菊芋中抗氧化成分的在線鑒定和構(gòu)效關(guān)系分析

張志毅，白若熙，宗愛珍，張敏敏，鄭振佳，張 斌,

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安 271018；

2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所，山東濟南 250012；3.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測試中心，山東濟南 250014）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）為多年生菊科向日葵屬宿根生草本植物，又名姜不辣、洋姜、鬼子姜等[1]，我國各地均有種植[2]。菊芋中含有菊糖（菊粉）、酚酸類和萜類物質(zhì)等多種生物活性成分[3-5]，具有抗氧化[6-7]、抗炎[8]、抗癌[9]、預(yù)防治療“三高”[10-12]以及改善腸道微生態(tài)等作用[13-14]?？Х弱？鼘幩犷惢衔锸蔷沼笾兄饕铀?，具有較強的抗氧化能力[15-16]，其酚羥基與自由基容易發(fā)生反應(yīng)，可以快速清除羥基自由基以及過氧自由基[17]，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[18]，提高谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性[19]。菊芋中咖啡?？鼘幩犷惢衔锏南嚓P(guān)報道多集中在菊芋莖葉中，菊粉的相關(guān)報道多集中在菊芋塊莖，而塊莖中的咖啡?？鼘幩犷惢衔秕r有報道。

菊芋中酚酸目前多采用高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜法進行定量和定性分析，定向篩選并鑒定具有抗氧化活性成分的研究較少[20-21]?；贒PPH 篩選模型的高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）的方法可以在線篩選鑒別自由基清除劑，通過抗氧化成分與DPPH 反應(yīng)在517 nm 處形成的負峰，篩選出菊芋中咖啡酰奎寧酸類化合物，通過飛行時間質(zhì)譜獲得物質(zhì)的精確分子量進行定性，從而實現(xiàn)樣品中成分的準確、快速鑒定[22]。鄭振佳等[23]通過HPLC-DAD-QTOF-MS 在牛蒡中篩選出綠原酸、咖啡酸、1,5-O-二咖啡?？鼘幩岬?9 種咖啡酰奎寧酸類化合物及其衍生物。Hu 等[24]通過DPPH-HPLC-ESI-MS 在線篩選出十大功勞葉乙酸乙酯相中綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3 種化合物。該方法選擇性強，靈敏度與分辨率高于傳統(tǒng)方法，分析結(jié)果更精準。

本研究以菊芋為研究對象，通過高分辨質(zhì)譜結(jié)合在線清除DPPH 自由基模型篩選鑒別菊芋中咖啡酰奎寧酸類成分，并評價此類成分單體的抗氧化活性，為菊芋的成分分析、功能研究和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊芋干片 購于河北晉州；DPPH 美國Sigma公司；甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、石油醚（分析純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純） 天津凱通化學(xué)試劑有限公司；純凈水 娃哈哈集團有限公司；硫酸亞鐵 化學(xué)純，博山化學(xué)試劑廠；水楊酸 分析純，上海源葉生物科技有限公司；ABTS 超純，上海麥克林生化科技有限公司；過硫酸鉀 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl 緩沖液、鄰苯三酚 北京索萊寶科技有限公司；咖啡酸、綠原酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩針藴势?上海源葉生物科技有限公司。

SECURA224-ICN 電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；Rigol L-3000 泵 北京普源精電科技有限公司；Thermo Fisher UltiMate 3000 高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色譜儀 美國沃特世公司；Bruker impact Ⅱ高分辨飛行時間質(zhì)譜儀 德國布魯克科技有限公司；SPECTRAMAX M5 多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液及DPPH 自由基溶液制備 將菊芋粉碎后過60 目篩，稱取1.0 g 樣品，加入10 mL 95%乙醇回流提取30 min，過濾后取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇。參考袁曉艷等[4]的方法，依次用3 倍體積的石油醚和乙酸乙酯萃取后濃縮。取少許乙酸乙酯相吹干，甲醇復(fù)溶，過0.22 μm 有機濾膜，備用。精密稱定DPPH 標準品，用80%乙腈配制成濃度為6×10-5mol/L 的DPPH 自由基溶液備用，于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗氧化成分在線篩選和鑒別 參考張敏敏等[25]試驗方法，采用Thermo Fisher U 3000 雙元三液相色譜系統(tǒng)進行目標組分的篩選和鑒別，柱后流出液與L-3000 泵中流出的DPPH 自由基溶液在反應(yīng)池中反應(yīng)后，在517 nm 波長下進行檢測，通過紫外檢測器在517 nm 波長處形成負峰并通過質(zhì)譜進行分析。通過獲取的精確分子量結(jié)合DPPH 自由基清除的液相色譜圖實現(xiàn)菊芋中目標化合物的在線篩選與鑒定。

