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    梨花藥愈傷組織誘導(dǎo)和懸浮培養(yǎng)體系的建立及應(yīng)用

    2023-09-10 01:21:49莊夢弟李濤辛騫祎周夢瑤張海霞馬輝錢稷張玉星亓寶秀許建鋒
    果樹學(xué)報 2023年3期
    關(guān)鍵詞:愈傷組織

    莊夢弟 李濤 辛騫祎 周夢瑤 張海霞 馬輝 錢稷 張玉星 亓寶秀 許建鋒

    摘要:【目的】建立梨懸浮細(xì)胞體系,并利用懸浮細(xì)胞體系獲得高質(zhì)量懸浮細(xì)胞,進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的分離。【方法】以新梨7 號花藥為試材,誘導(dǎo)獲得梨花藥愈傷組織,研究了細(xì)胞懸浮系建立和影響懸浮細(xì)胞增殖的主要因子?!窘Y(jié)果】花藥在1/2 MS + 1.0 mg·L-1 2,4-D + 0.4 mg·L-1 NAA + 30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂(pH值為5.8~6.0)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織,經(jīng)4~5 次繼代得到了黃白色、顆粒狀,狀態(tài)相對較好的愈傷組織;將愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中,于28 ℃,200 r·min-1的黑暗條件下懸浮振蕩培養(yǎng),經(jīng)4~5次懸浮繼代培養(yǎng)建立了懸浮細(xì)胞系,適宜的啟動和增殖培養(yǎng)基為:MS + 1.5 mg·L-1 2,4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖,細(xì)胞生長曲線呈“S”型,活細(xì)胞率達(dá)81.98%,近圓細(xì)胞率達(dá)83.66%,可作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體,轉(zhuǎn)化率為20.00%。也可直接用于原生質(zhì)體的分離,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)3.67×106 個·mL-1,活力可達(dá)92.00%?!窘Y(jié)論】建立了梨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系,利用所建體系獲得了高質(zhì)量的懸浮細(xì)胞,可直接用于遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的分離。

    關(guān)鍵詞:梨;愈傷組織;細(xì)胞懸浮培養(yǎng);生長曲線

    中圖分類號:S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1009-9980(2023)03-0577-11

    梨是薔薇科(Rosaceae)梨屬(Pyrus)植物,是中國三大果樹之一,在農(nóng)村區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民脫貧致富、鄉(xiāng)村振興等方面起了重要作用[1]。

    梨自花結(jié)實率低,生長周期長、影響因素復(fù)雜多樣,基因組高度雜合[2]。這些特性給梨遺傳轉(zhuǎn)化和品種改良帶來嚴(yán)重障礙?;ㄋ幣囵B(yǎng)是由花粉小孢子產(chǎn)生單倍體植株的一種重要途徑,可以有效地縮短育種年限,加快新品種選育進(jìn)程,其在遺傳育種中的意義重大。因此,非常有必要開展梨花藥培養(yǎng)的研究?;ㄋ幣囵B(yǎng)是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù),將發(fā)育到特定階段的花藥取出轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中生長,從而改變花藥內(nèi)部的生理狀態(tài),使其在離體條件下分化成胚狀體或形成無分化的愈傷組織。目前,國內(nèi)外關(guān)于梨樹花藥離體培養(yǎng)的研究比較少。1975 年,Jordan[3]在西洋梨花藥培養(yǎng)上獲得小原胚;1978 年,山東農(nóng)學(xué)院梨花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織[4];1996 年,薛光榮等[5]在錦豐梨的花藥培養(yǎng)上誘導(dǎo)出胚狀體,但誘導(dǎo)率不穩(wěn)定。

