肌肉蛋白質降解對發(fā)酵肉制品品質影響的研究進展

鄭 云，鄭 爽，周天碩，鮑 偉，韓 齊,2, ，李艷青,2,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省中加合作食品研究發(fā)展中心，黑龍江大慶 163319）

發(fā)酵肉制品是指在自然或人工條件下利用微生物的發(fā)酵作用，生成具有特殊風味、色澤和質地且保存期較長的肉制品[1]。蛋白質降解是肉制品發(fā)酵成熟過程中主要的生化變化之一，與發(fā)酵肉制品特殊風味和獨特品質的形成均有顯著相關性。目前，國內外研究者已對肉制品發(fā)酵過程中蛋白質和脂類氧化對風味變化影響研究有很多，但肌肉蛋白質的降解對品質的影響方面仍然存在欠缺。發(fā)酵肉制品肌肉蛋白質降解的主要過程為：蛋白質先經初步水解生成多肽，再通過肽酶不完全水解生成小肽，最后由各類肽酶水解生成更多的小肽和游離氨基酸[2]。

肉制品發(fā)酵過程中蛋白質的降解主要是經微生物產生的蛋白酶和內源酶的作用，部分轉化為小分子物質，如氨基酸、酯、肽和揮發(fā)性物質，進而影響發(fā)酵肉制品的質地和風味。同時必需氨基酸含量的增加增強了產品的營養(yǎng)功能性[3-4]。發(fā)酵過程中，微生物群落是動態(tài)演變的，各個發(fā)酵階段的菌群結構對品質的貢獻也不同，部分微生物在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)的作用對發(fā)酵肉制品的質量和理化性質有一定的影響[5]。多數研究者認為發(fā)酵肉制品的蛋白質降解是由微生物和內源酶共同作用的結果，但兩者作用是否同時進行或分先后階段，有無其他因素的影響等相關研究還未見報道，作用機制也尚不明確。本文綜述了微生物對發(fā)酵肉制品品質的影響，包括從發(fā)酵肉中分離的微生物群落的種類，通過分析微生物作用，探討發(fā)酵肉制品理化性質、蛋白質結構的變化及蛋白質降解對產品品質造成的影響，以期為近年來微生物調控蛋白質降解對發(fā)酵肉制品品質的特性研究提供思路。

1 肌肉內源酶對蛋白質的降解作用

為了闡明肉制品發(fā)酵過程中蛋白質的降解機制，國內外學者使用不同的模型系統(tǒng)進行研究，如在發(fā)酵香腸中添加微生物抑制劑（抗生素）或肌肉蛋白酶抑制劑。肌肉蛋白酶抑制劑的加入比微生物抑制劑（如抗生素等）更能保護肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白T[6]。Verplaetse 等[7]的研究也證實了這一點，蛋白質的降解主要是通過內源蛋白酶來實現(xiàn)的，并且這類酶對西式發(fā)酵肉制品質構和風味的形成起重要作用。內源蛋白酶通過降解蛋白質和多肽從而釋放小肽和氨基酸等，其具體可分為內肽酶和外肽酶。如圖1a 所示，肉制品在發(fā)酵和成熟階段，肌肉內肽酶（組織蛋白酶B、D、L 和鈣蛋白酶）、外肽酶（氨基肽酶和羧肽酶）發(fā)生一系列生化反應，首先內肽酶將蛋白質分解生成多肽和許多低分子量化合物，然后生成的多肽被外肽酶進一步降解，最終釋放出大量氨基酸及各類小肽，直接參與發(fā)酵肉制品質地和風味的形成[8-10]。

