龍牙百合多糖的超聲輔助提取及其抗氧化、降血脂活性分析

王威振，楊盼盼 ，遆永瑞，唐玉超，徐雷鋒，吳學(xué)尉, ，宋子涵 ，明 軍

（1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南昆明 650091；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

百合通常指百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物，百合屬中真正中文名稱為“百合”的種是指Lilium browniivar.viridulum，也被稱為龍牙百合[1]。百合廣泛分布于北半球，是非常重要的高檔蔬菜、藥材，也是世界4 大切花之一。同時(shí)它也是中國(guó)衛(wèi)生部審批通過(guò)的首批藥食同源植物之一，具有確定醫(yī)藥療效，而且還具有很高的食用、觀賞價(jià)值[2-3]。百合中含有豐富的多糖、多酚、黃酮和皂苷等活性成分，多糖是主要活性功能成分之一[4]，具有抗氧化、降血糖、降血脂等多種生理活性功能作用[5]。

近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖成為一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題，而營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩成為肥胖的重要誘因[6]。飲食中的脂肪攝入量經(jīng)常被認(rèn)為是肥胖的增加的罪魁禍?zhǔn)?，且膳食脂肪攝入量與肥胖呈正相關(guān)[7]。在人體消化系統(tǒng)中膳食脂肪的消化主要依靠胰腺脂肪酶（human pancreatic lipase，HPL），如果可以抑制胰脂肪酶就可以減少脂肪吸收，從而控制和治療肥胖[8]。目前市場(chǎng)上應(yīng)用的胰脂肪酶抑制劑類(lèi)減肥產(chǎn)品主要是奧利司他[9-10]。盡管奧利司他具有良好的減肥作用，但會(huì)引起一些較為嚴(yán)重的副作用，如腹瀉、腹脹、油性糞便、大便緊急感，以及一些對(duì)肝臟的負(fù)面影響[11-13]。因此，探尋一種天然的、安全有效的藥食同源類(lèi)降脂產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。李鑫鑫等[14]檢測(cè)了12 種植物粗多糖對(duì)胰脂肪酶抑制率，均具有一定的抑制效果，同時(shí)多具有良好的抗氧化活性，而龍牙百合多糖在降血脂抗肥胖方面鮮見(jiàn)報(bào)道。

百合多糖提取方法主要有熱水浸提法、超聲法、微波輔助法、高壓法和酶法等，而不同的提取方法會(huì)影響多糖的得率、結(jié)構(gòu)和生物活性[15-17]。王榮琨等[18]比較了超聲輔助提取、壓力輔助提取法和不同pH 水浸提法所得竹蓀純多糖的提取率，其中超聲提取法提取率最高，且其抗氧化活性最強(qiáng)。馬高興等[19]采用熱水浸提法和超聲提取法提取杏鮑菇多糖測(cè)定了其免疫活性，結(jié)果表明超聲提取杏鮑菇多糖具有更高的免疫活性。