    花藥的細(xì)胞全能性較高,由其誘導(dǎo)出來的愈傷組織具有較強的分裂和分化能力;以花藥愈傷組織為材料進(jìn)行植物懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,具有材料均一、重復(fù)性好、條件易于控制、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點[6]。植物懸浮細(xì)胞是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體之一,用懸浮細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化受體可提高轉(zhuǎn)化率,因此,穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系對遺傳轉(zhuǎn)化起到了巨大的促進(jìn)作用。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體的條件下,將愈傷組織或者其他易于分散的組織置于液體培養(yǎng)基中,通過振蕩的方式得到分散的細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán),使其保持良好的生長狀態(tài)且可以不斷增殖的技術(shù)。1958 年,美國的Steward等[7]建立了胡蘿卜的懸浮體系,隨后懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于草本植物。對木本植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究起步較晚,1975 年,Wilson 等[8]建立了橡膠懸浮體系。1991 年,王影等[9]建立了小葉楊的懸浮細(xì)胞體系。此后,經(jīng)過20 多年的發(fā)展,中國在木本植物的研究中也取得了一系列的進(jìn)展,如荔枝、葡萄、花椒樹等也建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,但關(guān)于梨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面未見報道[10-13]。

    筆者在本研究中以新梨7 號花藥為試材,對花藥愈傷組織的獲得、增殖及懸浮培養(yǎng)等條件進(jìn)行了研究,以期獲得高質(zhì)量的梨細(xì)胞懸浮系,懸浮培養(yǎng)獲得的小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞可以直接用于原生質(zhì)體的分離,也可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的直接受體,為梨大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)以及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    以河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園栽植的新梨7 號花藥為試材。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代 選取處于“緊湊期”(花蕾橫徑為2.7~3.0 mm,縱徑為8.0~8.5 mm)的花蕾,將花蕾表面用清水沖洗3~5 次洗去灰塵,然后在無菌工作臺上按照先75%乙醇浸泡25 s,再用0.1%HgCl2消毒8 min,最后用無菌水沖洗3~4 次。剝開花蕾取出花藥,將獲得的無菌花藥接種于1/2 MS +1.0 mg·L-1 2,4-D + 0.4 mg·L-1 NAA + 30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂(pH 值5.8~6.0)培養(yǎng)基中,(24±1)℃暗培養(yǎng)30 d。

    選取黃白色、較松散且活性較高的愈傷組織,接種于6-BA(0.5、1.0、1.5 mg · L- 1)與2,4-D(1.0、1.5、2.0 mg·L- 1)的激素配比組合(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS +30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂)中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),完全隨機組合,共9 個處理。每個處理3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同。

    1.2.2 懸浮細(xì)胞系的初代培養(yǎng) 細(xì)胞懸浮無菌培養(yǎng)基以MS + 30 g·L-1蔗糖為基本培養(yǎng)基,添加不同質(zhì)量濃度的生長調(diào)節(jié)劑2,4-D、6-BA(表1),以不添加生長調(diào)節(jié)劑的為對照,pH值5.8~6.0。

    將分散性好、疏松的愈傷組織,用鑷子夾碎將其轉(zhuǎn)移到裝有40 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行懸浮振蕩培養(yǎng)。28 ℃,暗培養(yǎng),培養(yǎng)周期為8 d,接種量為1.5 g,搖床轉(zhuǎn)速為200 r ·min-1,進(jìn)行啟動培養(yǎng),每個處理3 次重復(fù)。

    1.2.3 懸浮細(xì)胞增殖培養(yǎng) 取出裝有懸浮物質(zhì)的三角瓶,靜置15~20 min,倒掉2/3 的液體培養(yǎng)基,然后加入與倒掉液體相同體積的新鮮培養(yǎng)基并用無菌玻璃棒將里面的大塊愈傷組織壓碎。以后每隔7 d 繼代1 次,21 d 后用150 μm的細(xì)胞篩過濾,獲得的細(xì)小均勻的懸浮物質(zhì)繼續(xù)懸浮培養(yǎng),得到顆粒分散、穩(wěn)定性好的懸浮細(xì)胞系。全過程無菌操作,培養(yǎng)條件同1.2.2。

    1.2.4 懸浮細(xì)胞生長量的測定 自穩(wěn)定懸浮系被繼代的當(dāng)天起,每隔1 d 取懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長量測定。每隔1 d 取2 mL懸浮物質(zhì),離心稱質(zhì)量,即為鮮質(zhì)量。60 ℃下烘干12 h 后稱質(zhì)量,即為干質(zhì)量。

