超濾親和結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和分子對接技術(shù)篩選茶葉中α-葡萄糖苷酶抑制肽

昝麗霞 ，王威威，張文夷，李新生,5,6，陳小華,5,6，燕 飛,5,6，付 靜,5,6

（1.陜西理工大學，陜西漢中 723001；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723001；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西漢中 723001；4.陜西理工大學秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室（培育），陜西漢中 723001；5.茶葉種植與加工研究所，陜西漢中 723001；6.陜西省四主體一聯(lián)合茶產(chǎn)業(yè)校企聯(lián)合研究中心，陜西漢中 723001）

糖尿病（Diabetes Mellitus）是一種復雜的代謝紊亂疾病，其特征是由胰島素分泌不足或胰島素作用受損而導致血糖水平較高[1]。截至2021 年，全球成人糖尿病患者人數(shù)已達到5.37 億，其中90%以上屬于Ⅱ型糖尿?。═2DM）[2]。在健康人體內(nèi)，胰島素幫助細胞從血液中吸收葡萄糖，以維持正常的血糖水平，而T2DM 患者的胰島素功能障礙阻止細胞對葡萄糖的吸收，導致高血糖癥狀的發(fā)生。

α-葡萄糖苷酶抑制劑和腸上皮細胞鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白（SGLT1）抑制劑均可用于治療T2DM[1]。葡萄糖苷酶抑制劑通過減緩小腸中碳水化合物的消化而延緩餐后血糖水平上升，對餐后血糖水平難以控制的患者更有效[3]。然而，患者對這類藥物有嚴重的不良反應，如胃腸道氣脹、腹瀉、腸壁囊腫和低血糖等[4]。因此，開發(fā)更有效的生物活性劑作為合成藥物的替代品，預防和治療T2DM 至關(guān)重要。

Zhang 等[5]通過通過液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析、虛擬篩選和鑒定合成，從山茶籽餅蛋白中制備具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性肽（LLVLYYEY和LLLLPSYSEF），IC50值分別為 0.33 和 1.11 mmol/L。綠茶，白茶和葡萄茶籽，鳳凰丹叢茶以及紅茶中提取的肽均可對T2DM 型糖尿病α-葡萄糖苷酶具有抑制潛力[6-8]。經(jīng)過酶解處理后產(chǎn)生的肽段，如綠茶和烏龍茶在堿性酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下，可以產(chǎn)生具有抗氧化和抗菌活性的肽段[9-10]。茶渣蛋白中也獲得了抗菌肽、抗氧化肽、降血脂肽和具有ACE 抑制活性的茶多肽[11-14]。目前生物信息學技術(shù)已廣泛應用于抗菌肽、抗氧化肽、肽激素、肽藥物等領(lǐng)域。然而，關(guān)于茶葉蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的分子對接和活性預測方面的信息仍然有限。α-葡萄糖苷酶抑制肽的信息較少[15-17]。本研究采用響應面法優(yōu)化茶葉酶解產(chǎn)物制備工藝，結(jié)合親和超濾-液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學技術(shù)，篩選出具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的茶多肽，旨在為治療糖尿病的肽段開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樹鮮葉（平陽特早） 采自陜西省西鄉(xiāng)縣東裕茶園；α-葡萄糖苷酶（10 萬U/mg） 美國Sigma 有限公司；乙腈（色譜純） 天津科密歐化工有限公司；磷酸氫二鉀（分析純） 天津晶科化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）、三氟乙酸（分析純） 天津大茂化工有限公司；堿性蛋白酶（20 萬U/g） 河南美羅實業(yè)有限公司；對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖 分析純，南京都萊生物技術(shù)有限公司；乙腈（質(zhì)譜級） 美國費雪化學有限公司；甲酸、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺 質(zhì)譜級，美國西格瑪奧德里奇有限公司。