肌肉中內源蛋白酶的種類繁多，肌肉內肽酶是肉制品發(fā)酵初期肌原纖維蛋白和肌漿蛋白降解的主要因素[11]，因此組織蛋白酶和鈣蛋白酶對發(fā)酵肉制品的特征風味和質地形成起主要作用。組織蛋白酶B、D、L 對肌肉蛋白質有著廣泛的降解，引起干發(fā)酵香腸第一次蛋白質降解的主要內肽酶是溶酶體組織蛋白酶B 和D。然而，蛋白酶H 的作用尚不明確，鈣蛋白酶對蛋白質降解的貢獻較小，一般只能在鮮肉或肉制品成熟前期檢測到，但它造成的損失會促進其他蛋白酶的降解[12]。具體見表1。

表1 發(fā)酵肉制品中肌肉內肽酶的類型和功能Table 1 Types and functions of intramuscular peptidase in fermented meat products

在肉制品發(fā)酵機制的研究中，多數集中于組織蛋白酶B 和D，根據內源性蛋白酶對肌肉蛋白質降解的作用位點進行分析（如圖1b 和圖1c 所示）：組織蛋白酶B 作用于肌動蛋白（actin）并產生大部分肽類，這些肽類是從蛋白質的N-端和C-端釋放出來的，且多數為水溶性肽，肌動蛋白是肌肉組織中含量最豐富的蛋白質之一，因此其降解對發(fā)酵肉制品質地和風味的形成具有重要意義。組織蛋白酶D 的活性受溫度影響較大，因此在適宜條件下組織蛋白酶D 能夠廣泛降解肌原纖維蛋白[8]。早期研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D 能夠快速降解肌聯(lián)蛋白（titin）、M 蛋白和C 蛋白，不能水解肌動蛋白[18]，但近期Hughes等[19]研究在適宜條件下組織蛋白酶D 可以從多位點對肌動蛋白進行降解。采用蛋白質組學方法對肌肉蛋白降解模式進行輔助分析，通過LC-MS 方法對發(fā)酵香腸模型中肌動蛋白降解產生的小肽進行鑒定，根據肌動蛋白序列和3D 結構顯示，所鑒定的肽段覆蓋了50%以上的肌動蛋白序列，并且4 個亞結構域的肽段都被得到鑒定，因此肌動蛋白發(fā)生了高度降解；并且還發(fā)現(xiàn)pH 較高時，發(fā)酵香腸中肌動蛋白降解率較低，可能是由于組織蛋白酶D 活性最適pH 較低[20]。Berardo 等[21]發(fā)現(xiàn)多肽的起點可以確定酶的切割位點，并且在干腌肉制品的加工過程中組織蛋白酶B 和D 可以保持活性較長時間，所以在發(fā)酵肉制品成熟后期多肽的數量仍然增加，同時產生游離氨基酸，一些游離氨基酸通過Strecker 降解產生揮發(fā)性物質。因此內源酶的活性與小肽的生成數量及發(fā)酵肉制品的感官特征高度相關，表明內源酶在發(fā)酵肉制品的特征風味形成過程中起著重要作用。

2 微生物蛋白酶對蛋白質的降解作用

發(fā)酵肉制品成熟期間，蛋白質經降解生成多肽、游離氨基酸等，一部分氨基酸隨后脫羧、脫氨，進一步代謝成其他小分子化合物。現(xiàn)有研究普遍認為內源酶中組織蛋白酶對促進蛋白質降解發(fā)揮的作用更大[6-7]，但也有研究認為發(fā)酵肉制品中蛋白質的降解程度主要取決于肉質中的微生物菌群的種類和肉產品加工時的外部條件[22]。發(fā)酵過程的干燥脫水及鹽的作用使產品水分活度降低，同時微生物通過消耗肌肉中的碳水化合物產酸，環(huán)境pH 降低，生成的酸性物質會促使鹽溶性蛋白質變性形成凝膠結構，從而賦予發(fā)酵肉制品獨特的口感。發(fā)酵菌株產生的蛋白酶同時加快了肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的降解，從而引起蛋白質結構改變，蛋白質結構一旦改變，蛋白質功能性質也發(fā)生變化，如疏水性基團、巰基暴露于分子表面，二級、三級結構發(fā)生改變，蛋白發(fā)生絮集，形成不可逆凝膠等；而降解產生的多肽、氨基酸、醛等化合物則參與了質地、風味的發(fā)展[23-24]。因此在發(fā)酵肉制品中研究微生物發(fā)酵劑對肌肉蛋白質的降解作用更具有實踐意義，在發(fā)酵劑的篩選以及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面具有指導作用。

