冬棗黑斑病的光學(xué)特性檢測(cè)方法建立

江夢(mèng)薇，蘭維杰，屠 康，彭 菁，白冰瑤，張 麗,3，宋麗軍,3, ，潘磊慶,4,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島 066600；4.三亞南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究院，海南三亞 572024）

冬棗（Ziziphus jujubaMill. cv. Dongzao）作為品質(zhì)最好的鮮食棗品種之一，不僅皮薄肉厚、口感脆甜，風(fēng)味獨(dú)特，同時(shí)還因含有人體所需的多種氨基酸、維生素、微量元素以及其他生物活性物質(zhì)而深受喜愛(ài)[1]。然而冬棗果實(shí)在采后易受到病原菌的侵染而引起腐爛，造成品質(zhì)下降、商業(yè)損失嚴(yán)重等問(wèn)題。由鏈格孢菌引起的冬棗黑斑病是冬棗果實(shí)最主要的采后病害之一[2]。受到鏈格孢菌侵染后，果實(shí)表面形成黑褐色病斑，同時(shí)果實(shí)內(nèi)部品質(zhì)也易腐爛，容易導(dǎo)致傳染性病害。因此對(duì)冬棗黑斑病的識(shí)別與檢測(cè)至關(guān)重要。

為滿(mǎn)足無(wú)損、快速的檢測(cè)需求，基于光譜技術(shù)檢測(cè)果實(shí)病害已取得一定進(jìn)展。Pham 等[3]建立基于高光譜成像技術(shù)的冬棗缺陷識(shí)別方法，識(shí)別準(zhǔn)確率可達(dá)96.3%以上；Pan 等[4]通過(guò)高光譜成像中光譜信息對(duì)香梨黑斑病進(jìn)行監(jiān)測(cè)與識(shí)別，對(duì)不同病害天數(shù)的香梨果實(shí)的判別正確率可達(dá)97.50%。光譜技術(shù)可以獲取光與果實(shí)組織產(chǎn)生交互過(guò)程的光譜信息，但由于果實(shí)組織具有復(fù)雜的化學(xué)和結(jié)構(gòu)組成，導(dǎo)致光在果實(shí)組織中的傳輸過(guò)程比較復(fù)雜[5]，因此，上述光譜技術(shù)不足以探明病害過(guò)程中光在果實(shí)組織中的傳輸規(guī)律。

組織的光學(xué)特性參數(shù)可以用于表征光在組織中的傳輸規(guī)律，反映果實(shí)組織中化學(xué)及結(jié)構(gòu)的變化[6-7]，其中吸收系數(shù)（μa）和約化散射系數(shù)（μs'）常被用于定量表征組織光學(xué)吸收和散射的特性。Sun 等[8]發(fā)現(xiàn)桃果實(shí)病害過(guò)程中的光學(xué)特性參數(shù)與內(nèi)部品質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)高度相關(guān)。Wang 等[9]發(fā)現(xiàn)在可見(jiàn)波段（550～750 nm）范圍內(nèi)病害洋蔥的吸收系數(shù)高于健康樣本。此外，吸收系數(shù)也被證明對(duì)梨褐心病的檢測(cè)至關(guān)重要[10]。上述研究均表明在病害過(guò)程中，果實(shí)組織存在一定的光學(xué)響應(yīng)且利用光學(xué)信號(hào)進(jìn)行病害檢測(cè)具有一定可行性，然而對(duì)于冬棗黑斑病過(guò)程中光學(xué)特性變化卻鮮有報(bào)道。與此同時(shí)，特征波段的篩選有助于剔除冗余及具有共線(xiàn)性的光學(xué)信號(hào)，進(jìn)而提高檢測(cè)的精度和穩(wěn)定性。

因此，本研究選取陜西大荔冬棗為研究對(duì)象，探究冬棗果實(shí)發(fā)生黑斑病過(guò)程中理化指標(biāo)的變化，同時(shí)采用單積分球技術(shù)結(jié)合反向倍加算法（IAD）探究冬棗果實(shí)發(fā)生黑斑病過(guò)程中短-中波近紅外波段（900～1650 nm）光學(xué)特性的變化。最后，通過(guò)與品質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究挑選病害檢測(cè)的特征波段，建立基于近紅外光譜的冬棗果實(shí)不同病害程度的判別模型以驗(yàn)證特征波段的有效性，以期為冬棗黑斑病的檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大荔冬棗 產(chǎn)地為陜西大荔，采摘次日購(gòu)于南京眾彩物流有限公司。選擇白熟期（果面無(wú)紅色），大小均勻，表面無(wú)機(jī)械傷及病蟲(chóng)害的果實(shí)。其中用于內(nèi)部品質(zhì)以及光學(xué)特性研究的樣本采摘時(shí)間為2021年10 月21 日，用于近紅外光譜采集的樣本采摘時(shí)間為2022 年8 月6 日；鏈格孢菌（Alternaria alternata） 購(gòu)自廣東省微生物研究所，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，在4 ℃條件下保藏；馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 上海盛思生化科技有限公司；次氯酸鈉（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純） 廣東光華科技股份有限公司。