    取懸浮液2 mL, 放入2 mL 刻度的離心管中,4500 r · min-1 下離心5 min,得到的細(xì)胞體積即為細(xì)胞密實體積(PCV)。每個處理3 次重復(fù)。

    1.2.5 懸浮細(xì)胞死亡率的測定 選取生長穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞,每隔1 d 取1 mL 進(jìn)行懸浮細(xì)胞死亡率測定。用0.4%的臺盼藍(lán)染色3 min, 蒸餾水洗滌3 次,于20倍顯微鏡下觀察其死亡個數(shù),統(tǒng)計死亡率。

    1.3 懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

    將經(jīng)懸浮培養(yǎng)后獲得的活力較強的愈傷組織材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化,浸染流程參照王林蘋果愈傷浸染方法并對浸染液濃度、浸染時間等稍作修改[14]。具體流程為將活化好含有pROK2-GFP 質(zhì)粒的GV3101 農(nóng)桿菌液離心重懸,重懸后的浸染液(OD600為0.5)與愈傷組織置于28 ℃恒溫?fù)u床(100 r·min-1)在黑暗條件培養(yǎng)浸染15 min;將浸染后的愈傷吸干水分后置于共生培養(yǎng)基(MS + 1.5 mg·L-1 2,4-D + 1.0 mg·L-16-BA),黑暗條件下共培養(yǎng)3 d,然后將其接種到篩選培養(yǎng)基(MS +1.5 mg·L- 1 2,4-D + 1.0 mg·L- 1 6-BA +20 mg·L- 1 Basta + 300 mg·L- 1 Cef + 200 mg·L- 1 Timentin),黑暗條件下培養(yǎng)20 d。用手持熒光蛋白觀測燈(LUYOR-3415 RG Hand-Held Lamp,路陽,美國)拍照,計算轉(zhuǎn)化率。

    1.4 原生質(zhì)體的分離及產(chǎn)量、活力測定

    生長穩(wěn)定懸浮細(xì)胞系,取其第4 天時懸浮細(xì)胞為材料,6000 r ·min-1離心5 min。酶解液成分為:纖維素酶(1.0%)、離析酶(0.5%)、1 mL MES pH 5.7(20 mmol · L- 1)、5 mL 甘露醇(0.5 mol · L- 1)、2.5 mLKCl(20 mmol·L-1)、無菌水定容到10 mL。55 ℃水浴10 min,冷卻至室溫25 ℃,加10 mmol·L- 1 CaCl2,0.1%牛血清蛋白(BSA)用0.45 μm的濾頭過濾。25 ℃黑暗條件下30 r·min-1恒溫振蕩12 h。將酶解后的材料進(jìn)行純化,加入W5 solution[其成分為2 mmol?L-1MES(pH 5.7)+ 154 mmol?L- 1 NaCl+125 mmol?L- 1CaCl2 + 5 mmol?L-1 KCl],120 r·min-1離心4 min,離心3次。

    用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體的產(chǎn)量。檢測活力采用FDA染色法:FDA溶于丙酮,用蔗糖稀釋,4 ℃保存。使用時取1 滴母液與1 滴原生質(zhì)體懸浮液混合到一起,室溫下靜置5~10 min后熒光下觀察。

    1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Excel 2013 和SPSS 24 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 愈傷組織的獲得及增殖培養(yǎng)

    接種10 d 后,開始從花藥中部慢慢長出愈傷組織,沒有長出愈傷組織的花藥慢慢褐化死亡。

    花藥接種30 d 后形成的愈傷組織塊,一部分愈傷組織微褐化,呈柔軟水漬狀為濕軟型愈傷;一部分愈傷為黃白色,結(jié)構(gòu)緊密,含水量少,此類愈傷經(jīng)過4 個月的繼代培養(yǎng)后即可獲得表面有顆粒狀突起結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織,可用來作為懸浮培養(yǎng)的材料。