目前在百合多糖的報(bào)道中，主要對(duì)卷丹和蘭州百合多糖提取工藝及功能研究較多，而針對(duì)龍牙百合多糖提取工藝優(yōu)化及其多糖的結(jié)構(gòu)功能鮮有報(bào)道。超聲輔助提取能有效提高百合多糖得率，且所得多糖可能具有較高的生物活性。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究了超聲輔助提取龍牙百合多糖的最佳工藝參數(shù)和初步分離純化方法，并以純化的多糖進(jìn)行抗氧化、降血脂功效初步驗(yàn)證，以期為龍牙百合的深加工和新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍牙百合 8 月份采收自湖南隆回，將其鱗片洗凈，60 ℃烘干至恒重，破壁機(jī)打粉過(guò)100 目篩網(wǎng)，置于干燥器中常溫保存?zhèn)溆茫籒aOH、硫酸、苯酚 北京化工廠有限責(zé)任公司；無(wú)水葡萄糖 山東齊魯生物科技有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)、D-半乳糖醛酸、蒽酮、橄欖油、VC源葉生物科技有限公司；DPPH 試劑盒、ABTS 試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；酚酞 上海凜恩科技發(fā)展有限公司；奧利司他 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司；胰脂肪酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙二醇4000 日本青木工貿(mào)株式會(huì)社；無(wú)水乙醇 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀 北京化學(xué)試劑公司；十二水合磷酸氫二鈉 西隴化工股份有限公司；正丁醇國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Pilot2-4M 型真空冷凍干燥機(jī) 博醫(yī)康（北京）儀器有限公司；WFZ UV-2802PC 型紫外分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；BSM-220.4 型電子天平 上海卓精電子科技有限公司；JBT/C-YCL 600T/3P（D）型超聲波藥品處理機(jī) 濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州越新儀器制造有限公司；DHG-9143BS-III 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；H4-20K 型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；THD-200D 型臺(tái)式恒溫振蕩器 北京天林恒泰科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍牙百合粗多糖的提取工藝 取龍牙百合粉3.00 g，按照單因素實(shí)驗(yàn)條件超聲輔助提取，提取結(jié)束后多糖液用70%乙醇溶液過(guò)夜醇沉，6000 r/min離心10 min 棄去上清液得到沉淀，室溫酒精揮發(fā)1 h后放入烘箱中60 ℃烘干至恒重，稱重，重復(fù)3 次。按照公式（1）計(jì)算多糖得率。

式中：A：多糖得率；m1：粗多糖質(zhì)量，g；m2：原料質(zhì)量，g。

1.2.2 水溶性粗多糖超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取龍牙百合粉3.00 g，將蒸餾水按照料液比1:10、1:15、1:20、1:25 和1:30 g/mL 的比例加入錐形瓶中，攪拌均勻后在提取溫度55 ℃，提取時(shí)間20 min，超聲功率400 W 條件下進(jìn)行多糖提取，每個(gè)料液比梯度3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率影響 準(zhǔn)確稱取龍牙百合粉3.00 g，選取提取時(shí)間5、10、15、20 和25 min，在料液比1:10 g/mL，提取溫度55 ℃，超聲功率400 W條件下進(jìn)行多糖提取，每個(gè)時(shí)間梯度3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3 浸提溫度對(duì)多糖得率影響 準(zhǔn)確稱取龍牙百合粉3.00 g，選取提取溫度35、45、55、65 和75 ℃，在料液比1:10 g/mL，提取時(shí)間20 min，超聲功率400 W 條件下進(jìn)行多糖提取，每個(gè)溫度梯度3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 水溶性粗多糖提取的正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上以料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度為因素，每個(gè)因素取3 個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal arraydesign

1.2.4 龍牙百合粗多糖除蛋白純化 將制備好的龍牙百合粗多糖10.00 g 以1:60 g/mL 的料液比加入蒸餾水于60 ℃水浴鍋匯中攪拌充分溶解，將多糖溶液用1%的醋酸調(diào)節(jié)pH 至6.4，加入木瓜蛋白酶于60 ℃水浴鍋酶解3 h。冷卻至室溫后，6000 r/min 條件離心3 min，收集上清液。在上清液中加入1/2 體積Sevag 試劑（氯仿:正丁醇3:1），劇烈振蕩40 min，6000 r/min 離心5 min 除蛋白層，吸取上清，重復(fù)進(jìn)行Sevage 去蛋白操作，直至無(wú)法去除蛋白層。除蛋白后樣液用5000 d 透析袋透析，流水透析1 d，純水1 d，透析液用3 倍體積無(wú)水乙醇醇沉，4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。6000 r/min 離心5 min 分離沉淀，分別用丙酮，乙醚洗滌2 遍，真空冷凍干燥得純化多糖[20-22]。

1.2.5 多糖成分測(cè)定分析

1.2.5.1 基本成分測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[23]；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用咔唑-硫酸比色法測(cè)量糖醛酸含量[21]；以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[24]。