CTHI-250B 型恒溫恒濕箱 施都凱設(shè)備公司；CR-10 便攜式色差計(jì) 日本美能達(dá)公司；PAL-1 手持式糖度儀、Easy ACID F5 型酸度計(jì) 日本愛(ài)拓公司；UV1800 紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；積分球系統(tǒng)：ASBN-W100-L 鹵素?zé)?上海復(fù)享光學(xué)股份有限公司；F240SMA-B 準(zhǔn)直鏡 美國(guó)Thorlabs 公司；SW2520 光譜儀 上海五鈴光電科技公司；4PGPS-033-SL 積分球 美國(guó)Labsphere 公司；NIR2500近紅外光譜儀、Y型傳輸光纖、校正白板 上海復(fù)享光學(xué)股份有限公司；鹵素光源 臺(tái)灣超微光學(xué)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備及試驗(yàn)樣本的處理 將保藏的鏈格孢菌接種至PDA 培養(yǎng)基，28 ℃、90% RH 條件下活化7 d，相同條件下進(jìn)行二次活化。將少量無(wú)菌水倒入活化好的帶菌PDA 平板，用無(wú)菌玻璃棒刮下鏈格孢菌孢子后，再用4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾以去除菌絲，制成鏈格孢菌孢子懸液。最后在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板將懸液中的孢子濃度調(diào)整至1×105個(gè)/mL。

挑選成熟度一致、大小均勻、果面無(wú)病害缺陷的冬棗樣本。用2 %（v/v）次氯酸鈉溶液浸泡2 min 后用無(wú)菌水沖洗后自然風(fēng)干備用。將冬棗樣本均分為3 組，即健康組、無(wú)菌水對(duì)照組和病害組，每組各挑選約2 kg 冬棗樣品備用。病害組和無(wú)菌水對(duì)照組果實(shí)均在赤道部位用無(wú)菌注射器針頭制造一個(gè)直徑和深度均為2 mm 的傷口，病害組果實(shí)在傷口處接種5 μL上述孢子懸液，以模擬鏈格孢菌的侵染；無(wú)菌水對(duì)照組果實(shí)在傷口處接種5 μL 無(wú)菌水，用于排除接種過(guò)程中機(jī)械損傷對(duì)果實(shí)造成的影響；健康組樣本不做任何處理，用于排除貯藏過(guò)程對(duì)果實(shí)的影響。制備好的樣品被置于恒溫恒濕箱（20 ℃，90% RH）貯藏5 d，在貯藏0、1、2、3、4、5 d 分別對(duì)不同處理組樣品進(jìn)行光學(xué)特性以及理化指標(biāo)的測(cè)定。為減少個(gè)體差異，每次取樣選取病害程度相似的果實(shí)。對(duì)于用于近紅外光譜采集的樣品，處理方法、貯藏條件以及取樣時(shí)間同上。

1.2.2 理化指標(biāo)的檢測(cè) 在貯藏過(guò)程中，用電子天平測(cè)量各組冬棗樣本的重量；用十字交叉法[11]測(cè)量病害組冬棗果實(shí)病斑區(qū)域的直徑并計(jì)算面積；采用美能達(dá)CR-100 型色差計(jì)對(duì)冬棗果實(shí)接種部位亮度（L*）、紅色度（a*）和黃色度（b*）進(jìn)行測(cè)定；可溶性固形物含量（Soluble solid content，SSC）用PAL-1 手持式糖度儀進(jìn)行測(cè)定，將接種部位附近的果肉擠汁進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果用百分比（%）表示；可滴定酸含量（Titratable acid，TA）用PAL-Easy ACID F5 型酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[12]，將接種部位附近的果肉擠汁進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果用百分比（%）表示。果皮葉綠素含量參考Sun等[13]的方法，結(jié)果以每克冬棗果皮中含葉綠素的毫克數(shù)表示。

1.2.3 光學(xué)特性檢測(cè) 光學(xué)特性的檢測(cè)采用的是實(shí)驗(yàn)室自主搭建的單積分球檢測(cè)系統(tǒng)（圖1a），主要由光源、準(zhǔn)直鏡、光譜儀、積分球、樣品架、滑臺(tái)控制器、滑臺(tái)以及計(jì)算機(jī)構(gòu)成。系統(tǒng)可以通過(guò)滑臺(tái)調(diào)整樣品架與積分球的相對(duì)位置來(lái)實(shí)現(xiàn)透射模式和反射模式的轉(zhuǎn)換。系統(tǒng)在使用前已進(jìn)行了精度驗(yàn)證[14]。