FA2104 分析天平 上海恒平科技有限公司；Multifuge-X3R 高速冷凍離心機 美國熱電科技有限公司；DK-98-ⅡA 恒溫水浴鍋 天津泰斯特有限公司；1260 高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司；Ultimate 3000 毛細管高效液相色譜儀、Q Exactive?Hybrid Quadrupole-Orbitrap? Mass Spectrometer 電噴霧-組合型離子阱Orbitrap 質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗茶多肽的制備工藝 稱取茶葉粉末，按照40:1（mL/g）的液料比加入蒸餾水，90 ℃提取40 min，過濾，棄去提取液。取茶葉渣烘干后，按照一定液料比加入蒸餾水，用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 為8.5，加入2%堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)溫度酶解一定時間，結(jié)束后于沸水浴中滅酶，冷卻至室溫，用0.1 mol/L HCl將提取液pH 調(diào)整為7，8000 r/min 離心15 min，取上清液冷凍干燥，備用。

1.2.2 單因素實驗 固定液料比為30:1（mL/g），分別在45、50、55、60、65 ℃提取3 h，考察提取溫度對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響；固定液料比為30:1（mL/g），提取溫度55 ℃，提取時間分別為1.5、2.0、2.5、3、3.5 h 的條件下，考察時間對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響；固定提取溫度55 ℃，提取時間3 h，考察液料比分別為5:1、10:1、20:1、30:1、40:1（g/mL）的條件下，對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C）三個因素為自變量，以茶葉酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制率（αglucosidase inhibition rate，GIR）為響應值，使用Design-Expert 8.0 軟件中Box-Behnken 進行三因素三水平響應面設(shè)計，因素水平編碼表見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface experiments

1.2.4 粗茶多肽GIR 測定 GIR 的測定參照Wu等[18]的方法，并做適當修改。將響應面法得到的粗茶多肽制備成5 mg/mL 的樣品溶液，與α-葡萄糖苷酶（10 U/mL）和10 mmol/L PBS（pH6.8）緩沖液按照1:1:4（v:v:v）混勻，37 ℃水浴5 min；加入與樣品溶液等體積的pNPG（1 mmol/L）37 ℃水浴5 min，加入1 mL 0.2 mmol/L Na2CO3溶液中止反應，冷卻至室溫后，405 nm 測定吸光值。阿卡波糖溶液作為陽性對照，計算公式如下：

其中，A 為樣品組的吸光值；A0為空白組的吸光值。

1.2.5 超濾親和法分離α-葡萄糖苷酶抑制肽組分參考Chen 等[19]的研究，采用超濾親和法分離α-葡萄糖苷酶抑制肽。取100 μL 2 mg/mL 粗茶多肽溶液與200 μL 10 U/mLα-葡萄糖苷酶，37 ℃攪拌30 min使其混合，30 kDa 超濾離心，10000 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀加入200 μL 50%乙腈，將結(jié)合后的多肽溶解，10000 r/min 離心10 min，取上清，冷凍干燥，得到α-葡萄糖苷酶的抑制肽組分，使用HPLCMS/MS 系統(tǒng)分析。

1.2.6 HPLC-MS/MS 分析條件 采用HPLC-MS/MS對分離的α-葡萄糖苷酶抑制肽進行序列測定。HPLC條件為：色譜柱Acclaim Pe C18（150 μm×150 mm，1.9 μm）；柱溫25 ℃；A 相（0.1%甲酸），B 相（80%乙腈），流速為0.6 mL/min，進樣量10 μL。電噴霧質(zhì)譜條件：正離子電離模式，掃描范圍m/z100～1500 Da，毛細管電壓2 kV，ESI+離子源溫度320 ℃，碰撞氣為氮氣。一級質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：分辨率70000（FWHM）；自動增益控制（AGC）目標值3×106；最大注射時間100 ms；掃描范圍為100～1500 m/z。二級質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：分辨率75000（FWHM）；AGC 目標值1×105；最大注射時間50 ms；選擇前20 個離子進行碎裂；碰撞能量值28。質(zhì)譜原始文件使用Byonic 蛋白質(zhì)組學分析軟件，檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，得到氨基酸序列。