1.2.5.2 百合多糖紅外光譜分析 采用傅里葉紅外色譜法，稱取1.00 mg 完全干燥的多糖樣品，與100 mg完全干燥的KBr 粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，后壓片，用傅里葉變換紅外色譜儀FT-IR 進(jìn)行紅外掃描，掃描范圍 4000～400 cm-1。

1.2.6 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 ABTS+自由基清除率測(cè)定 配制多糖樣品溶液（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/mL）。使用ABTS+自由基試劑盒進(jìn)行測(cè)定，在734 nm 測(cè)吸光值，VC為對(duì)照。

式中：A空白：空白對(duì)照吸光度；A測(cè)定：樣品溶液吸光度。

1.2.6.2 DPPH 自由基清除率測(cè)定 配制多糖樣品溶液（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/mL）。使用DPPH 自由基試劑盒進(jìn)行測(cè)定，在避光反應(yīng)20 min后6000 r/min 離心1 min 取上清在517 nm 處測(cè)定吸光度，VC為對(duì)照。計(jì)算公式如下：

式中：A空白：空白對(duì)照吸光度；A測(cè)定：樣品溶液吸光度。

1.2.7 胰脂肪酶抑制率測(cè)定 胰脂肪酶測(cè)定參考何執(zhí)中等[25]的方法略作改動(dòng)。取若干錐形瓶，加入5 ml pH 為7.5 的0.025 mol/L 的磷酸緩沖液，將其和橄欖油乳化液于40 ℃預(yù)熱5 min，劇烈振蕩乳化液，取乳化液4 mL 加入錐形瓶，加入1 mL 0.02 g/mL胰脂肪酶，加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，繼續(xù)保溫5 min。取出后立即加入95%乙醇15 mL，終止酶反應(yīng)。加入3 滴酚酞指示劑，用0.0025 mol/L 氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色為止，記錄氫氧化鈉消耗量?？瞻捉M脂肪酶替換1 mL 蒸餾水。奧利司他做陽(yáng)性對(duì)照。

式中：A：平行組消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積，mL；B：空白試驗(yàn)消耗氫氧化鈉的體積，mL；M：氫氧化鈉滴定的摩爾濃度，mol/L；W：脂肪酶的取樣量，g；T 為反應(yīng)時(shí)間，min。

胰脂肪酶抑制活性測(cè)定：預(yù)熱完畢后，向測(cè)定組和對(duì)照組加入抑制劑1 mL，再向測(cè)定組加1 mL 脂肪酶，對(duì)照組加1 mL 蒸餾水，反應(yīng)5 min，操作同胰脂肪酶抑制率測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定指標(biāo)均作3 次平行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPASS Statistics 26 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)分析采用Origin 9.2 軟件進(jìn)行分析。方差分析采用（one-way AVONA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取龍牙百合粗多糖

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 從圖1a 中可以看出，其他條件一致的情況下，在料液比1:10 到1:20 g/mL 時(shí)，龍牙百合粗多糖得率隨著料液比的增大略有下降。當(dāng)料液比是1:25 g/mL 時(shí)，粗多糖得率達(dá)到最大值9.21%，這可能是隨著溶劑用量增大，植物內(nèi)部細(xì)胞與外部溶劑充分接觸，有利于多糖物質(zhì)快速溶出[26]。當(dāng)料液比為1:30 g/mL 時(shí)，多糖得率開(kāi)始下降，這是因?yàn)殡S著溶劑的增多，多糖溶量達(dá)到飽和，水溶劑與植物內(nèi)部物質(zhì)分子相互作用可能已經(jīng)減弱[27]，水溶劑用量過(guò)大使得后面處理過(guò)程中多糖損失增大，多糖得率反而下降[28]。因此，料液比選擇1:25 g/mL。

圖1 料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of material-to-water ratio, time and temperature on the yield of polysaccharide