圖1 積分球檢測(cè)系統(tǒng)（a）和近紅外光譜檢測(cè)系統(tǒng)（b）示意圖Fig.1 Schematic of integrating sphere detection system (a) and the near-infrared spectroscopy detection system (b)

本研究選取赤道部位總厚度為3 mm 的外層果實(shí)（包括果皮及果肉）（圖1a）。每個(gè)樣品切片用2 片厚度為1 mm 的石英玻璃片夾好后放置在積分球系統(tǒng)的樣品架上，分別在透射和反射模式下獲取冬棗樣品的透射光譜和反射光譜，通過(guò)公式（1）和（2）分別計(jì)算反射率和透射率。最后利用IAD 算法求解μa和μs′。每個(gè)冬棗果實(shí)的光學(xué)特性參數(shù)為與接種傷口相切的周?chē)膫€(gè)測(cè)定位點(diǎn)（圖1a）光學(xué)特性參數(shù)的平均值。健康組（無(wú)傷口）在赤道部位對(duì)應(yīng)位置進(jìn)行檢測(cè)。各處理組在每個(gè)取樣時(shí)間測(cè)定5 個(gè)樣本并取平均值。

式中：R 代表冬棗樣品的反射率；Rs、Rd、Rr分別代表樣品、暗背景和白背景的反射光強(qiáng)；Rw=0.98為白板反射率；T 代表冬棗樣品的透射率；Ts、Td、Tr分別為樣品、暗背景和白背景光強(qiáng)。

1.2.4 近紅外光譜檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室自主搭建的點(diǎn)光源近紅外光譜檢測(cè)系統(tǒng)主要由光源、光譜儀、Y 型光纖以及計(jì)算機(jī)組成（圖1b）。通過(guò)檢測(cè)探頭對(duì)冬棗果實(shí)接種部位附近位點(diǎn)（與積分球檢測(cè)位點(diǎn)相同）進(jìn)行光譜采集，計(jì)算平均值作為單個(gè)樣本的近紅外光譜。每個(gè)取樣點(diǎn)隨機(jī)選取40 個(gè)冬棗樣本進(jìn)行光譜采集，共采集240 個(gè)不同病害程度的冬棗樣本的光譜信息。按照約7:3 的比例劃分建模集（174 個(gè)樣本）與預(yù)測(cè)集（66 個(gè)樣本）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Pearson 線(xiàn)性相關(guān)性分析在IBM SPSS Statistics 20.0 軟件中進(jìn)行，繪圖在OriginPro2022b 軟件中進(jìn)行。近紅外光譜的預(yù)處理、特征波長(zhǎng)的篩選以及判別模型的建立在Matlab R2016a 軟件中進(jìn)行。為消除噪聲、基線(xiàn)漂移、背景等冗余信息來(lái)提高光譜信息的有效性和模型檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，在用于模型的建立之前在本研究采用自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化（Autoscale）方法對(duì)光譜信息進(jìn)行預(yù)處理。模型效果用判別正確率表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬棗品質(zhì)變化

2.1.1 病斑面積以及果皮色差的變化 如圖2 所示，貯藏0～1 d 病害組的冬棗樣本接種部位附近還未發(fā)生明顯變化（圖2a），這是由于病原菌在此期間仍處于潛伏狀態(tài)[15]，然而隨著病害程度的加深，接種部位逐漸形成黑褐色的病斑，在貯藏2～3 d 病斑面積開(kāi)始有顯著變化（P＜0.05）（圖2b），且病斑面積隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，在貯藏4～5 d 接種部位可以看到明顯的菌絲，證明已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重病害。而健康組與無(wú)菌水對(duì)照組均未發(fā)生病害。三個(gè)處理組果皮色澤的變化如表1 所示。由表可見(jiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)三個(gè)處理組的L*值均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中病害組的下降幅度最大。病害組的冬棗果皮L*值在貯藏3 d 開(kāi)始顯著（P＜0.05）低于兩個(gè)未感染的處理組，在貯藏5 d 降至57.64。研究表明，L*值越大則說(shuō)明果實(shí)表面的顏色與新鮮的自然色越相近[16]，L*值的下降也證實(shí)了果實(shí)新鮮度的不斷下降。三個(gè)處理組的a*值則呈現(xiàn)不斷上升的變化趨勢(shì)，健康組和無(wú)菌水對(duì)照組的a*值分別從-3.6 和-3.4 升至-0.5 和-0.2，病害組的a*值從-3.3 升至5.3，在貯藏3 d 開(kāi)始呈現(xiàn)正值并且顯著（P＜0.05）高于兩個(gè)對(duì)照組，這與上述觀察一致，即從3 d 開(kāi)始接種位置處已出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黑褐色病斑。然而對(duì)于b*值，隨著果實(shí)病害的發(fā)生未發(fā)現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。