目前，蛋白質組學技術在發(fā)酵肉制品的研究機制中也得到了廣泛的應用，因此可通過蛋白質組學來研究微生物菌株對肌肉蛋白質的降解作用，從分子水平上探索優(yōu)勢菌株的作用機制。Luccia 等[25]將蛋白質組學技術應用于火腿發(fā)酵過程中所發(fā)生的蛋白質降解，研究了肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的降解情況，結果表明雙向凝膠電泳圖譜（2-DGE）比十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（SDS-PAGE）更能夠詳細的闡述蛋白質的變化。

2.1 乳酸菌

乳酸菌是一類革蘭氏陽性細菌，主要包括乳球菌、乳桿菌、片球菌與鏈球菌等18 個菌屬，在自然界中分布廣泛，多數乳酸菌是公認的一般安全菌，可作為發(fā)酵劑和生物防腐劑使用，對食品的風味、質構和感官品質具有非常重要的作用，且由于具有很好的益生功能性，也是益生菌制劑較為常用的菌種之一[26-27]。通過比較各地發(fā)酵肉制品中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)應用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌屬主要是乳酸乳桿菌和乳酸片球菌，這兩類大量存在肉產品中，并且具有絕對優(yōu)勢[28]。

多數研究表明乳酸菌具有完善的蛋白質降解系統(tǒng)，發(fā)酵過程中乳酸菌可以產生各類肽酶降解蛋白質生成游離氨基酸；同時乳酸菌也可以通過代謝碳水化合物產生乳酸、乙酸、二乙酰等物質，降低發(fā)酵環(huán)境pH 提高蛋白酶的活性，從而直接或間接參與蛋白質降解，促進色澤風味的形成，抑制腐敗菌和亞硝胺的生成[29]。孫雷等[30]分析了植物乳桿菌的全細胞懸浮液、細胞提取液及兩者等比例混合物對肌肉蛋白質的降解情況，三種體系均引發(fā)了肌肉蛋白質的降解，其中兩種酶原混合物所帶來的積累效應增加了游離氨基酸的含量，同時乳酸菌蛋白酶滲入到肉制品中還增強了產酸率，說明乳酸菌的生長代謝也有助于肌肉蛋白質的降解。奇美等[31]選擇了阿拉善高原具有很高經濟價值的阿拉善雙峰駝，通過SDS-PAGE 來評價乳酸菌對肌肉蛋白質的降解作用，駝肉經植物乳桿菌和戊糖片球菌發(fā)酵后，肌原纖維蛋白重鏈條帶明顯變淺，低分子質量條帶加深，說明大分子蛋白進一步降解后部分小分子蛋白重新聚合或蛋白質變性聚集而成新的分子蛋白，賦予了發(fā)酵駝肉口感質地好、儲存期間品質穩(wěn)定等特性。

2.2 葡萄球菌

葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，在發(fā)酵過程中具有較強的脂肪分解能力，能生成蛋白酶將蛋白質分解為多肽和氨基酸，從而有利于人體吸收，進一步提高食品的營養(yǎng)價值。乳酸菌生成的蛋白酶大量消耗時，葡萄球菌對于保證產品的品質和風味是必不可少的。在發(fā)酵肉制品中葡萄球菌的多樣性更加豐富，如木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌等，葡萄球菌在肉制品發(fā)酵過程中的動態(tài)變化也逐漸受到重視[32]。