1.2.7 分離后肽段GIR 測定 將分離后不同分子量區(qū)間的多肽樣品冷凍干燥后，用PBS 配制成5 mg/mL的樣品溶液，同“1.2.4”項下方法測定GIR。將阿卡波糖、LIGF 和EFGAF 用PBS 分別配制成1、2、3、5 mg/mL 的樣品溶液，同“1.2.4”項下方法測定GIR。

1.2.8 生物活性及理化性質(zhì)預測 使用多種生物信息學工具對肽段進行性質(zhì)預測和評估。首先采用Peptide Ranker 對肽段的一級結(jié)構(gòu)進行分析，預測其穩(wěn)定性[20]，其次使用ToxinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）、Innovagen（https://www.innovagen.com/service/peptide-property-calculator）和Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）等在線工具，預測肽段的潛在毒性、水溶性、等電點和穩(wěn)定性[19]。最后，使用ADMETLab 2.0（http://admet.scbdd.com）服務平臺，對肽段在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等性質(zhì)進行模擬評價[21]。

1.2.9 分子對接 在PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫中選取α-葡萄糖苷酶晶體蛋白（PDB ID: 3AJ7）[2]。使用Autodock軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，并定義活性位點。進行多肽與葡萄糖苷酶的分子對接，并根據(jù)幾何和能量匹配做出評價分析[22]。采用Consensus score 對多肽-酶的結(jié)合模型進行打分排序，以篩選出最佳結(jié)合模型。最后使用PyMOL 軟件對最佳結(jié)合模型進行作圖，以便更好地觀察和分析結(jié)合情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗設(shè)置3 次平行測定，實驗結(jié)果表示為平均值±標準差。使用IBM SPSS Statistics 進行數(shù)顯著性分析，采用GraphPad Prism 9.4 進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

考察了茶葉酶解產(chǎn)物制備工藝中提取溫度、提取時間和料液比對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 提取溫度、提取時間和液料比對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature, extraction time and solvent-to-substrate ratio on the inhibition rate of α-glucosidase

圖1A 可知，酶解溫度在50 和55 ℃時，產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為52.13%和52.54%，溫度降低或升高會顯著降低產(chǎn)物活性，這可能是由于溫度過低使反應不完全，溫度過高導致蛋白酶變性和失活[23]。因此，酶解溫度選擇為50、55、60 ℃。

在圖1B 中可見，隨著時間的延長，酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制率逐漸升高，在3 h 時達到最高50.51%，超過3 h 后，產(chǎn)物活性開始下降，說明提取時間過長，茶渣底物的濃度會降低，這可能會影響酶促反應，導致反應速率下降，降低產(chǎn)品活性[24]，所以時間選擇2.5、3 和3.5 h。如圖1C 所示，當液料比為20:1，產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為50.06%，但在20:1～40:1（g/mL）之間，產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制率變化并不顯著。但當液料比為40:1（g/mL）時，可能因為酶的相對濃度降低導致產(chǎn)物酶解效率和活性較低[24]，因此選擇10:1，20:1 和30:1（g/mL）進行響應面試驗。

2.2 響應面結(jié)果分析

通過響應面法對茶葉酶解產(chǎn)物制備工藝進行優(yōu)化，共進行了17 組實驗，結(jié)果見2。

從表2 可知，以α-葡萄糖苷酶的抑制率為響應值，回歸分析得到二次回歸方程：Y=50.83-10.25A-1.48B-0.48C-0.17AB+0.57AC+1.48BC-5.64A2-10.57B2+0.60C2。對方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 茶葉酶解產(chǎn)物制備工藝的響應面試驗結(jié)果Table 2 Response surface experimental results for tea peptide preparation process