表1 20 ℃貯藏期間冬棗樣品顏色變化Table 1 Changes in skin color of winter jujubes during the storage at 20 ℃

圖2 20 ℃貯藏期間冬棗形態(tài)變化（a）及病害組冬棗果實(shí)病斑面積變化（b）Fig.2 Changes in morphological of winter jujubes (a) and the sizes of the infected area of inoculated samples (b)during the storage at 20 ℃

2.1.2 失重率、SSC、TA 及葉綠素含量的變化 水分、糖、酸是冬棗果實(shí)的主要營(yíng)養(yǎng)成分，在病害發(fā)生的過(guò)程中，病害果實(shí)的失重率上升明顯，且在接種后3 d 開(kāi)始顯著（P＜0.05）高于兩個(gè)未感染病原菌的處理組（圖3a），原因在于冬棗果實(shí)受病原菌的侵染后呼吸作用增強(qiáng)，果實(shí)中的水分消耗增大造成了失重率的顯著上升。冬棗果實(shí)的SSC 在接種病原菌后4 d 顯著（P＜0.05）下降（圖3b），這表明在嚴(yán)重病害的情況下果實(shí)內(nèi)部糖類(lèi)物質(zhì)的生成途徑受阻且快速分解[17]。TA 含量在冬棗果實(shí)發(fā)生病害的過(guò)程中呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，這不同于健康組以及無(wú)菌水對(duì)照組整體下降的變化趨勢(shì)（圖3c），其原因可能在于：果實(shí)內(nèi)部的酸類(lèi)物質(zhì)在病害的初期隨著果實(shí)的成熟衰老，其含量緩慢減少，病害發(fā)生后，果實(shí)內(nèi)部代謝途徑受阻，果實(shí)內(nèi)部的酸類(lèi)物質(zhì)難以轉(zhuǎn)化成糖類(lèi)以及其他物質(zhì)而積累，造成了TA 的異常上升，這與病害桃果實(shí)中TA 含量的變化相似[13]。冬棗果實(shí)受到病原菌的侵染后果皮葉綠素含量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)（圖3d），尤其是從接種后3 d 起葉綠素含量較健康組和無(wú)菌水對(duì)照組顯著（P＜0.05） 減少，這是由于真菌侵染破壞了細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致葉綠素含量快速下降，于此同時(shí)病害部位開(kāi)始失綠并發(fā)生褐變[18-19]。未感染病原菌的冬棗果皮中的葉綠素含量則逐步小幅減少，這表明冬棗在正常的成熟衰老過(guò)程中葉綠素也會(huì)逐漸分解。

圖3 20 ℃貯藏期間三個(gè)處理組冬棗失重率（a）、SSC（b）、TA（c）和葉綠素含量（d）變化Fig.3 Changes in water loss rate (a), SSC (b), TA (c) and chlorophyll content (d) of winter jujubes in three treatment groups during the storage at 20 ℃

2.1.3 病害冬棗理化指標(biāo)的相關(guān)性分析 根據(jù)理化指標(biāo)的變化情況可以看出，感染鏈格孢菌的冬棗果實(shí)的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)比未感染的樣本有顯著差異且存在更大范圍的波動(dòng)，這說(shuō)明病原菌侵染會(huì)顯著影響果實(shí)的物理特性及化學(xué)組成。為研究病害發(fā)生過(guò)程中各理化指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)病害冬棗果實(shí)病斑面積以及其他品質(zhì)指標(biāo)的變化進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。由表2 可知，病害過(guò)程中水分的損失（失重率）與果皮顏色（L*、a*）（r=-0.974，P＜0.01）以及葉綠素含量（r=-0.981，P＜0.01）的變化密切相關(guān)，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的研究結(jié)果相一致[20]。于此同時(shí)，病斑面積作為病害程度的直觀表征之一，與葉綠素含量的相關(guān)性最高（r=-0.956，P＜0.01），這說(shuō)明葉綠素是與病害最相關(guān)的指標(biāo)，這與桃果實(shí)的研究結(jié)果相一致[13]。此外病斑面積與果皮色澤（L*、a*）、失重率和SSC 均呈現(xiàn)顯著（P＜0.05）的線(xiàn)性相關(guān)，說(shuō)明這些指標(biāo)在病害發(fā)展過(guò)程中變化顯著，可在一定程度上反映病害程度。

表2 黑斑病冬棗樣品各指標(biāo)間相關(guān)性分析結(jié)果Table 2 Correlation analysis on physical and chemical indicators of winter jujubes with black spot disease

