QuEChERS-超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果制品和肉醬中10 種四環(huán)素類抗生素

谷 悅，唐會鑫，李 朔，馬 玲，王 可,, ，楊莉麗

（1.河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050024；2.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，石家莊市化學(xué)毒物檢測及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050011）

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生，具有抑菌作用，是治療和控制傳染病的最重要的廣譜抗生素之一，對肺炎球菌、衣原體和支原體等有防治作用[1-2]。其不僅可在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中用于防治腸道感染和促生長[3]，還可在水果種植業(yè)中用于防治叢枝病和黃龍病[4-5]，以提高動物源性食品和水果的產(chǎn)量和品質(zhì)。細(xì)菌核糖體的30S 亞基和四環(huán)素類抗生素的特異性結(jié)合會破壞細(xì)菌肽鏈和蛋白質(zhì)的生成，從而達(dá)到滅菌的目的[6-7]。這類抗生素因其成本低、抗菌范圍廣和高效等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[8]，但其在生物體內(nèi)的代謝水平有限，大部分未經(jīng)代謝就被排出體外，重新進(jìn)入環(huán)境[9]。而四環(huán)素類抗生素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易分解，因此會污染環(huán)境，并且以食物鏈為傳播途徑威脅人類健康[10]。其長期蓄積攝入到人體后，會對牙齒、肝臟、腎臟等造成損害，還易引起人體溶血性貧血和產(chǎn)生耐藥性[11-12]。在動物肌肉組織和牛奶中，歐盟限定四環(huán)素類抗生素殘留量小于0.1 mg/kg[13]。我國GB 31650-2019 標(biāo)準(zhǔn)限定了在牛肉等動物源性食品中強(qiáng)力霉素限量是0.1～0.6 mg/kg，四環(huán)素、土霉素、金霉素的總限量為0.1～1.2 mg/kg。

免疫分析法[14-15]、高效液相色譜法[16-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[19-22]等是檢測四環(huán)素類抗生素的主要方法。但是在食品基質(zhì)中免疫分析法特異性較差，液相色譜方法消耗大量試劑，當(dāng)前常采用LC-MS/MS 對獸藥殘留進(jìn)行檢測，該方法具有靈敏、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)。目前四環(huán)素類抗生素殘留檢測多為其中一種或幾種，且多集中在環(huán)境[23-26]和動物源性食品（雞蛋、牛奶等）[27-30]等樣品中，尚未有測定水果制品和肉醬中10 種四環(huán)素類抗生素殘留的報(bào)道。此外，檢測食品中四環(huán)素類抗生素殘留多采用液液萃取和固相萃取等前處理方法，而QuEChERS法相對使用較少。QuEChERS 法具有快速、簡單及試驗(yàn)成本低等特點(diǎn)，與在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用相比，其在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用更為廣泛且日益成熟。由于檢測獸藥殘留的樣品基質(zhì)更為復(fù)雜，需要對傳統(tǒng)QuEChERS 方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，以達(dá)到適用于獸藥殘留檢測的目的。因此，對于水果制品和肉醬，本文擬通過優(yōu)化QuEChERS 前處理技術(shù)（提取劑種類、凈化劑種類和用量等）確定最佳前處理?xiàng)l件，并結(jié)合UPLC-MS/MS 建立10 種四環(huán)素類抗生素殘留的檢測方法，為水果制品和肉醬中四環(huán)素類抗生素的監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二甲胺四環(huán)素（Minocycline）、差向四環(huán)素（4-Epitetracycline hydrochloride）、差向土霉素（4-Epioxytetracycline）、去甲基金霉素（Demeclocycline hydrochloride）、差向金霉素（4-Epichlorotetracycline）、甲烯土霉素（Methacyclinebase） 純度≥82.0%，天津Alta 公司；土霉素（Oxytetracycline）、四環(huán)素（Tetracycline）、金霉素（Chlortetracycline）、強(qiáng)力霉素（Doxycycline） 純度≥94.6%，德國Dr.Ehrenstorfer.GmbH公司；甲酸（色譜純）、N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）色譜純，美國Dikma 公司；甲醇 色譜純，美國Fisher 公司；乙腈 色譜純，美國Sigma公司；十八烷基硅烷（C18，40～50 μm） 美國Welch公司；氯化鈉分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；草莓罐頭、橘子罐頭、黃桃罐頭、蘋果醬、藍(lán)莓醬、草莓醬、牛肉醬、雞肉醬和豬肉醬 購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