從圖1b 中可以看出，其他條件一致的情況下，在5 到20 min 時(shí)龍牙百合粗多糖得率隨著浸提時(shí)間的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在20 min 的時(shí)候多糖得率達(dá)到最大值8.95%。當(dāng)浸提時(shí)間為25 min 時(shí)，多糖得率明顯下降，這可能是由于超聲具有強(qiáng)剪切作用，使大分子多糖糖苷鍵斷裂[29]，過(guò)長(zhǎng)的浸提時(shí)間導(dǎo)致?lián)p失變大。因此，適宜超聲提取時(shí)間在20 min。

從圖1c 中可以看出，其他條件一致的情況下，在35 到45 ℃時(shí)龍牙百合粗多糖的得率隨著浸提溫度升高而明顯提高，在45 到65 ℃時(shí)龍牙百合粗多糖得率平緩上升，當(dāng)浸提溫度為65 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值9.18%。當(dāng)溫度為75 ℃時(shí)，多糖得率呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，一方面可能是溫度過(guò)高使得多糖降解[30]，另一方面，是溫度過(guò)高使得其他物質(zhì)溶出，增加了溶液的粘稠度，阻礙了多糖溶出[31]。因此，浸提溫度選擇65 ℃。

2.1.2 正交試驗(yàn)提取優(yōu)化 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，以料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度為影響因素，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2 可以看出，各因素對(duì)龍牙百合粗多糖提取得率影響主次順序?yàn)镃（浸提溫度）＞B（浸提時(shí)間）＞A（料液比），即影響得率的最大因素是浸提溫度，其次是浸提時(shí)間，料液比影響較小。這與余倩莎等[32]熱水浸提法的研究結(jié)果：提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間不同，可能是在超聲的作用下，多糖在溶劑較少時(shí)也能充分析出，使得料液比的影響變小。龍牙百合粗多糖提取的最佳工藝組合為A2B3C3，即料液比1:20，提取時(shí)間20 min，浸提溫度75 ℃。以此條件進(jìn)行試驗(yàn)，粗多糖得率達(dá)11.98%，轉(zhuǎn)化為多糖提取率后為7.00%。這在結(jié)果上比余倩莎等[32]使用熱水浸提法優(yōu)化后工藝：提取溫度60 ℃，料液比1:5 g/mL，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)5 次，提取龍牙百合多糖提取率6.27%要高，且超聲輔助提取明顯比熱水浸提法效率也更高。因此選擇料液比1:20 g/mL，浸提時(shí)間20 min，浸提溫度75 ℃為龍牙百合粗多糖最佳提取工藝。

2.2 龍牙百合多糖結(jié)構(gòu)特性分析

2.2.1 化學(xué)組成 龍牙百合粗多糖及去蛋白多糖化學(xué)組成如表3 所示。龍牙百合粗多糖的總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量分別為58.46%、8.06%和10.85%，去蛋白后總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量分別為84.78%，15.41%和4.73%，較陳小蒙等[21]采用相同方法的蛋白脫除率低，這可能是在具體脫除蛋白過(guò)程中Sevege試劑組成成分比例不同。

表3 龍牙百合多糖化學(xué)組成Table 3 Chemical composition of Lilium brownii var.viridulum polysaccharides

2.2.2 紅外光譜分析 龍牙百合多糖的傅里葉紅外光譜圖見(jiàn)圖2。吸收光譜在3392.78 和2927.46 cm-1處有強(qiáng)且寬的的吸收峰，是多糖上的O-H 形成分子間、內(nèi)氫鍵和C-H 伸縮振動(dòng)的信號(hào)[33]；1649.44 和1421 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別是由C=O彎曲震動(dòng)和C-H 彎曲震動(dòng)引起，表明多糖為酸性多糖[34]，這與化學(xué)組成測(cè)定中存在糖醛酸相符；在1377～1240 cm-1處吸收峰由糖的C-H 變角震動(dòng)引起，它和C-H 鍵的伸縮振動(dòng)構(gòu)成了糖類(lèi)的特征吸收峰[21]；1249.23 cm-1附近的吸收峰應(yīng)為磺酸基的S=O 伸縮震動(dòng)峰，證明了多糖組分中有S 元素的存在，表明多糖中可能有硫酸根。1154.77、1026.36 cm-1兩個(gè)峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，是其糖苷鍵C-O-C 的非對(duì)稱振動(dòng)峰，是葡聚糖典型的紅外光譜信號(hào)[35]；紅外光譜在890 cm-1附近無(wú)吸收峰，而在807.68 cm-1附近形成峰表明多糖主要為α型糖苷鍵，且為吡喃己糖[36]，這與陳小蒙等[21]熱水提取法提取龍牙百合多糖研究結(jié)果一致。