2.2 光學(xué)特性的變化及其與理化指標(biāo)間的相關(guān)性研究

2.2.1 光學(xué)吸收及散射特性的變化 如圖4a～圖4c所示，三個(gè)處理組在不同貯藏時(shí)間的μa平均光譜曲線(xiàn)形狀相似。在1480 nm 附近呈現(xiàn)明顯的水的吸收峰，與蘋(píng)果[21]、梨[22]等水果的吸收系數(shù)類(lèi)似。病害組冬棗果實(shí)的μa曲線(xiàn)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，1480 nm 處降幅最大，從貯藏初期的0.2708 下降到貯藏5 d 的0.1411 mm-1，在貯藏5 d顯著（P＜0.05） 低于健康組（μa=0.2033 mm-1）和無(wú)菌水對(duì)照組（μa=0.2051 mm-1）。這是由于病原菌的侵染導(dǎo)致水分的流失，與2.1.2 中得到的結(jié)論相一致。而健康組和無(wú)菌水對(duì)照組的冬棗果實(shí)的μa僅出現(xiàn)了略微下降且不同貯藏時(shí)間下存在重疊。由圖4d～圖4f 可知冬棗果實(shí)的μs'遠(yuǎn)高于μa，范圍在0.2～0.8 mm-1之間，這是由于水果組織屬于渾濁介質(zhì)，其散射特性遠(yuǎn)大于吸收特性。μs'曲線(xiàn)沒(méi)有明顯的特征峰，且符合米氏散射定律，即μs'隨波長(zhǎng)的增加而減小[23]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，病害組的冬棗果實(shí)的μs'呈現(xiàn)大幅減小的變化趨勢(shì)，這是由于細(xì)胞壁是引起光散射的重要因素，然而在病原菌侵染的過(guò)程中細(xì)胞受到損傷的同時(shí)原本致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致了散射作用的降低[8]。結(jié)合兩種光學(xué)特性參數(shù)的曲線(xiàn)圖可以看出在900～1650 nm 的波段范圍內(nèi)，隨著波長(zhǎng)的增加，冬棗果實(shí)的散射特性逐漸減弱，而吸收系數(shù)逐漸升高，最終占據(jù)主導(dǎo)地位。此外，健康組和無(wú)菌水對(duì)照組的吸收系數(shù)和約化散射系數(shù)的光譜曲線(xiàn)相似且隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)變化幅度均較小，證明本研究中接種造成機(jī)械傷口產(chǎn)生的影響可以忽略。

圖4 各組冬棗果實(shí)吸收系數(shù)μa 和約化散射系數(shù)μs'在貯藏期間的變化Fig.4 Changes in absorption coefficient (μa) and reduced scattering coefficient (μs') of winter jujubes during storage

2.2.2 光學(xué)特性與理化指標(biāo)的相關(guān)性研究及特征波長(zhǎng)篩選 考慮到健康組和無(wú)菌水對(duì)照組的光學(xué)特性參數(shù)變化幅度不大，且本文重點(diǎn)在于探究病害期間的光學(xué)特性變化，因此僅對(duì)病害組的冬棗樣品的光學(xué)特性與病斑面積以及理化指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。全波長(zhǎng)范圍內(nèi)（900～1650 nm）病害組的冬棗樣品各理化指標(biāo)與光學(xué)特性參數(shù)的相關(guān)性曲線(xiàn)如圖5 所示。吸收和散射兩種光學(xué)特性參數(shù)與L*、SSC 和葉綠素含量呈正相關(guān)，與病斑面積、a*、失重率和TA 呈負(fù)相關(guān)。

圖5 黑斑病冬棗果實(shí)理化指標(biāo)與光學(xué)吸收系數(shù)（a）和約化散射系數(shù)（b）的相關(guān)性Fig.5 Correlations of physicochemical indicators and optical absorption coefficient (a) and reduced scattering coefficient (b)of winter jujubes with black spot disease