1.2.2.1 液相色譜工作條件 Waters X-Bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-水（0.1%甲酸），梯度洗脫：0～9 min（13%A），9～10 min（13%～20%A），10～23 min（20%A），23～28 min（20%～30%A），28～33 min（30%～40%A）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：3 μL；檢測波長：280、320 nm。

1.2.2.2 DPPH 溶液反應(yīng)工作條件 反應(yīng)器為PEEK盤管（10 m×0.25 mm）；流動相為DPPH 自由基溶液，流速0.5 mL/min，檢測波長517 nm。

1.2.2.3 質(zhì)譜工作條件 參考張敏敏等[22]的方法，電噴霧離子源，分別采用電噴霧正離子及負離子模式；噴霧壓力310 kPa；毛細管電壓5000 V；干燥氣溫度200 ℃；干燥氣流速8 L/min；錐孔電壓60 V；裂解電壓120 V；檢測范圍為m/z 50～1500。

1.2.3 咖啡酰奎寧酸類化合物抗氧化活性評價

1.2.3.1 DPPH 自由基清除實驗 參考徐小博等[26]的方法并稍作修改，分別取1 mL 不同質(zhì)量濃度的咖啡?？鼘幩犷惢衔飿藴势啡芤海?、10、20、30、40、50 μg/mL）于試管中，加入等體積的1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，用酶標儀于517 nm 下測定吸光值A(chǔ)1。以不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，測定其DPPH 自由基的清除能力。按以下公式計算DPPH 自由基的清除率。

式中：A1：反應(yīng)后樣品溶液的吸光值；A2：樣品溶液自身的吸光值；A0：空白對照的吸光值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除實驗 參考徐小博等[26]的方法并稍作修改，稱取0.1943 g ABTS 和0.0323 g過硫酸鉀，分別用15 mL 蒸餾水溶解，混合并定容至50 mL，在室溫下放置12～16 h 得到ABTS+溶液。將ABTS+溶液用無水乙醇稀釋至吸光值為0.70±0.02（734 nm）備用。分別取0.2 mL 不同質(zhì)量濃度的咖啡?？鼘幩犷惢衔飿藴势啡芤海?、10、20、30、40、50 μg/mL）于試管中，加入1.8 mL ABTS+溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)6 min，用酶標儀于734 nm下測定吸光值A(chǔ)1。以不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，測定其ABTS+自由基的清除能力。參考“1.2.3.1”公式計算ABTS+自由基的清除率。

1.2.3.3 超氧陰離子自由基清除實驗 參考劉英等[27]的方法并稍作修改，分別取1 mL 不同質(zhì)量濃度的咖啡?？鼘幩犷惢衔飿藴势啡芤海?、20、40、60、80、100 μg/mL）于試管中，加入4.5 mL 的Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH8.2），混勻，25 ℃水浴反應(yīng)20 min，隨后加入0.4 mL 的1 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，25 ℃反應(yīng)6 min，立即加入1 mL 0.12 mol/L 的鹽酸終止反應(yīng)，用酶標儀于320 nm 下測定吸光值A(chǔ)1。以不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，測定其超氧陰離子自由基的清除能力。參考“1.2.3.1”公式計算超氧陰離子自由基的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

抗氧化活性評價實驗重復(fù)三次，采用Origin 2017 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋咖啡?？鼘幩犷惢衔锏奶崛∨c液相分析條件優(yōu)化