葡萄球菌屬在肉制品發(fā)酵過程中作為優(yōu)勢菌發(fā)揮重要作用，多數研究表明葡萄球菌對肌肉蛋白質有一定的降解作用，在各發(fā)酵時期對蛋白質的降解程度也不同。肌肉蛋白質經葡萄球菌降解后，呈味氨基酸在顯著升高，葡萄球菌也可通過產生硝酸還原酶、過氧化氫酶等促進發(fā)色，其代謝產物（乳酸、醋酸及揮發(fā)性化合物）通過分解蛋白質和脂肪釋放更多的香氣物質，具有護色增香的功效，從而賦予發(fā)酵肉制品一定風味[33]。Majumdar 等[34]研究分析了印度東北部發(fā)酵魚Sheedal，從中分離鑒定得到7 株凝固酶陰性葡萄球菌均表現(xiàn)出較強的蛋白質降解活性，并且在蛋白質降解過程中釋放出芳香族化合物和有機酸等，促進了發(fā)酵食品的質地和風味。此外，有研究證實了發(fā)酵菌株對肉制品中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解能力存在差異，田媛等[35]研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌對發(fā)酵肉制品肌原纖維蛋白無明顯降解效果，而對肌漿蛋白有一定降解能力，并且改善了肉制品的色澤和代謝過程。而Villani[36]和Fadda 等[37]研究表明，乳酸菌對發(fā)酵肉制品肌原纖維蛋白的降解能力不如肌漿蛋白的降解能力強，主要改善了肉制品的質地、嫩度。這可能是發(fā)酵菌株本身的菌種特異性導致的，且發(fā)酵原料和發(fā)酵環(huán)境不同也會導致發(fā)酵菌株代謝途徑的差異。

2.3 酵母菌

葡萄糖在厭氧條件下可以分解成二氧化碳和酒精，產生的酒精與酸相互作用，生成具有酯類等化合物，使發(fā)酵產物的香氣更溫和、更濃郁。因此酵母菌可以促進發(fā)酵肉制品的呈色、改善風味、抑制腐敗菌[38]。

酵母菌是發(fā)酵肉制品中常見的微生物，具有一定的蛋白酶活性和脂肪酶活性，對酸性環(huán)境耐受能力較強，具有很強的產香能力，可降解肌原纖維蛋白和肌漿蛋白，能夠抑制脂類氧化，延緩酸敗以及產生酮類、醇類等重要風味物質，對發(fā)酵肉制品風味產生重要貢獻[39]。發(fā)酵肉制品中最常見的酵母菌是漢遜德巴利酵母菌。Cano 等[40]分析了慢發(fā)酵香腸中接種漢遜德巴利酵母菌，發(fā)現(xiàn)這種菌株在降解肌肉蛋白質過程中能夠產生酯類化合物，對于豐富發(fā)酵產品的風味起到重要意義。此外，酵母菌可以與乳酸菌配比成混合發(fā)酵劑，不僅可以改善產品風味和顏色，還可以延長產品的保質期。王鶴霖等[41]研究了植物乳桿菌和魯氏酵母菌混合發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸品質的影響，從結果可看出混合發(fā)酵劑可以顯著促進發(fā)酵香腸的蛋白質降解，改善產品的色澤，延緩脂肪氧化，促進發(fā)酵風味的形成。Zeng 等[42]研究分析了從傳統(tǒng)低鹽發(fā)酵酸魚中分離得到的25 株酵母菌，發(fā)現(xiàn)7 株酵母菌具有良好的蛋白質降解活性，從而賦予發(fā)酵魚肉一定的風味。因此，無論酵母菌是單獨存在還是與乳酸菌等結合存在，都會對發(fā)酵產品的口感、香氣、質地和營養(yǎng)價值起到促進作用。