由圖5a 可知，所有品質(zhì)指標(biāo)在1400 nm 附近與μa的相關(guān)系數(shù)（r）達(dá)到最大值并在1400～1650 nm波段范圍內(nèi)保持在穩(wěn)定水平。在此波段內(nèi)，除TA 外其他指標(biāo)均與μa高度相關(guān)，這表明在這一波段下光學(xué)吸收特性可以反映冬棗果實(shí)這些理化特性的變化，與2.1.3 中提到的病斑面積、L*、a*、失重率、SSC 以及葉綠素含量間的相關(guān)性結(jié)果相一致。在上述波段范圍內(nèi)，μa與葉綠素含量、L*、失重率以及a*的相關(guān)性最高，與Sun 等[13]的研究結(jié)果一致。相關(guān)系數(shù)平均值分別為0.9831、0.9770、-0.9751 以及-0.9717。前文的分析中得出葉綠素、L*、失重率以及a*之間存在極顯著（P＜0.01）的相關(guān)性能很好得解釋這一現(xiàn)象，這些指標(biāo)與μa的相關(guān)性系數(shù)的絕對(duì)值在1453、1498、1511 和1557 nm 處達(dá)到最大值，證明在這些波段下光學(xué)特性與品質(zhì)變化的相關(guān)性最強(qiáng)。其中，a*和失重率在1453 nm 處的相關(guān)系數(shù)達(dá)到最大值，分別是-0.9756 和-0.9786；病斑面積（r=-0.9318）和SSC（r=0.9544）在1511 nm 處的相關(guān)性最強(qiáng)；L*和葉綠素含量分別在1498 和1556 nm 處與μa的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9734 和0.9878。在900～1360 nm波段范圍內(nèi)，μs'與除TA 外的各指標(biāo)高度相關(guān)（圖5b），其與病斑面積的相關(guān)性最高，其次是葉綠素含量（平均相關(guān)系數(shù)分別為0.9700 和0.9664），與失重率、L*、a*、SSC 之間的平均相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值均在0.9088 以上，一定程度上說(shuō)明在這些波長(zhǎng)下μs'能夠較好地反映病害的發(fā)展。μs'與各品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)的絕對(duì)值最大值分別出現(xiàn)在933、1020、1034、1047、1162 和1360 nm 處，對(duì)應(yīng)的品質(zhì)指標(biāo)為失重率（r=-0.9451）、L*（r=0.9259）、a*（r=-0.9649）、葉綠素（r=0.9800）、病斑面積（r=-0.9901）和SSC（r=0.9581）。

光學(xué)特性與理化指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果印證了2.2.1 中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即散射在900～1360 nm 占主導(dǎo)地位，然而隨著波長(zhǎng)的增大果實(shí)組織對(duì)于光的吸收作用逐漸增強(qiáng)，1400～1650 nm 波段的吸收系數(shù)包含更多反映果實(shí)組織的物理化學(xué)性質(zhì)變化的信息，這證明了在短-中波近紅外波段范圍內(nèi)光學(xué)技術(shù)在冬棗病害檢測(cè)中的可行性。與此同時(shí)，由全波段的相關(guān)性分析可知，光學(xué)特性參數(shù)與病害發(fā)展過(guò)程中各品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)在933、1020、1034、1047、1162、1360、1453、1498、1511 和1557 nm 波長(zhǎng)處有最大值，證明這些波段下的光學(xué)信息與病害發(fā)展過(guò)程高度相關(guān)，優(yōu)選為基于光學(xué)技術(shù)檢測(cè)冬棗黑斑病的特征波長(zhǎng)，在后續(xù)的研究中將通過(guò)近紅外光譜技術(shù)對(duì)基于光學(xué)特性篩選到的特征波長(zhǎng)的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 基于近紅外光譜的特征波長(zhǎng)驗(yàn)證及病害冬棗的判別

在實(shí)際檢測(cè)中全波長(zhǎng)光譜通常存在易引入噪聲、含有冗余信息、計(jì)算量大等缺點(diǎn)，造成檢測(cè)效率以及準(zhǔn)確率的降低[24]，特征波長(zhǎng)的篩選有利于有效信息的提取，同時(shí)簡(jiǎn)化模型、減少計(jì)算量，這說(shuō)明特征波長(zhǎng)的科學(xué)性和有效性至關(guān)重要。在2.2.2 部分的相關(guān)性分析中篩選獲得了10 個(gè)特征波長(zhǎng)，本節(jié)將采用無(wú)損的近紅外光譜技術(shù)對(duì)光學(xué)特性?xún)?yōu)選波長(zhǎng)的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)采用算法進(jìn)行特征波長(zhǎng)的篩選，將基于光學(xué)特性得到的特征波長(zhǎng)建立的判別模型結(jié)果與全波長(zhǎng)和基于算法得到的特征波長(zhǎng)得到的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比總結(jié)，以期為光學(xué)技術(shù)檢測(cè)冬棗黑斑病提供信息指導(dǎo)。

2.3.1 光譜分析 接種后不同貯藏天數(shù)的冬棗樣品的近紅外光譜曲線(xiàn)如圖6 所示。冬棗樣品的光譜在900～1650 nm 區(qū)域內(nèi)主要呈現(xiàn)3 個(gè)水的吸收峰，分別位于980 nm（O-H 二級(jí)倍頻）、1190 nm（O-H 鍵的合頻吸收峰）以及1440 nm（O-H 鍵伸縮振動(dòng)一級(jí)倍頻）[25-26]。上述這些波長(zhǎng)在水果果實(shí)內(nèi)部品質(zhì)及病害檢測(cè)中常被認(rèn)為是近紅外區(qū)域的關(guān)鍵波段，如在蘋(píng)果[27]、梨[28]等的果實(shí)檢測(cè)中起到了重要作用。隨著病害的發(fā)展，冬棗果實(shí)的相對(duì)反射率呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)，尤其是在接種病原菌后貯藏4 d 起呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。這主要是由于隨著果實(shí)組織結(jié)構(gòu)的逐漸受損，光將被更多地吸收和散射，造成了反射光的減少[29]。在西紅柿的相關(guān)研究研究中也獲得了類(lèi)似的結(jié)果[30]。與此同時(shí)，表面亮度的降低也導(dǎo)致了反射光譜的下降，這也印證了2.1.1 部分果皮L*隨病害程度的加深不斷降低這一發(fā)現(xiàn)。為更好地對(duì)不同病害程度的果實(shí)進(jìn)行判別，同時(shí)結(jié)合病害發(fā)展規(guī)律（圖2），將貯藏0～1 d 的冬棗樣品定義為未發(fā)生病害的樣本，貯藏2～3 d 的樣本定義為輕微病害，貯藏4～5 d 的樣本定義為嚴(yán)重病害。