樣品經(jīng)95%乙醇回流提取后，成分較復(fù)雜，影響質(zhì)譜分析的效果，因此需要對樣品進行前處理。根據(jù)參考文獻，咖啡?？鼘幩嶂饕嬖谟谝宜嵋阴ハ嘀?，先用石油醚脫除脂類成分，然后用乙酸乙酯進行萃取[23]。咖啡?？鼘幩犷惢衔锏淖畲笪詹ㄩL在280 和320 nm 附近，在兩個波長下同時具有較高紫外吸收的組分可能為該類化合物，從圖1 菊芋乙酸乙酯相液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，菊芋中含量較多的組分在280 和320 nm 均有較高的吸收峰，推測可能為咖啡酰奎寧酸類化合物。

圖1 菊芋樣品液相色譜圖Fig.1 HPLC of Jerusalem artichoke

2.2 抗氧化成分在線篩選

在280 和517 nm 條件下進行色譜分析和在線抗氧化篩選，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出色譜峰的分離程度和峰形較好，且響應(yīng)值強度適中，可以滿足抗氧化成分的在線篩選。通過“2.4”結(jié)合對照品共鑒定出該樣品中含量較高且具有抗氧化作用的活性成分有5 種。

圖2 菊芋提取物（280 nm）與在線清除自由基（517 nm）HPLC 圖Fig.2 HPLC of Jerusalem artichoke extract (280 nm) and online radical scavenging (517 nm)

2.3 MS 條件優(yōu)化結(jié)果

分別考察了正、負離子模式下樣品的總離子流圖，結(jié)果見圖3。通過對比發(fā)現(xiàn)樣品在負離子模式下響應(yīng)值優(yōu)于正離子模式，雜質(zhì)較少，因此選取負離子模式為質(zhì)譜檢測條件。

圖3 正離子模式及負離子模式下總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram in positive and negative ion mode

2.4 菊芋中咖啡酰奎寧酸類化合物的鑒別

在負離子模式下進行質(zhì)譜掃描，通過精確分子量信息與相關(guān)文獻比對初步推斷5 種抗氧化活性成分中有1 種單咖啡酰奎寧酸、3 種二咖啡酰奎寧酸以及咖啡酸。對負離子模式下測得的碎片峰信息與咖啡?？鼘幩犷惢衔镌谪撾x子模式下的相對分子質(zhì)量進行對比，抗氧化成分分析結(jié)果見表1?；衔? 保留時間為6.1 min，在負離子模式下m/z 為353.0874，參考相關(guān)文獻可以推斷化合物1 為單咖啡?？鼘幩?，其中綠原酸存在范圍較廣，可能性最大，推測化合物1 為綠原酸[23]?；衔? 保留時間為9.6 min，在負離子模式下m/z 為179.0254，參考相關(guān)文獻可以推斷為咖啡酸[23]?；衔?、4、5 保留時間依次為18.0、19.2、22.7 min，在負離子模式下m/z 依次為515.1168、515.1188、515.1182，二咖啡?？鼘幩岬睦碚撡|(zhì)譜信號為515.1195[M-H]-，通過參考相關(guān)文獻分析，推斷3 種化合物均為二咖啡?？鼘幩醄23]。與實驗室購置的標準品進行對照后，確認峰1～5 依次為綠原酸、咖啡酸、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡酰奎寧酸。

表1 菊芋乙酸乙酯相提取物的HPLC-Q-TOF-MS 分析結(jié)果Table 1 HPLC-Q-TOF-MS analysis results of ethyl acetate phase extract of Jerusalem artichoke

2.5 體外抗氧化實驗結(jié)果

2.5.1 DPPH 自由基清除能力 如圖4 所示，5 種咖啡酰奎寧酸類化合物均有很強的DPPH 自由基清除能力。在0～50 μg/mL 范圍內(nèi)，DPPH 自由基清除率與化合物濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為10 μg/mL和20 μg/mL 時，咖啡酸對DPPH 自由基的清除率大于其他組分，當(dāng)濃度為50 μg/mL 時，各化合物對DPPH 自由基的清除率均在94%以上，其中咖啡酸的清除效果最好，為95.43%。

圖4 咖啡酰奎寧酸類化合物對DPPH 自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of caffeoylquinic acids on DPPH free radicals