    新梨7 號花蕾(圖1-A)在“緊湊期”愈傷誘導(dǎo)率達(dá)45.80%,此時期的花藥(圖1-B)顏色為粉白色,花藥難以剝離。在6-BA質(zhì)量濃度一定時,隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加,結(jié)構(gòu)由緊湊型(圖1-C)向疏松型(圖1-D)轉(zhuǎn)變,愈傷組織狀態(tài)相對較好,增殖較多;反之,在2,4-D質(zhì)量濃度一定時,隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加愈傷組織狀態(tài)相對較差,質(zhì)地堅硬增殖較少或基本不增殖(表2)。最終在MS + 1.5 mg·L-1 2,4-D +1.0 mg·L-1 6-BA的激素質(zhì)量濃度配比下經(jīng)過4~5 次的繼代即可得到生長旺盛且活性強的疏松愈傷,可用來進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

    2.2 激素對梨愈傷懸浮細(xì)胞生長的影響

    不同質(zhì)量濃度的2,4-D 與6-BA 的組合對梨懸浮細(xì)胞狀態(tài)存在較大影響(表3)。在2,4-D質(zhì)量濃度為1.0~1.5 mg·L-1時,隨著6-BA質(zhì)量濃度的提高活細(xì)胞率及近圓細(xì)胞率數(shù)值均有所升高,懸浮液狀態(tài)也達(dá)到好的狀態(tài);而在2,4-D質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時,隨著6-BA質(zhì)量濃度的提高其圓細(xì)胞及活細(xì)胞率數(shù)值均有所下降,但兩者均顯著高于對照(圖2-B~C)。在2,4-D 質(zhì)量濃度為1.5 mg · L- 1,6-BA 為1.0 mg·L-1時,細(xì)胞活細(xì)胞(圖2-F)率達(dá)到81.98%,近圓細(xì)胞(圖2-E)率達(dá)到83.66%,此時懸浮液狀態(tài)也達(dá)到最好(圖2-D)。綜上所述,L6培養(yǎng)基為最適合梨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

    2.3 懸浮細(xì)胞系的建立及細(xì)胞學(xué)觀察

    將上述經(jīng)繼代培養(yǎng)得到的疏松愈傷組織,轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。愈傷組織在懸浮培養(yǎng)1 周后出現(xiàn)長形細(xì)胞(圖3-D),細(xì)胞多為空的且活力不高,在以后的繼代過程中逐步淘汰。2~3 周散出來的既有長形細(xì)胞又有圓形小細(xì)胞團(tuán)(圖3-E),但長細(xì)胞占比相對較大。4 周后長形細(xì)胞消失,多為圓形小細(xì)胞團(tuán),單細(xì)胞少量存在。最終建立起來的細(xì)胞懸浮系(圖3-F)基本沒有長形細(xì)胞,都是由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成,也會時常出現(xiàn)多細(xì)胞聚集現(xiàn)象,大多數(shù)細(xì)胞呈圓球形且含有豐富的內(nèi)含物質(zhì)(圖3-C)。故在前三次繼代時,應(yīng)待懸浮系沉淀后倒去上層2/3 的培養(yǎng)液,去除死細(xì)胞和空細(xì)胞。

    2.4 懸浮細(xì)胞系生長曲線和死亡率的測定

    由圖4 可知,梨懸浮細(xì)胞生長量呈“S”型生長曲線,0~2 d 懸浮物質(zhì)生長量小為遲滯期,細(xì)胞死亡率維持在13.97%~22.50%;2~4 d 以后細(xì)胞體積、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量明顯增加即為進(jìn)入對數(shù)期,是細(xì)胞增殖、生長發(fā)育最明顯的時期,該時期的細(xì)胞死亡率最低,為13.97%~15.40%;4~6 d 細(xì)胞生長較平穩(wěn),生長速度逐漸降低,此時鮮質(zhì)量為0.22 g,干質(zhì)量為0.05 g,均達(dá)到最大值進(jìn)入了靜止期,這一時期的細(xì)胞死亡率為15.40%~19.14%;6 d 以后開始進(jìn)入衰亡期,細(xì)胞鮮質(zhì)量、密實體積逐漸趨于下降趨勢,此時則認(rèn)為是懸浮培養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入了衰亡期,細(xì)胞死亡率為19.14%~19.18%;同時觀察到厚厚一層的衰敗細(xì)胞堆集在瓶壁上,不利于懸浮細(xì)胞系的生長。在0~8 d的繼代周期內(nèi),以花藥為外植體獲得的愈傷組織細(xì)胞懸浮系存活率均超過77.50%,細(xì)胞的死亡率均維持在22.5%以下(圖4),說明懸浮細(xì)胞的活性較強,絕大數(shù)細(xì)胞的生長狀態(tài)良好。