2.4 其它菌屬

霉菌是一種可在發(fā)酵產品表面形成保護膜的好氧型真菌。大部分霉菌可通過氧化還原作用使發(fā)酵產品形成良好的色澤，霉菌產生的各種酶類對發(fā)酵香腸持有特殊香氣和風味也起主要作用。發(fā)酵肉制品中部分采用的是紅曲霉和青霉菌，陳肖等[43]研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉在發(fā)酵紅曲米時產生的水解酶類可以賦予肉制品悅人的色澤。Trigueros 等[44]研究了干腌香腸表面的霉菌，發(fā)現(xiàn)肉制品發(fā)酵過程中霉菌具有較好的蛋白質降解能力，增強了肉制品的感官特性。發(fā)酵肉制品中芽孢桿菌也具有較好的蛋白質降解活性，有研究表明富含蛋白質的食物主要受芽孢桿菌的影響，肉制品在發(fā)酵中后期隨著pH 和耗氧量的降低，微生物種類逐漸減少，但芽孢桿菌可以生長并逐漸成為優(yōu)勢菌群[45]。具體見表2。

表2 核心微生物群落對蛋白質降解的研究Table 2 Studies on protein degradation by core microbiome

3 蛋白質過度降解導致發(fā)酵肉制品品質的劣變

肉制品的發(fā)酵是蛋白質結構和功能特性發(fā)生變化的一個過程，任何改變蛋白質溶解度的因素都必然會影響發(fā)酵肉類的品質，而肉制品的質地直接影響消費者的購買決策[57]。在肉制品生產或發(fā)酵過程中，蛋白質降解產生多肽、氨基酸等，部分氨基酸進一步代謝，產生的物質對發(fā)酵肉制品風味和質地做出重要貢獻，蛋白質的凝膠化與其構象密切相關，蛋白質過度降解（發(fā)酵時間過長，微生物數量控制不當）易誘導特定氨基酸和肽的生成，產生高濃度的低分子量含氮化合物，甚至產生苦味、金屬味和酸敗味，嚴重影響發(fā)酵肉制品風味；也會發(fā)生蛋白質交聯(lián)和聚集，不利于凝膠結構的形成，從而加速產品品質的劣變，降低產品感官特性，失去食用價值。如自然發(fā)酵魚肉制品中的微生物常常由于粗糙的加工方式使發(fā)酵菌群更加復雜，腐敗微生物的生長不能得到有效控制，而腐敗微生物引起的蛋白質過度降解與魚肉產品質量的下降高度相關[58]。

SDS-PAGE 技術被廣泛應用于鑒別蛋白質的變化，SDS-PAGE 圖譜中大分子質量蛋白條帶的增加、模糊、弱化、消失和低分子質量條帶的出現(xiàn)、濃度增強是蛋白質發(fā)生降解的外在表現(xiàn)，新條帶的不斷出現(xiàn)也可能是發(fā)酵肉制品腐敗的重要標志[59]。劉壽春等[60]研究中，魚肉發(fā)酵前期肌原纖維蛋白各條帶明亮清晰，隨著時間的延長200～29 kDa 之間的條帶逐步出現(xiàn)不同程度的降解，其中肌球蛋白重鏈200 和29 kDa 附近出現(xiàn)條帶高度降解并伴有條帶缺失，肌動蛋白45 kDa 處無明顯變化。17 d 后，開始出現(xiàn)較強烈的蛋白降解，伴有低分子質量的條帶生成，低分子質量條帶濃度和亮度逐漸增強。相比之下，肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的構成不同，主要表現(xiàn)在200～66 kDa 和小于45 kDa 處的條帶明顯降解，從而判斷魚肉可能發(fā)生了劣變。韋誠[61]分析了酸肉發(fā)酵過程中蛋白質的降解情況，通過考察結構特性發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白發(fā)生降解，蛋白質氧化變性程度加深，疏水性、二硫鍵含量顯著增加，導致蛋白發(fā)生交聯(lián)，進而導致酸肉品質劣變。SDS-PAGE 結果表明肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的條帶數量持續(xù)減少，色澤變淺，特別是發(fā)酵110 d 后可觀察到，出現(xiàn)寬而深的蛋白條帶，可能是肌肉蛋白質逐步水解、部分小分子蛋白質重新聚集形成的大分子蛋白質有關。肌肉微觀結構也表明隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白質過度降解導致肌束膜被破壞，部分肌纖維束發(fā)生塌陷，促使其彼此粘連，導致肌肉橫截面紋理不規(guī)則，營養(yǎng)成分流失，說明了過度降解導致酸肉品質發(fā)生了劣變。