2.5.2 ABTS+自由基清除能力 如圖5 所示，5 種咖啡?？鼘幩犷惢衔飳BTS+自由基均有較強的清除能力。當(dāng)化合物濃度為0～50 μg/mL 時，與ABTS+自由基清除率呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為10 μg/mL 時，5 種化合物對ABTS+的清除能力均大于陽性對照組VC。其中咖啡酸ABTS+自由基清除活性在各濃度下均優(yōu)于其他組分，當(dāng)濃度為50 μg/mL 時，VC、咖啡酸、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、綠原酸的ABTS+自由基清除率分別為71.97%、69.63%、54.17%、51.91%、49.61%、41.43%。

圖5 咖啡?？鼘幩犷惢衔飳BTS+自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of caffeoylquinic acids on ABTS+free radicals

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力 如圖6 所示，5 種咖啡?？鼘幩犷惢衔飳Τ蹶庪x子自由基均有一定的清除能力。在0～100 μg/mL 范圍內(nèi)，化合物濃度與超氧陰離子自由基清除率呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為50 μg/mL 時，VC、綠原酸、咖啡酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岬某蹶庪x子自由基清除率分別為84.21%、51.40%、51.12%、49.15%、47.18%、46.77%。

2.5.4 體外抗氧化活性分析 采用雷達圖對5 種咖啡?？鼘幩犷惢衔锏目寡趸钚赃M行分析。當(dāng)濃度為40 μg/mL 時，5 種咖啡?？鼘幩犷惢衔锏目寡趸芰θ鐖D7 所示，綠原酸、咖啡酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岬腄PPH 清除率與VC十分接近，均在95%附近。以上篩選出的化合物富含豐富的酚羥基，保證了提供質(zhì)子的能力，從而達到清除DPPH 自由基的效果[28]；此外還表現(xiàn)出較好的ABTS+自由基清除效果，其中，咖啡酸清除率與VC相當(dāng)，除咖啡酸外，其他4 種化合物清除率均略低于VC；以上5 種化合物超氧陰離子清除率均低于VC，這與劉英等[27]的研究結(jié)果類似。多酚類化合物的抗氧化活性主要取決于其B 環(huán)上的鄰二羥基，抗氧化活性的強弱與酚羥基和自由基反應(yīng)可否形成穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)有關(guān)[29]?？傮w來看，咖啡?？鼘幩犷惢衔锞哂泻芨叩淖杂苫宄芰ΓХ人釋PPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基3 種自由基的清除效果最好，其次是3,4-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?，而3,5-O-二咖啡?？鼘幩釋? 種自由基的清除率略低，這可能是因為C4 位置被咖啡?；セ目鼘幩岜仍贑3 或C5 位置上顯示出更高的抗自由基活性，該結(jié)果與Tamayose 等[15]的報道相類似；此外，Li 等[30]的研究指出，對于二咖啡?？鼘幩犷惢衔飦碚f，含有相鄰的兩個咖啡酰基團（3,4-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩幔┫啾群邢嗷ミh離的兩個咖啡酰基團（3,5-O-二咖啡?？鼘幩幔┠鼙憩F(xiàn)出更好的抗氧化活性，這可能是因為分子間擁擠的程度會增加分子的能量，從而提高氧化還原電位，相反的，兩個相互遠離的分子之間能量較低，其抗氧化電位也隨之降低。

圖7 咖啡酰奎寧酸類化合物的抗氧化活性Fig.7 Antioxidative activity of caffeoylquinic acids

3 結(jié)論

本研究建立了在線鑒定菊芋中咖啡?？鼘幩犷惢衔锏姆椒?，確定了菊芋乙酸乙酯相中5 種抗氧化活性成分，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)、參考文獻并采用標準品對照后，確認菊芋中含有綠原酸、咖啡酸、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩? 種咖啡?？鼘幩犷惢衔铩？寡趸瘜嶒灡砻? 種咖啡酰奎寧酸類化合物有良好的清除DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基的能力，其中咖啡酸的效果最好，分別為95.43%、69.63%、51.12%，其余4 種組分的清除效果略低于咖啡酸，這可能與咖啡?；セ稽c的差異及酚羥基數(shù)目有關(guān)。本方法具有快速、準確、篩選效率高等優(yōu)點，為建立快速、在線的菊芋中咖啡?？鼘幩峄衔锏臋z測方法提供技術(shù)支撐，同時為咖啡?？鼘幩犷惢衔锏拈_發(fā)利用及抗氧化產(chǎn)品研發(fā)提供理論支撐。