （HRT） 相比，HRT 發(fā)酵后產(chǎn)生不同的類黃酮譜。 還有研究表明，發(fā)酵中草藥后總黃酮、總生物堿和總皂苷含量均提高了55%左右（劉洋等，2017）。 在本試驗中，相較于對照組， 不同處理水平的中草藥在發(fā)酵后類黃酮呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明， 營養(yǎng)成分指標(biāo)最佳發(fā)酵條件為A2、B2、C2~ C3、D2；發(fā)酵指標(biāo)最佳發(fā)酵條件為A1~ A2、B3、C2、D2。 中草藥活性成分最佳發(fā)酵條件為A1、B3、C2、D1~ D2； 毒素指標(biāo)最佳發(fā)酵條件為A1、B3、C1、D1。 綜合大多數(shù)指標(biāo)考慮，最終確定最佳發(fā)酵條件為：A1、B3、C2、D2，即接種量10%、水料比0.60：1、溫度25 ℃、發(fā)酵天數(shù)5 d。