蛋白質降解也受肌肉部位、蛋白質種類、pH 及其他多種因素影響，這些加工條件均會顯著引起蛋白質降解速率的變化。溫度和鹽濃度是發(fā)酵肉制品加工中最重要的加工條件之一，適宜的發(fā)酵溫度可使微生物蛋白酶活性增強，促進蛋白質降解，加速肌肉結構的崩解和風味物質的形成。而發(fā)酵溫度過高，導致微生物產酸特性增強，肌原纖維蛋白含量減低，剪切力增加，嫩度下降，咀嚼性較差，影響產品整體的感官評分[62]。鹽濃度不僅可以使食品具有適度的咸味，還有助于增加保水性和色澤鮮亮，能夠使產品形成良好的凝膠質地和感官品質。研究發(fā)現(xiàn)降低肉中NaCl含量或擴散的速度都會導致蛋白質急劇降解，品質發(fā)生劣變，進而對發(fā)酵肉制品的品質和風味產生一定影響[63]。肉制品發(fā)酵過程中NaCl 的減少和生火腿pH 的變化使內源性蛋白酶活性增強，促進肌肉蛋白質劇烈降解，導致發(fā)酵肉制品形成過度粘附性和引發(fā)苦味。因此，國內外研究者采用包括超高壓和超聲波在內的新興技術著手改善發(fā)酵肉制品的口感特性和質地特征。采用溫和加熱和超高壓相結合的方法，提高了發(fā)酵肉制品的硬度、降低了粘附性，但由于成本較高、費力耗時，通常不投入大規(guī)模應用。一些研究表明，超聲波處理可以有效提高發(fā)酵肉制品中結構蛋白的降解，改善產品的質地和風味[64]。Lopez 等[65]使用超聲波來監(jiān)測肉制品發(fā)酵過程中蛋白質降解強度，結果表明超聲波處理顯著增加了肌球蛋白、肌動蛋白和肌漿蛋白片段。Zhou 等[66]研究了超聲波處理對干腌火腿蛋白質降解的影響，從結果可看出在功率1000 W，溫度50 ℃時，超聲波處理能夠顯著促進肌肉蛋白質的降解，釋放甜味和鮮味氨基酸，有效減少了干腌火腿的苦味，提升產品的風味。

4 結語和展望

在發(fā)酵過程中，肌肉蛋白質降解作用是發(fā)酵肉制品特殊質地和風味形成的一個重要途徑。肌肉蛋白質的降解與內源性蛋白酶和微生物的降解作用密切相關。本文重點闡述了核心微生物的研究現(xiàn)狀、內源酶和微生物蛋白酶對肌肉蛋白質的降解作用。具有風味和品質改善作用的肉制品發(fā)酵菌株的應用也為改善工業(yè)化發(fā)酵肉制品的風味缺陷提供了有效手段，對發(fā)酵肉制品的發(fā)展具有深遠意義。但是在發(fā)酵肉制品的研究中也存在一些問題，主要體現(xiàn)在3 方面：a.對于發(fā)酵過程中蛋白質的變化，大部分研究的焦點集中在定性判斷和定量層面，很少關注其自身微觀結構的變化；b.發(fā)酵過程中，微生物和內源酶的相互作用機制不明確；c.肌肉蛋白質降解程度需有效手段加以控制。此外，特定的優(yōu)勢微生物可能在發(fā)酵機制中發(fā)揮重要作用，利用現(xiàn)代基因工程優(yōu)化發(fā)酵微生物的功能，如通過蛋白質組學技術研究調控基因功能性，建立基因組序列和其生物學作用之間的橋梁，也可以為篩選具有良好適應性的菌株以及生產高質量的發(fā)酵產品提供理論基礎。