微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中生物素含量的不確定度評定

趙 盼，張 瑞，張雅倫，范素芳，王 贊，郭麗敏*

（河北省食品安全重點實驗室，國家市場監(jiān)管重點實驗室（特殊食品監(jiān)管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050227）

嬰幼兒配方乳粉是在乳類中添加適量的維生素、礦物質等，用物理方法制成，供嬰幼兒食用的產品[1]。生物素，又稱VH、輔酶R，分子式C10H16N2O3S，是水溶性B族維生素，可合成VC，用于脂肪和蛋白質正常代謝，無法經由人工合成[2-5]，它具有維持人體自然生長發(fā)育、增強機體免疫力和抵抗力、有助于脂肪代謝、預防白發(fā)和脫發(fā)、維持皮膚正常功能等作用。食品中生物素的檢測[6]通常使用生物法，近年來微生物法已成為食品安全國家強制標準，是嬰幼兒配方食品標準中指定的檢測方法，具有檢出限低[7]、精確度高等優(yōu)點。生物素是植物乳桿菌生長所必需的營養(yǎng)素，在生物素測定培養(yǎng)基中，植物乳桿菌的生長與待測試樣中生物素含量呈線性關系，利用這一特性，根據(jù)透光率與標準工作曲線進行比較，即可計算出試樣中待測物質的含量[2-3]。

由于檢測過程可能受方法、人員、樣品、量器、標準物質、儀器設備及環(huán)境條件等的影響，容易造成檢測結果出現(xiàn)分散性。對檢測過程中可能存在的不確定度進行評定，以提高檢測結果的準確度，避免因實驗人員操作及檢測方法的不足對檢測結果造成影響，可得到更加真實、客觀的檢測結果[8-10]。本研究按照GB 5009.259—2016《食品安全國家標準 食品中生物素的測定》，采用微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中生物素含量，通過分析和評定實驗中的不確定度來源，計算出測量值的擴展不確定度，為嬰幼兒配方乳粉中生物素的檢測結果評定提供一定的指導，同時為生物法測定其他維生素的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品A、B、C是從乳粉生產企業(yè)經濕法工藝定制而成的不同生物素含量嬰幼兒配方乳粉。

生物素標準品（規(guī)格100 mg/瓶，純度99.9%）天津阿爾塔科技有限公司；生物素測定培養(yǎng)基（規(guī)格100 g/瓶） 北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2700紫外分光光度計（精確度1 mg）日本島津公司；MIR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司；HVE-50自動高壓滅菌器 日本Hirayama公司；AC2-4S1生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

生物素標準儲備液（100 μg/mL）、生物素標準中間液（1.0 μg/mL）、生物素標準工作液（10 ng/mL）、標準使用液（Ⅰ：0.2 ng/mL，Ⅱ：0.1 ng/mL）分別按照GB 5009.259—2016《食品安全國家標準 食品中生物素的測定》配制。

1.3.2 接種液的制備

按照GB 5009.259—2016《食品安全國家標準 食品中生物素的測定》制備。

1.3.3 樣品前處理

分別稱取樣品A、B、C各10 份，精確至0.001 g，于250 mL錐形瓶中，加入體積分數(shù)3%硫酸溶液100 mL，121 ℃水解30 min，冷卻后用10 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至4.5，轉到250 mL容量瓶中，用自制的超純水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初幾毫升。吸取濾液5 mL，加入約20 mL水，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為6.8，轉至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，作為待測液備用。

1.3.4 檢測過程

取4 只試管，分別加入1、2、3、4 mL試樣待測液，補水至5 mL，加入5 mL生物素測定用培養(yǎng)基，混勻，121 ℃滅菌5 min，快速冷卻至室溫，在無菌操作條件（通過自動高壓滅菌器滅菌，然后在生物安全柜操作）下，向每支測定管接種1 滴（約50 μL）接種液，其中標準曲線管未接種，空白和樣品空白除外。（37±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，獲得最大混濁度，再培養(yǎng)2 h透光率無明顯變化[11-12]。

用紫外分光光度計測定吸光度，繪制標準曲線，測定試樣中生物素含量。

1.3.5 數(shù)學模型建立

試樣消化液中生物素的質量濃度用紫外分光光度計測定，試樣中生物素含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中生物素的含量/（μg/100 g）；ρ為試樣中生物素質量濃度平均值/（ng/mL）；f為樣液的稀釋倍數(shù)；m為稱取試樣質量/g；100、1 000均為換算系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)檢測過程對影響生物素檢測結果的各不確定度分量來源進行分析評估，不確定度的來源主要有樣品重復性檢測、標準物質及標準溶液配制、樣品稱量及稀釋制備、標準曲線擬合、紫外分光光度計產生的不確定度等[7,13-16]。具體魚骨圖見圖1。