圖6 900～1650 nm 波段范圍內(nèi)病害組冬棗果實(shí)在貯藏期間的相對(duì)反射率Fig.6 Relative reflectance of diseased winter jujubes during the storage in the range of 900～1650 nm

2.3.2 特征波段的篩選 通過(guò)2.2.2 可知，病害期間光學(xué)特性參數(shù)與不同品質(zhì)指標(biāo)間在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)存在較高的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)的大小可以表征光學(xué)特性與品質(zhì)變化的關(guān)聯(lián)性，將光學(xué)特性與品質(zhì)指標(biāo)間的存在最強(qiáng)相關(guān)的波長(zhǎng)定義為特征波長(zhǎng)，在900～1650 nm 范圍優(yōu)選10 個(gè)特征波長(zhǎng)，分別是933、1020、1034、1047、1162、1360、1453、1498、1511 和1557 nm。

為更好得驗(yàn)證基于光學(xué)特性參數(shù)得到的特征波長(zhǎng)的有效性和可靠性，本研究還引入3 種特征波長(zhǎng)篩選算法，分別是連續(xù)投影算法（SPA）、競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)算法（CARS）和無(wú)信息變量消除法（UVE）對(duì)全波長(zhǎng)下的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征波長(zhǎng)的篩選。圖7展示了3 種算法篩選特征波長(zhǎng)的過(guò)程。

圖7 基于SPA（a）、CARS（b）和UVE（c）算法的特征波長(zhǎng)篩選流程Fig.7 Characteristic wavelengths selection process based on SPA (a), CARS (b) and UVE (c) algorithm

SPA 是一種前向的特征波段篩選算法，提取的特征波段共線(xiàn)性小、冗余度低[24]。均方根誤差的大小是SPA 算法挑選特征變量的依據(jù)，由圖7a 可見(jiàn)均方根誤差在特征變量數(shù)為9 時(shí)處在較低水平且隨變量數(shù)的增多均方根誤差趨于平穩(wěn)，因此SPA 算法在900～1650 nm 波段范圍內(nèi)共選取到11 個(gè)特征波長(zhǎng)，分別是907、913、920、933、966、985、1024、1186、1289、1379 和1411 nm。

CARS 算法的原理與達(dá)爾文的“適者生存”的原則相似[31]，多次重復(fù)篩選將不適應(yīng)模型的波長(zhǎng)刪除，最終得到最優(yōu)特征波長(zhǎng)組合，由圖7b 可見(jiàn)在采樣運(yùn)行次數(shù)為28 時(shí)，交叉驗(yàn)證均方根誤差最小說(shuō)明在后面的采樣中開(kāi)始剔除了關(guān)鍵信息[32]。CARS 算法在900～1650 nm 波段范圍內(nèi)共選取到9 個(gè)特征波長(zhǎng)，分別是907、926、966、979、1005、1011、1031、1102及1128 nm。

UVE 算法篩選特征波段的過(guò)程如圖7c 所示，豎線(xiàn)左右兩側(cè)分別為全光譜117 個(gè)波數(shù)及117 個(gè)隨機(jī)變量的穩(wěn)定性分布曲線(xiàn)，兩條水平虛線(xiàn)代表保留閾值的上下限，虛線(xiàn)內(nèi)的波長(zhǎng)作為冗余波長(zhǎng)變量被剔除[33]，僅保留在水平虛線(xiàn)外側(cè)的有效變量，UVE 算法共篩選了38 個(gè)特征波長(zhǎng)，分別是907、920、926、933、966、1005、1011、1030、1056、1063、1070、1076、1096、1102、1109、1115、1146、1135、1173、1180、1186、1193、1180、1186、1193、1199、1206、1264、1360、1418、1424、1475、1482、1488、1495、1501、1584、1590 nm。