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression models

由表3 可知，模型P＜0.0001，回歸模型極其顯著；失擬項P=0.9585，不顯著，決定系數(shù)R2=0.9949，預測值R2=0.9883 與調(diào)整后的R2差值小于0.2，說明模型擬合程度良好，能夠較準確地預測和分析實際情況。模型的一次項A、B，二次項A2、B2對響應值的影響極其顯著（P＜0.01）；交互項AB 對響應值的影響顯著（P＜0.05）；影響茶多肽提取的因素的作用順序為A＞B＞C，即酶解溫度＞提取時間＞液料比。

響應面法預測粗茶葉酶解產(chǎn)物的最佳制備工藝為：酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，液料比15:1（mL/g），對α-葡萄糖苷酶抑制率為58.2%。實際實驗組中最佳工藝為酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，液料比10:1（mL/g），酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶抑制率為57.41%。為檢驗該模型的可靠性，根據(jù)優(yōu)化所得到最佳條件，開展3 組驗證實驗，得到對α-葡萄糖苷酶抑制率為56.82%±2.27%，與預測值無顯著差異。

2.3 肽段分子量的篩選

經(jīng)超濾親和分離-液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分離并鑒定，得到624 條分子量在400～2800 Da 的肽段。圖2展示了茶葉酶解產(chǎn)物中肽段分子量和對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。這些肽段主要為低聚肽，其中266 條肽段的分子量為800～1200 Da，平均分子量為988 Da，占總肽段的42.63%，其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性為67.04%。有157 條400～800 Da 的肽段，平均分子量為670 Da，抑制率顯著降低至45.86%（P＜0.05）。1600～2000 和2000～2800 Da 肽段，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性分別為9.84%和3.04%。因此，400～800 Da 的肽段具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖2 茶葉酶解產(chǎn)物中肽段分子量分布（A）及其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性（B）Fig.2 Peptide segments in the tea leaf enzymatic hydrolysis products molecular weight distribution (A) and its inhibition activity on α-glucosidase (B)

2.4 生物活性及理化性質(zhì)評估

結(jié)合分子量小于800 Da 和氨基酸殘基小于7個的生物活性肽篩選標準[25]，選擇具有較強α-葡萄糖苷酶抑制活性的低聚肽（400～800 Da）進行生物信息學虛擬篩選。使用Peptide Ranker 預測，結(jié)果顯示可能具有生物活性的肽段為35 條。采用Toxinpred和Innovagen 在線工具判斷35 條肽段的毒性、溶解性、等電點和穩(wěn)定性，結(jié)果顯示所有肽段均無毒，但僅有9 條肽段水溶性較好。根據(jù)Expasy 預測，篩選出6 條肽段穩(wěn)定性指數(shù)數(shù)小于40 且等電點在0.7～4.9 之間的肽段，該性質(zhì)肽段有助于多肽酶抑制劑的活性和穩(wěn)定性[26-27]。

采用ADMET 服務平臺評估6 條肽段的人體胃腸道吸收（HIA）和血腦屏障穿透（BBB）等特性[28]。結(jié)果表明，6 條肽段的BBB 特性、腸道穩(wěn)定性都較好，均不是CYP4503A4 酶的抑制劑。這表明這些多肽具有穿過血腦屏障的能力，在通過腸道吸收后，不會被代謝酶CYP4503A4 降解，能夠保持穩(wěn)定性，也不會干擾其他藥物的代謝。結(jié)合HIA 和30%口服利用度分析，選擇表現(xiàn)優(yōu)秀的兩個茶肽LIGF 和EPDAF進行分子對接。

2.5 質(zhì)譜分析

一級質(zhì)譜確定肽段LIGF 和EFGAF 的相對分子質(zhì)量分別為448.28 和569.26。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫查詢，兩個肽段分別來源于山茶（Camellia sinensis）Spatacsin_C （UniProtKB:A0A7J7I5Q8）和Peptidase_S8（UniProtKB:A0A7J7HMN5）的結(jié)構(gòu)域蛋白，分別由基因HYC85_001559 和HYC85_011168 編碼。