    綜上,細(xì)胞懸浮系生長曲線、懸浮細(xì)胞死亡率之間存在著一定的對應(yīng)關(guān)系,建立了梨懸浮細(xì)胞系,并且確定了2~4 d 內(nèi)的懸浮細(xì)胞生長狀態(tài)最好,活力最高,這一時期的細(xì)胞分裂速度很快。因此,可以選擇此時期的懸浮液來開展后續(xù)工作。

    2.5 懸浮細(xì)胞系生長情況

    將經(jīng)懸浮培養(yǎng)后的愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基中,得到了活性很強的愈傷組織,分裂速度快,狀態(tài)良好,一般15~20 d 即可達(dá)到試驗所需生長量;而未經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織15~20 d 才進(jìn)入快速生長期(圖5)。光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)1 個月后,愈傷組織的狀態(tài)基本相同,光培養(yǎng)下顏色稍微偏深乳黃色一點并且經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織繼代后分裂速度也比未經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織分裂速度快,顏色差異也較明顯(圖6)。經(jīng)懸浮培養(yǎng)得到的愈傷組織呈乳黃色(圖6-C),活力以及分裂能力均較強;而未經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織呈黃白色(圖6-D),生長量和活性均不如經(jīng)懸浮培養(yǎng)的愈傷組織(圖5)。

    2.6 梨懸浮細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化

    利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S::GFP 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至經(jīng)懸浮培養(yǎng)的梨愈傷組織。熒光觀察結(jié)果表明,愈傷組織呈現(xiàn)綠色(圖7),表明35S::GFP 已轉(zhuǎn)化至其中,轉(zhuǎn)化率為20.00%。

    2.7 原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力鑒定

    用1%的纖維素酶+0.5%離析酶組合提取的原生質(zhì)體(圖8-A)產(chǎn)量達(dá)到3.67×106個·mL-1,用FDA染色(圖8-B)進(jìn)行活力鑒定,原生質(zhì)體活力為92.00%。

    3 討論

    懸浮細(xì)胞懸浮液狀態(tài)、活細(xì)胞率及近圓細(xì)胞率、懸浮細(xì)胞生長量以及后期生長情況是確定懸浮細(xì)胞生長是否正常和懸浮培養(yǎng)體系是否建立成功的重要指標(biāo)[15]。筆者在本文中研究了不同質(zhì)量濃度激素對梨愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響,并通過對梨懸浮培養(yǎng)條件的研究,建立了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系,結(jié)果表明除要選擇疏松狀態(tài)的愈傷組織為材料進(jìn)行培養(yǎng)外,還要考慮到培養(yǎng)基的滲透壓、激素種類及質(zhì)量濃度,以及合適的轉(zhuǎn)速、繼代周期及繼代比例等,才能最終得到一個好的懸浮細(xì)胞系。

    前人研究表明,適宜的培養(yǎng)基激素種類及配比是愈傷組織以及細(xì)胞懸浮系快速增殖的關(guān)鍵因素[16-17]。本研究結(jié)果表明,2,4-D質(zhì)量濃度對愈傷的誘導(dǎo)與增殖起著關(guān)鍵作用,增殖量隨2,4-D質(zhì)量濃度升高而升高[18-20],這與前人研究結(jié)果一致。李艷敏等[21]將2,4-D與NAA、KT 組合使用,作為芍藥花藥愈傷組織培養(yǎng)基。在適宜的增殖質(zhì)量濃度下,經(jīng)過4~5 次繼代后即可得到表面有顆粒狀突起結(jié)構(gòu)的疏松愈傷,與前人研究結(jié)果一致。2,4-D和6-BA搭配為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳組合,因此本試驗采用MS + 1.5 mg·L-1 2,4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA建立了懸浮細(xì)胞體系。還有其他文獻(xiàn)研究表明在懸浮細(xì)胞的長期繼代培養(yǎng)過程中添加KT(細(xì)胞分裂素),KT以一個較低質(zhì)量濃度,一般選擇為0.1 mol·L-1為宜,較高質(zhì)量濃度會造成褐化現(xiàn)象[22]。