2.3.3 基于全波長(zhǎng)及特征波長(zhǎng)的病害冬棗的判別模型的建立 由表3 可知，對(duì)于PLS-DA 模型，基于光學(xué)特性?xún)?yōu)選變量建立的判別模型具有與全波長(zhǎng)模型相當(dāng)?shù)呐袆e效果，建模集和預(yù)測(cè)集的正確率分別達(dá)到了91.95%和90.84%；對(duì)于SVM-DA 模型，基于光學(xué)特性?xún)?yōu)選變量模型具有最佳的判別正確率，建模集和預(yù)測(cè)集的正確率分別為92.53%和92.35%，較全波長(zhǎng)模型的判別效果更優(yōu)，這說(shuō)明光學(xué)特優(yōu)選變量剔除無(wú)關(guān)變量的同時(shí)獲得了較為全面有效的信息，證明了利用光學(xué)特性獲得的特征波長(zhǎng)的有效性。

表3 基于全波長(zhǎng)和特征波長(zhǎng)的冬棗病害判別的PLS-DA 及SVM-DA 模型結(jié)果Table 3 Discrimination accuracy of diseased winter jujubes at different levels based on PLS-DA and SVM-DA models using the spectral information at the full wavelengths and the characteristic wavelengths

基于光學(xué)特性?xún)?yōu)選變量建立的判別模型效果略?xún)?yōu)于基于3 種算法獲得的特征波長(zhǎng)的模型。對(duì)比利用光學(xué)特性和利用算法獲得的特征波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)光學(xué)特性?xún)?yōu)選波段基本跨越了全波段范圍（900～1650 nm），并多數(shù)分布在近紅外光譜曲線(xiàn)的3 個(gè)吸收谷（980、1190 和1450 nm）附近。然而利用SPA 算法和CARS算法得到的特征波長(zhǎng)全部分布在1400 nm 以前的波長(zhǎng)范圍，完全丟失了1400～1650 nm范圍內(nèi)的光譜信息，這可能是導(dǎo)致模型效果略差的原因[34]。UVE 算法獲得的特征波長(zhǎng)雖跨越了全波長(zhǎng)范圍，且在3 個(gè)吸收峰附近波長(zhǎng)處均篩選到了特征波長(zhǎng)，然而基于UVE 算法獲取的特征變量數(shù)（38）遠(yuǎn)大于其他方法獲得的特征波長(zhǎng)數(shù)，因此基于UVE 算法獲取的特征波長(zhǎng)可能帶入了冗余的信息，因此在兩個(gè)模型中都未獲得比光學(xué)特性?xún)?yōu)選變量模型更好的判別效果。由此可見(jiàn)，在光譜檢測(cè)中特征波長(zhǎng)的篩選是至關(guān)重要的。利用光學(xué)特性?xún)?yōu)選的10 個(gè)波長(zhǎng)（933、1020、1034、1047、1162、1360、1453、1498、1511、1557 nm）對(duì)應(yīng)的光譜信息能夠剔除無(wú)關(guān)變量并有效反映總體信息，可以實(shí)現(xiàn)冬棗黑斑病發(fā)病過(guò)程病害的識(shí)別和監(jiān)測(cè)，證明了利用光學(xué)特性篩選的特征波長(zhǎng)的科學(xué)性和有效性。

3 結(jié)論

本研究探究了冬棗黑斑病發(fā)生過(guò)程中果實(shí)理化指標(biāo)以及其在短-中波近紅外區(qū)域內(nèi)光學(xué)特性（吸收和散射）的變化規(guī)律，同時(shí)通過(guò)相關(guān)性分析篩選出特征波長(zhǎng)，并由此建立基于近紅外光譜信息的冬棗病害判別模型以驗(yàn)證特征波長(zhǎng)的有效性。結(jié)果表明，隨著病害加深，在900～1650 nm 波段范圍冬棗果實(shí)的μa和μs'均呈下降趨勢(shì)。μa和μs'分別在1400～1650 nm和900～1360 nm 波段范圍與病斑面積、失重率、L*、a*、SSC 以及葉綠素含量高度相關(guān)，證實(shí)了光學(xué)信號(hào)在冬棗病害檢測(cè)中的可行性，同時(shí)通過(guò)相關(guān)系數(shù)篩選得到10 個(gè)優(yōu)選波長(zhǎng)（933、1020、1034、1047、1162、1360、1453、1498、1511、1557 nm）。優(yōu)選波長(zhǎng)有效性的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，基于光學(xué)特性?xún)?yōu)選波段建立的模型在兩種模型（PLS-DA 和SVM-DA）中均表現(xiàn)出最佳的判別效果，建模集和預(yù)測(cè)集的正確率分別達(dá)到了92.53%和92.35%，這為特征波長(zhǎng)的有效性提供了有力證明，為基于光學(xué)的無(wú)損檢測(cè)方法識(shí)別冬棗病害奠定了理論基礎(chǔ)。