二級質(zhì)譜圖提供肽段的碎片離子質(zhì)荷比（m/z），完整肽段在質(zhì)譜中從肽鍵位置被打碎為碎片離子，靠近肽段N 端的為b 離子，靠近C 端的為y 離子。圖3A通過b 離子（m/z 113.09，227.18，284.20）和y 離子（m/z 166.09，223.10，336.19），確定肽段序列為LIGF（Leu-IIe-Gly-Phe）。圖3B 通過b 離子（m/z 130.05，227.12，342.13，413.17）和y 離子（m/z 166.09，237.12），確定肽段序列為EFGAF（Glu-Phe-Gly-Ala-Phe）。

圖3 肽段的二級質(zhì)譜圖（A）LIGF（B）EFGAFFig.3 Secondary mass spectrometry (A) LIGF (B) EFGAF

2.6 配體與受體的分子對接

采用分子對接技術(shù)構(gòu)建兩種茶肽配體與α-葡萄糖苷酶蛋白受體的結(jié)合模型，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 肽段與α-葡萄糖苷酶分子對接模型Fig.4 Molecular docking model of peptides with α-glucosidase

圖4A 展示了配體LIGF 與α-葡萄糖苷酶受體對接后的復合物整體外部構(gòu)象。在圖4a 中，結(jié)合多肽N 端的苯丙氨酸（F）與α-葡萄糖苷酶上的Pro-488 和Lys-568 殘基形成2 個氫鍵，亮氨酸（L）與Glu-570 殘基形成3 個氫鍵。該對接結(jié)果的Dockingscore 為-3.51 kJ。圖4B 展示了配體EPDAF 與α-葡萄糖苷酶受體對接后的復合物整體外部構(gòu)象。在圖4b 中，復合物多肽N 端谷氨酸（E）與α-葡萄糖苷酶的Asn-401 殘基形成1 個氫鍵。該對接結(jié)果的Dockingscore 為-1.31 kJ。通過對比對接結(jié)果可知，LIGF 序列形成的氫鍵較多，與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的能力更強，能夠形成更加穩(wěn)定的復合體[25,29]。

2.7 茶肽對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

圖5 展示了茶肽和阿卡波糖在不同濃度下對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。結(jié)果顯示LIGF 對α-葡萄糖苷酶的最大抑制率為88.13%，比阿卡波糖的最大抑制率高19.59%。阿卡波糖、LIGF 和EFGAF 的IC50值分別為0.98、1.22 和4.10 mg/mL。當濃度高于2 mg/mL 時，LIGF 對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于阿卡波糖，這表明在一定濃度范圍內(nèi)，LIGF 具有比阿卡波糖更強的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

圖5 茶肽對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.5 Inhibition of α-glucosidase by tea polypeptides

3 結(jié)論

本研究采用響應面法確定了茶葉酶解產(chǎn)物的最佳制備工藝。結(jié)果表明，堿性蛋白酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，液料比10:1（g/mL）條件下，酶解液對α-葡萄糖苷酶抑制率為57.61%。經(jīng)超濾親和分離-液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分離并鑒定，得到624 條分子量在400～2800 Da 的肽段。選擇具有較強α-葡萄糖苷酶抑制活性的低聚肽（400～800 Da）進行生物信息學虛擬篩選，得到茶肽LIGF 和EPDAF。5 mg/mL LIGF對α-葡萄糖苷酶的最大抑制率為88.13%，比阿卡波糖的最大抑制率高19.59%，IC50值為1.22 mg/mL。分子對接分析顯示，LIGF（亮氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸）與α-葡萄糖苷酶能形成5 個氫鍵，結(jié)合能為-3.51 kJ，具有高的親和力、穩(wěn)定性、以及與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的能力。LIGF 具有成為Ⅱ型糖尿病治療藥物的潛在價值。