    在整個懸浮培養(yǎng)的過程中植物懸浮細(xì)胞開始培養(yǎng)時的接種量以及繼代周期、新舊培養(yǎng)基比例等是重要的影響因子,對于不同發(fā)育時期生長周期的長短及細(xì)胞生長增殖周期有顯著影響。張正雪等[23]認(rèn)為起始接種量為3 g時生長速率可達(dá)到最高,本研究起始接種量為1.5 g,究其原因可能是因為不同植物所需要的最低臨界生長密度不同。其新舊培養(yǎng)基比例為2∶1,梨懸浮細(xì)胞的生長曲線呈“S”型[24],與前人研究一致。0~2 d為遲滯期,2~4 d為對數(shù)期,4~6 d為靜止期。在一個繼代周期內(nèi),細(xì)胞的死亡率維持在23%以下,表明懸浮細(xì)胞狀態(tài)良好,活性很強。王磊等[25]研究表明接種15 d 是懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)的較佳時期。本文適宜繼代周期為7 d,與前人研究不同,這可能是因為梨愈傷組織在適宜的懸浮培養(yǎng)條件下分裂能力較強,導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被過早的消耗殆盡,從而縮短了繼代周期。2~4 d 內(nèi)的細(xì)胞分裂最快,可以以此階段的細(xì)胞來開展各項研究。

    細(xì)胞壁的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)因品種不同而不同,所以不同外植體的最佳酶液組合和濃度也不同。張寧等[26]研究表明如果酶液濃度過高,會導(dǎo)致原生質(zhì)體中毒和破裂;反之,如果濃度過低,會導(dǎo)致原生質(zhì)體成團(tuán)。杜小云等[27]用1%纖維素酶+0.5%離析酶+0.01%半纖維素酶組合,得到草莓懸浮系原生質(zhì)體;本文懸浮細(xì)胞酶液組合為1%纖維素酶+0.5%離析酶。

    經(jīng)懸浮培養(yǎng)后的愈傷組織增殖快,活力強是良好的遺傳轉(zhuǎn)化的受體,但受品種、染液濃度和時間的影響,愈傷組織轉(zhuǎn)化率較低。李亞梅等[28]表明在浸染液濃度OD600為0.6~0.8 和浸染時間30 min 時,酸棗愈傷組織轉(zhuǎn)化效率超過20%。本文中,以O(shè)D600為0.5,浸染時間15 min 為最好,浸染30 min 的愈傷組織會在后期培養(yǎng)過程中被菌吞沒,造成褐化死亡。

    4 結(jié)論

    本研究以無菌的新梨7 號花藥為外植體誘導(dǎo)愈傷組織,將其接種到1/2 MS+1.0 mg· L-1 2,4-D+0.4 mg·L-1 NAA+30 g ·L-1蔗糖+7 g ·L-1瓊脂的固體培養(yǎng)基上即可誘導(dǎo)出愈傷組織。將得到的疏松愈傷組織接種到MS+1.5 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+30 g ·L- 1 蔗糖的液體培養(yǎng)基中,在(26±1)℃,200 r ·min-1的黑暗條件下懸浮振蕩培養(yǎng),每隔7 d 繼代1 次,新舊培養(yǎng)基比例2∶1,經(jīng)30 d 后獲得了良好的懸浮細(xì)胞系,懸浮液的顏色澄清透明,分散性及均一性好,生長分裂速度快,活細(xì)胞率可達(dá)81.98%,近圓細(xì)胞率達(dá)83.66%;用懸浮細(xì)胞系提取的原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)3.67×106個·mL-1,活力可達(dá)92.00%,愈傷組織轉(zhuǎn)化率達(dá)20.00%。本研究結(jié)果為建立一套穩(wěn)定優(yōu)良的梨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系提供了理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

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