AB SCIEX Exion 超高效液相色譜儀，AB TRIPLE QUAD 5500 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）及MultiQuant 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國AB SCIEX 公司；VXMNAL 渦旋振蕩器 美國OHAUS 公司；EVAP-12 氮吹儀 美國Organomation 公司；KQ5200DE 超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CR21N 高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi 公司；Milli-Q 超純水機(jī) 美國Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取適量四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.0 mg/mL 單標(biāo)儲備液，儲存于冰箱（-20 ℃）。取適量上述溶液，甲醇稀釋成1.0 mg/L混合溶液。取適量1.0 mg/L 混合溶液，分別用草莓醬和牛肉醬的空白基質(zhì)提取液配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理 水果制品：準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.01 g）草莓醬，放入50 mL 聚丙烯塑料離心管中，加入3 mL 純水、15 mL 0.2%甲酸乙腈，渦旋后超聲10 min，再加入0.5 g NaCl，振蕩后以8000 r/min 在25 ℃下離心5 min。移取2 mL 上清液至盛有30 mg PSA 的15 mL 聚丙烯塑料離心管中，渦旋混勻30 s，以8000 r/min 離心5 min。取0.5 mL 上清液，加水稀釋至1 mL 后混勻，經(jīng)0.20 μm 濾膜過濾，供UPLCMS/MS 測定。

肉醬：準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.01 g）牛肉醬，放入50 mL 聚丙烯塑料離心管中，加入3 mL 純水、15 mL 0.2%甲酸乙腈，渦旋后超聲10 min，再加入0.5 g NaCl，振蕩后以8000 r/min 在4℃下離心5 min。移取2 mL 上清液至盛有100 mg C18的15 mL 聚丙烯塑料離心管中，渦旋混勻30 s，以8000 r/min 離心5 min。取0.5 mL 上清液，加水稀釋至1 mL 后混勻，經(jīng)0.20 μm 濾膜過濾，供UPLC-MS/MS 測定。

1.2.3 液相色譜條件 ZORBAX SB-Aq 色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；0.4%甲酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B；梯度洗脫程序：0～2.0 min，26% B；2.0～2.1 min，26%～40% B；2.1～3.0 min，40% B；3.0～3.1 min，40%～80% B；3.1～4.0 min，80% B；4.0～4.1 min，80%～26% B；4.1～8.0 min，26% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子源電壓：5500 V；氣簾氣（N2）：40 psi；噴霧氣（N2）：55 psi；輔助氣（N2）：55 psi。10 種四環(huán)素類抗生素的詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10 種四環(huán)素類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 10 tetracycline antibiotics

1.3 數(shù)據(jù)處理

采集數(shù)據(jù)使用分析軟件1.6.3，數(shù)據(jù)處理使用MultiQuant 3.0.2 并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回收率用Microsoft Excel 97-2003 軟件，計(jì)算后采用Origin 2018 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)中富含N、O 原子，其更易結(jié)合H+，因此在ESI 正離子模式進(jìn)行檢測。10 種四環(huán)素類化合物的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液均為50 ng/mL，以7 μL/min 采用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式將其注入離子源。首先在Q1 MS 模式掃描得到10 種目標(biāo)化合物的母離子，然后在Product Ion（MS2）模式進(jìn)行子離子全掃描，選擇出兩個響應(yīng)較強(qiáng)的碎片離子為定性離子，其中響應(yīng)值更高的為定量離子。將各目標(biāo)化合物的母離子和相對應(yīng)的兩個碎片離子組成離子對，在MRM 模式下優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能（CE），結(jié)果見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇 選擇ZORBAX Eclispse XDBC18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）、ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）、Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)表明，使用ZORBAX Eclispse XDB-C18色譜柱對10 種目標(biāo)化合物進(jìn)行分離時，分離度較差，二甲胺四環(huán)素響應(yīng)值低、峰形寬且拖尾嚴(yán)重（見圖1）；使用Poroshell 120 EC-C18色譜柱進(jìn)行分離時，由于四環(huán)素與差向四環(huán)素母離子和定量子離子相同，峰形疊加，在定量分析時會產(chǎn)生相互干擾，從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，且強(qiáng)力霉素的基線偏高（見圖2）；而在ZORBAX SB-Aq色譜柱上，10 種四環(huán)素類抗生素可以在較短的時間內(nèi)獲得較好的分離度且峰形較好（見圖3）。因此，選擇ZORBAX SB-Aq 色譜柱分離10 種四環(huán)素類抗生素。

圖1 10 種四環(huán)素類抗生素在ZORBAX Eclispse XDBC18 色譜柱上的提取離子流色譜圖（50 μg/L）Fig.1 Extracted ion chromatograms of 10 tetracycline antibiotics on a ZORBAX Eclispse XDB-C18 column (50 μg/L)

圖2 10 種四環(huán)素類抗生素在Poroshell 120 EC-C18 色譜柱上的提取離子流色譜圖（50 μg/L）Fig.2 Extracted ion chromatograms of 10 tetracycline antibiotics on a Poroshell 120 EC-C18 column (50 μg/L)