圖1 嬰幼兒配方乳粉中生物素檢測不確定度來源Fig.1 Sources of uncertainty in the detection of biotin in infant formula

2.2 不確定度評定

2.2.1 重復性檢測產生的不確定度urel（x）

樣品A、B、C分別測定10 次，檢測結果見表1。

表1 樣品重復性檢測結果Table 1 Results of sample repeatability testμg/100 g

按A類不確定度[17-20]，根據(jù)貝塞爾公式（2）計算重復檢測標準偏差（s），2 次重復測定產生的不確定度（u）按式（3）計算，相對標準不確定度（urel）按式（4）計算。

式中：n表示測定次數(shù)。

樣品A重復檢測標準偏差s（xA）=0.893 μg/100 g，重復性檢測產生的不確定度u（xA）=0.632 μg/100 g，相對標準不確定度urel（xA）=0.031 8。

樣品B重復檢測標準偏差s（xB）=0.875 μg/100 g，重復性檢測產生的不確定度u（xB）=0.618 μg/100 g，相對標準不確定度urel（xB）=0.020 4。

樣品C重復檢測標準偏差s（xC）=2.345 μg/100 g，重復性檢測產生的不確定度u（xC）=1.658 μg/100 g，相對標準不確定度urel（xC）=0.031 2。

2.2.2 標準溶液配制產生的不確定度urel（C）

2.2.2.1 標準物質純度產生的不確定度urel（p）

根據(jù)生物素標準品證書，其純度為99.9%，擴展不確定度為±0.5%，包含因子k＝2，取正態(tài)分布[21]，則由生物素標準品純度產生的不確定度按式（5）計算，相對標準不確定度按式（6）計算。

2.2.2.2 天平稱量產生的不確定度urel（m）

用電子天平準確稱取生物素標準品100.3 mg，不確定度主要來源于天平稱量，電子天平檢定證書給出的天平示值誤差（稱量范圍為0～50 g）為0.3 mg，產生的不確定度為u（m1），天平重復性為0.3 mg，產生的不確定度為u（m2），取均勻分布[15,17,22]，均按式（7）計算，天平稱量誤差產生的不確定度按式（8）計算，天平稱量產生的相對不確定度按式（9）計算。

2.2.2.3 標準溶液移取、定容產生的不確定度urel（c）

生物素標準溶液移取、定容時產生的不確定度來源主要是使用的玻璃量器和液體體積膨脹[23-24]。標準溶液移取、定容使用250、500、1 000 mL容量瓶各1 次，100 mL容量瓶、1、5 mL分度吸量管各2 次，容量瓶、分度吸量管為A級，均計量檢定合格，根據(jù)JJG 196—2006《玻璃儀器檢定規(guī)程》查得容量允差[25]，歐盟分析化學中心認為服從三角分配[26-29]，由玻璃器皿容量允差產生的相對不確定度按計算，詳見表2。

表2 玻璃量器產生的不確定度Table 2 Uncertainty arising from volumetric glassware

玻璃量器產生的相對標準不確定度按式（10）計算。

實驗室溫度變化介于（20±3） ℃，因溫度效應導致的試液體積變化為±αVΔT，α為水的膨脹系數(shù)，在20 ℃時為2.1×10-4，溫度差ΔT為3 ℃，V為定容體積。最大允許誤差的不確定度服從矩形分布，按照B類評定，定容液體積膨脹產生的相對不確定度按式（11）計算。

全部定容液體積膨脹產生的相對標準不確定度按式（12）計算。

標準溶液移取、定容產生的不確定度按式（13）計算。

標準溶液配制產生的不確定度按式（14）計算。

2.2.3 樣品稱量及稀釋制備產生的不確定度urel（T）

2.2.3.1 樣品稱量產生的不確定度urel（m）

樣品稱量產生的不確定度主要來源于天平稱量，樣品A、B、C稱樣量分別為2.500 4、1.500 0、1.000 4 g，天平稱量誤差產生的不確定度u（m）=0.244 9 mg，天平稱量產生的相對不確定度urel（mA）=0.000 098，urel（mB）=0.000 163，urel（mC）=0.000 245（計算方法同2.2.2.2節(jié)）。