圖2 龍牙去蛋白多糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FIIR spectrum of refined polysaccharides from Lilium brownii var. viridulum

2.3 龍牙百合去蛋白多糖功能特性分析

2.3.1 抗氧化活性分析 由圖3a 可知，龍牙百合去蛋白多糖具有一定的DPPH 自由基清除作用，清除能力弱于陽(yáng)性對(duì)照VC。隨著多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH 自由基的清除能力逐漸強(qiáng)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)8.75%。龍牙百合去蛋白多糖在質(zhì)量濃度在10 mg/mL 時(shí)顯著低于李化強(qiáng)等對(duì)龍牙百合精制多糖和粗多糖對(duì)DPPH 自由基清除率的研究[37]，這可能是由于材料、超聲提取條件和純化程度差異造成的。

圖3 龍牙百合去蛋白多糖DPPH 和ABTS+自由基清除率測(cè)定Fig.3 Scavenging ability of refined polysaccharides from Lilium brownii var. viridulum against DPPH and ABTS+ radical

由圖3b 可知，龍牙百合去蛋白多糖具有良好的ABTS+自由基清除作用，清除能力弱于陽(yáng)性對(duì)照VC。隨著多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS+自由基的清除率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，其對(duì)ABTS+自由基清除率達(dá)38.59%。

2.3.2 龍牙百合去蛋白多糖對(duì)胰脂肪酶抑制作用由圖4 可知，陽(yáng)性對(duì)照奧利司他和龍牙百合去蛋白多糖隨著濃度的增加對(duì)胰脂肪酶的抑制率顯著增加，當(dāng)濃度大于2 mg/mL 時(shí)，龍牙百合去蛋白多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制效果好于奧利司他。當(dāng)龍牙百合去蛋白多糖濃度在5 mg/mL 時(shí)，對(duì)胰脂肪酶的抑制率可達(dá)到86.22%，優(yōu)于蓮子紅衣多糖和黑木耳等中藥多糖[38-39]。這說(shuō)明，龍牙百合去蛋白多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制效果較好，具有降血脂藥物替代潛力。

圖4 龍牙百合去蛋白多糖對(duì)胰脂肪酶抑制率測(cè)定Fig.4 Effect of refined polysaccharides from Lilium brownii var. viridulum on pancreatic lipase activity

3 結(jié)論

本文以龍牙百合制成的干粉為原料，在超聲輔助條件下選擇料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度進(jìn)行龍牙百合粗多糖制備單因素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)多糖制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得超聲輔助提取龍牙百合粗多糖的最佳提取工藝，為料液比1:20 g/mL，浸提時(shí)間20 min，浸提溫度75 ℃，該條件下的粗多糖得率為11.98%。去蛋白的龍牙百合多糖的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)含量分別為84.78%、15.41%和4.73%，表明龍牙百合多糖中含有中性糖較多，去蛋白效果良好。紅外光譜分析表明，龍牙百合多糖是一種酸性多糖。龍牙百合多糖具有一定的抗氧化能力和良好降血脂能力，對(duì)胰脂肪酶的抑制率高達(dá)86.22%，具有開(kāi)發(fā)降血脂食品藥品的潛力。研究結(jié)果為龍牙百合多糖開(kāi)發(fā)抗氧化、降血脂功能食品提供理論依據(jù)，而不同提取方法對(duì)多糖抗氧化活性影響和體內(nèi)降血脂活性需進(jìn)一步研究探討。