圖3 10 種四環(huán)素類抗生素在ZORBAX SB-Aq 色譜柱上的提取離子流色譜圖（50 μg/L）Fig.3 Extracted ion chromatograms of 10 tetracycline antibiotics on a ZORBAX SB-Aq column (50 μg/L)

2.2.2 流動相優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇乙腈為有機(jī)相時，各目標(biāo)化合物存在峰形較寬且分離度較差現(xiàn)象，故選用甲醇。另以純水、0.4%甲酸水、2 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.4%甲酸，v/v）為水相進(jìn)行比較。當(dāng)水相為純水時，金霉素和甲烯土霉素峰形寬且基線偏高（見圖4）；隨著甲酸的加入，峰形尖銳且對稱；而乙酸銨的引入使得除二甲胺四環(huán)素外其他9 種目標(biāo)化合物的響應(yīng)均有所降低，最終選擇0.4%甲酸水溶液/甲醇為流動相。對梯度洗脫程序進(jìn)一步優(yōu)化后，10 種目標(biāo)化合物的總離子流圖如圖5 所示。

圖4 10 種四環(huán)素類抗生素在流動相為純水/甲醇中的總離子流圖（50 μg/L）Fig.4 Total ion chromatograms of 10 tetracycline antibiotics using water/methanol as mobile phase (50 μg/L)

圖5 10 種四環(huán)素類抗生素的總離子流圖（50 μg/L）Fig.5 Total ion chromatograms of 10 tetracycline antibiotics(50 μg/L)

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇 提取劑的選擇要求是盡可能萃取目標(biāo)化合物，并減少對雜質(zhì)的提取。乙酸乙酯和乙腈是常用的提取劑，并且酸化乙腈對許多分析物具有良好的萃取效率，因此實(shí)驗(yàn)以草莓醬為基質(zhì)，比較了乙酸乙酯、乙腈和0.3%甲酸乙腈對10 種四環(huán)素類抗生素的提取效率（見圖6）。用乙酸乙酯提取時，10 種四環(huán)素類抗生素的回收率均在50%以下；而乙腈為提取溶劑時，10 種四環(huán)素類抗生素的回收率整體升高，說明含有極性基團(tuán)的四環(huán)素類抗生素更易溶于強(qiáng)極性的乙腈中[29]。在乙腈中加入0.3%甲酸后，10 種四環(huán)素類抗生素的回收率進(jìn)一步提高，在33.1%～112.5%之間。進(jìn)一步對甲酸用量進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)分別考察了0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%甲酸乙腈對10 種四環(huán)素類抗生素的回收率的影響（見表2）。甲酸用量從0.1%提高到0.2%時，10 種四環(huán)素類抗生素的回收率均有所升高，在68.2%～99.5%之間。當(dāng)進(jìn)一步增加甲酸的用量時，二甲胺四環(huán)素、四環(huán)素、去甲基金霉素和金霉素的回收率均呈現(xiàn)不同程度降低，其余6 種目標(biāo)化合物的回收率變化不大。這可能是由于在弱酸性條件下，二甲胺四環(huán)素、四環(huán)素、去甲基金霉素和金霉素比較穩(wěn)定，隨著酸度的增大，會使得穩(wěn)定性降低，易發(fā)生降解[31]。綜合上述分析，本實(shí)驗(yàn)選擇0.2%甲酸乙腈作為最終提取劑。

表2 含不同量甲酸的乙腈對10 種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Table 2 Effect of acetonitrile containing different amounts of formic acid on the recoveries of 10 tetracycline antibiotics

2.3.2 凈化劑的優(yōu)化 QuEChERS 常用凈化劑有PSA、C18等，在去除糖類、脂肪酸等雜質(zhì)時常用PSA，去除脂類則多用C18[32]。分別在草莓醬和牛肉醬中比較了使用PSA、C18、無水Na2SO4作凈化劑對回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對于草莓醬樣品，分別以C18和無水Na2SO4作凈化劑時，二甲胺四環(huán)素的回收率均低于45%，而以PSA 作凈化劑時效果更好，10 種四環(huán)素類抗生素的回收率均在70%以上（見圖7）；對PSA 用量進(jìn)一步優(yōu)化，本文比較了10、30、60、100 和150 mg PSA 對草莓醬的凈化效果。結(jié)果顯示，隨著PSA 用量的增加，10 種四環(huán)素類抗生素的回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，說明PSA 用量增大可能會增加對抗生素的吸附量，從而導(dǎo)致回收率降低。在PSA 用量為30 mg 時，10 種四環(huán)素類抗生素均能達(dá)到較好的回收率，在74.7%～110.2%之間（見圖8）。對于牛肉醬基質(zhì)，以PSA 為凈化劑時，差向土霉素、土霉素和差向金霉素的回收率均低于56%，二甲胺四環(huán)素的回收率僅62.8%；使用無水Na2SO4凈化時，差向土霉素、土霉素、差向金霉素和二甲胺四環(huán)素的回收率在59.0%～63.4%之間；而用C18作凈化劑時，二甲胺四環(huán)素回收率可達(dá)76%，另外差向土霉素、土霉素和差向金霉素的回收率也略有升高，其他6 種目標(biāo)化合物的回收率在74.8%～88.5%之間，10 種目標(biāo)化合物的整體回收率更好（見圖9）；同樣對C18用量進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)比較了10、30、60、100和150 mg C18對牛肉醬的凈化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C18用量為100 mg 時，對10 種四環(huán)素類抗生素整體凈化效果最佳，回收率在70.0%～90.4%之間（見圖10）。因此，本實(shí)驗(yàn)在水果制品中選擇30 mg PSA作為凈化劑，在肉醬基質(zhì)中選擇100 mg C18作為凈化劑。