2.2.3.2 樣品稀釋制備產生的不確定度urel（V）

樣品稀釋制備產生的不確定度來源主要有標準溶液移取、定容使用的玻璃量器和液體體積膨脹，其中使用250、100 mL容量瓶、5 mL分度吸量管各1 次，產生的不確定度按式（15）計算（計算方法同2.2.2.3節(jié)的玻璃量器）。

溫度波動±3 ℃，因溫度波動液體體積膨脹產生的標準不確定度按式（16）計算。

樣品稀釋制備產生的相對不確定度按式（17）計算。

樣品稱量及稀釋制備產生的相對不確定度按式（18）計算。

計算得urel（TA）=0.002 19，urel（TB）=0.002 19，urel（TC）=0.002 20。

2.2.4 標準曲線擬合產生的不確定度urel（ρ）

用100 μg/mL生物素標準溶液配制系列標準溶液，其含量分別為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 ng。實驗采用8 個濃度水平標準溶液，得出吸光度，結果見表3。

表3 生物素標準曲線數(shù)據(jù)表Table 3 Data for preparation of biotin standard curve

表3采用最小二乘法線性回歸求得R2=0.987 5，斜率B1=0.527 1，截距B0=0.163 9，回歸曲線方程為式（19）。標準曲線擬合的不確定度按式（20）～（22）計算。

式中：SY/C為回歸曲線的強度測量標準差；B0為截距；B1為斜率；Yij為儀器測得的吸光度（生物素含量為Ci時）；B0＋B1Ci為按標準曲線計算的理論吸光度（生物素含量為Ci時）；m為生物素含量點數(shù)；n為每個點測量次數(shù)；為標準系列管各管生物素含量的平均值/ng，Cj為標準系列管中各生物素含量/ng；Cx為樣品測試系列管中生物素含量的平均值/ng；p為樣品系列管測定次數(shù)[7,15,30]。

按照GB 5009.259—2016檢測各試樣測試管的吸光度，依據(jù)標準曲線查得各試樣測試管中生物素含量，數(shù)據(jù)見表4。

表4 試樣系列管中生物素含量Table 4 Results of determination of biotin contents in dilutions of three samples

樣品A標準曲線擬合的不確定度和相對不確定度分別按式（23）～（24）計算。

同理計算，樣品B標準曲線擬合的不確定度u（ρB）=0.016 12 ng，相對不確定度urel（ρB）=0.069 3，樣品C標準曲線擬合的不確定度u（ρC）=0.015 37 ng，相對不確定度urel（ρC）=0.059 1。

2.2.5 擴展不確定度及結果表示

根據(jù)上述各相對不確定度分量，合成相對標準不確定度urel按式（25）計算，合成標準不確定度u按式（26）計算，擴展不確定度U按式（27）計算。

計算得：urel（A）=0.071 4，urel（B）=0.072 6，urel（C）=0.067 2。

計算得：u（A）=1.418 μg/100 g，u（B）=2.203 μg/100 g，u（C）=3.573 μg/100 g。

計算得：U（A）=2.837 μg/100 g，U（B）=4.406 μg/100 g，U（C）=7.146 μg/100 g。

各相對不確定分量的貢獻率見表5。

表5 相對不確定度分量的貢獻率Table 5 Contribution of uncertainty components

3 結 論

通過對嬰幼兒配方乳粉中生物素含量的檢測結果進行不確定度評定，得出在95%置信區(qū)間內，當檢測結果為19.87 μg/100 g時，擴展不確定度為2.84 μg/100 g，當檢測結果為30.35 μg/100 g時，擴展不確定度為4.41 μg/100 g，當檢測結果為53.15 μg/100 g時，擴展不確定度為7.15 μg/100 g?？梢?，隨著樣品中生物素含量的增高，檢測結果的擴展不確定度也隨之增大。在各個不確定度分量中，標準曲線擬合的影響最大，其次為重復性檢測，其影響大小依次為標準曲線擬合urel（ρ）＞重復性檢測urel（x）＞標準物質及標準溶液配制urel（C）＞樣品稱量及稀釋制備urel（T）。因此，建議在日常檢驗時，增加標準曲線及重復性檢測的次數(shù)，提高檢測技術人員的水平，以提高檢測結果準確性，更好地為食品質量安全檢測技術服務提供保障。