圖7 草莓醬中不同凈化劑對10 種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig.7 Effect of different adsorbents on the recoveries of 10 tetracycline antibiotics in strawberry jam

圖8 草莓醬中PSA 用量對10 種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig.8 Effect of PSA dosages on the recoveries of 10 tetracycline antibiotics in strawberry jam

圖9 牛肉醬中不同凈化劑對10 種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig.9 Effect of different adsorbents on the recoveries of 10 tetracycline antibiotics in beef sauce

圖10 牛肉醬中C18 用量對10 種四環(huán)素類抗生素回收率的影響Fig.10 Effect of C18 dosages on the recoveries of 10 tetracycline antibiotics in beef sauce

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100%[33]，當(dāng)ME＜80%表示基質(zhì)抑制，其＞120%則基質(zhì)增強(qiáng)，而ME 在80.0%～120.0%之間時，可忽略基質(zhì)效應(yīng)。10 種四環(huán)素類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3，從表3 可以看出，對于草莓醬，二甲胺四環(huán)素的ME 值為278.7%，有基質(zhì)增強(qiáng)，其它9 種四環(huán)素類抗生素的ME 值在100.0%～112.6%之間，基質(zhì)效應(yīng)可忽略；在牛肉醬中，二甲胺四環(huán)素、差向四環(huán)素、土霉素和差向金霉素的ME 值在121.3%～224.6%之間，具有基質(zhì)增強(qiáng)作用，而其它6 種目標(biāo)化合物的ME值在110.0%～116.8%之間，可忽略。因此，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)分別采用草莓醬和牛肉醬的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量檢測。

表3 10 種四環(huán)素類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effects of 10 tetracycline antibiotics

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 按照1.2.1 配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果表明，10 種四環(huán)素類抗生素在各自濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均在0.999 以上。分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算得到各目標(biāo)化合物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表4 和表5。

表4 草莓醬中10 種四環(huán)素類抗生素的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 10 tetracycline antibiotics in strawberry jam

表5 牛肉醬中10 種四環(huán)素類抗生素的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 10 tetracycline antibiotics in beef sauce

2.4.3 加標(biāo)回收率和精密度 在草莓醬和牛肉醬空白基質(zhì)樣品中分別添加低、中、高三個不同加標(biāo)水平的四環(huán)素類抗生素，前處理步驟按1.2.2 進(jìn)行，結(jié)果見表6。10 種四環(huán)素類抗生素的平均回收率為70.0%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～10.3%，精密度和準(zhǔn)確度良好，適用于水果制品和肉醬中10 種四環(huán)素類抗生素的殘留檢測。

表6 10 種四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）Table 6 Spiked recoveries and RSDs of 10 tetracycline antibiotics (n=7)

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化好的前處理方法對市售的18份水果制品（其中包括3 份草莓罐頭、2 份橘子罐頭、5 份黃桃罐頭、2 份蘋果醬、3 份藍(lán)莓醬和3 份草莓醬）和10 份肉醬（包括5 份牛肉醬、3 份雞肉醬和2 份豬肉醬）樣品進(jìn)行檢測，10 種四環(huán)素類抗生素的檢測結(jié)果均低于方法的檢出限。

3 結(jié)論

使用0.2%甲酸乙腈提取，結(jié)合分散固相萃取凈化，本研究建立了水果制品和肉醬中10 種四環(huán)素類抗生素的UPLC-MS/MS 檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 種四環(huán)素類抗生素在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r＞0.999），在75、300 和750 μg/kg 三個不同加標(biāo)水平下的平均回收率為70.0%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～10.3%。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，適用于水果制品及肉醬中10 種四環(huán)素類抗生素的同步快速檢測，進(jìn)一步完善了四環(huán)素類抗生素監(jiān)測體系。